紫外分光光度法測(cè)定核苷酸含量PPT

1、1,實(shí)驗(yàn)二：核酸的紫外掃描及含量測(cè)定,2,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.了解紫外分光光度計(jì)的基本原理并掌握其使用方法。 2.掌握使用紫外分光光度法測(cè)定核酸含量的原理和方法,3,實(shí)驗(yàn)原理,核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵，具有紫外吸收。RNA和DNA的紫外吸收峰為260nm。一般在260 nm波長(zhǎng)下，每毫升含1mg DNA溶液的光吸收值約為0.020，每毫升含1mgRNA溶液的光吸收值為0.022。故測(cè)定待測(cè)濃度RNA或DNA溶液260nm的光吸收值即可計(jì)算出其中核酸的含量。此法操作簡(jiǎn)便，迅速。若樣品內(nèi)混雜有大量的核苷酸或蛋白質(zhì)等能吸收紫外光的物質(zhì)，則測(cè)定誤差較大，故應(yīng)設(shè)法事先除去。純凈的RNA溶液，其A2

2、60/A2802；純凈的DNA溶液，其A260/A2801.8,4,實(shí)驗(yàn)原理,如果已知待測(cè)的核酸樣品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可將樣品配制成一定濃度的溶液(2050mg/mL)，在紫外分光光度計(jì)上直接測(cè)定。 蛋白質(zhì)由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nm處，在260nm處的吸收值僅為核酸的十分之一或更低，故核酸樣品中蛋白質(zhì)含量較低時(shí)對(duì)核酸的紫外測(cè)定影響不大。 RNA在260nm與280nm處的吸收比值在2.0以上，DNA的比值則在1.9左右。當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)含量較高時(shí)，比值即下降,5,實(shí)驗(yàn)器材,1.UV-1000型紫外可見分光光度計(jì),6,操作指南：

3、 1. 打開儀器電源，系統(tǒng)自檢，并預(yù)熱20min。 2. 選擇“光度測(cè)量”，按“enter”進(jìn)入吸光度測(cè)量。 3. 關(guān)上暗盒蓋，將裝參比液的比色皿，推入光路中，按“enter”進(jìn)入后，系統(tǒng)自動(dòng)調(diào)整投射比為100%和0%。 4. 關(guān)上暗盒蓋，將裝參比液的比色皿，推入光路中，按“zero”鍵調(diào)使吸光度A為0.000。 5. 測(cè)量樣品。將被測(cè)溶液推入光路中，待讀數(shù)穩(wěn)定后，讀取吸光度。 6. 儀器使用完畢，取出比色皿，洗凈、晾干。 7. 關(guān)閉電源開關(guān)，拔下電源插頭，復(fù)原儀器。 8. 登記儀器使用記錄表,7,關(guān)于比色皿：比色皿的前后有2個(gè)光滑面，是用來對(duì)準(zhǔn)光路的，左右有2個(gè)粗糙面，手只能拿比色皿的粗糙面

4、，不能接觸光滑面。比色皿的內(nèi)部的清洗只能用蒸餾水潤洗（用洗瓶），不可用衛(wèi)生紙或其他物品捅進(jìn)去擦洗，比色皿的2個(gè)光滑面一定要保持清潔，如發(fā)現(xiàn)有指紋或殘液，須用衛(wèi)生紙輕輕擦拭干凈。比色皿是成套發(fā)放的，嚴(yán)禁混用，本實(shí)驗(yàn)使用的是石英比色皿。使用完畢后先用自來水內(nèi)外沖洗干凈比色皿，再用洗瓶沖洗比色皿的內(nèi)外表面1次，將其粗糙面朝下斜靠在培養(yǎng)皿中,8,2.取樣器：參見實(shí)驗(yàn)一，10uL、200uL各1支/組,使用指南：接好套頭（不漏氣）通過旋鈕調(diào)節(jié)容量（如500表示5mL）用活塞第一擋吸液用活塞第一擋和第二擋放液換套頭繼續(xù)使用。注意，平時(shí)取樣器應(yīng)掛在架子上，絕不可倒置，以免溶液倒流入槍體中而損壞儀器,9,3.其他器材：試管，試管架、燒杯、衛(wèi)生紙。 實(shí)驗(yàn)試劑 1. 蒸餾水 2. 待測(cè)的DNA溶液,10,樣品測(cè)定： 1. 取兩個(gè)比色皿，一個(gè)加蒸餾水做空白對(duì)照。一個(gè)用來加DNA樣品。 2. 取10uL的DNA樣品