分子診斷學(xué)：地中海貧血電泳及結(jié)果分析

1、地中海貧血基因檢測(cè) -地貧瓊脂糖凝膠電泳及結(jié)果分析,1 學(xué)習(xí)與掌握瓊脂糖凝膠電泳原理和方法。 2 利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和凝膠成像系統(tǒng)判斷地貧的基因類(lèi)型。,實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?原理,在pH值為8.0-8.3時(shí)，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸基團(tuán)全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)向正極移動(dòng)。 采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大的差異，從而能達(dá)到分離核酸片段檢測(cè)其大小的目的。 核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。,瓊脂糖是從海藻中提取的、由D-和 L-半乳糖殘基通過(guò)和糖苷鍵交替構(gòu)成的線(xiàn)狀聚合物。瓊脂糖鏈形

2、成螺旋纖維，然后再聚合成半徑為20-30nm的超螺旋結(jié)構(gòu)。,瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過(guò)瓊脂糖的最初濃度來(lái)控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。,原理,干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，加熱煮沸變?yōu)槌吻澹覝乩鋮s、凝聚，即成瓊脂糖凝膠。,凝膠濃度 DNA分子大小 DNA分子的構(gòu)象 緩沖液 電泳電壓,影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移率的因素,瓊脂糖濃度與線(xiàn)性DNA分離范圍參數(shù),相同大小的線(xiàn)狀 DNA片斷在不同濃度的瓊脂糖凝膠中遷移率不同.在一定濃度的瓊脂糖凝膠中，不同大小的DNA片段的遷移率也是不同的。 瓊脂糖濃度(%)分離范圍（kb） 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7

3、0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3,DNA分子的大小,雙鏈DNA分子在凝膠中遷移的速率與其堿基數(shù)的常用對(duì)數(shù)成反比。 分子越大，遷移越慢。一是摩擦阻力越大，二是大分子通過(guò)凝膠孔徑的效率低于較小的分子。,DNA的構(gòu)象,DNA的構(gòu)象,不同構(gòu)象DNA分子在電場(chǎng)中移動(dòng)的距離不同。具有相同分子量的線(xiàn)狀、開(kāi)環(huán)狀和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度不同。 遷移速度： 超螺旋的DNA線(xiàn)狀DNA 開(kāi)環(huán)DNA 。,緩沖液,DNA的泳動(dòng)受緩沖液的組成和離子強(qiáng)度的影響。 缺乏離子，電導(dǎo)率嚴(yán)重降低，電泳遷移率很慢；離子強(qiáng)度過(guò)高，電導(dǎo)率升高，極易產(chǎn)生大量的熱能，最嚴(yán)

4、重的結(jié)果是凝膠熔化，DNA變性 最常用的緩沖液是1TAE(Tris-醋酸-EDTA)和TBE(Tris-硼酸-EDTA)。,電泳電壓,低壓條件下，線(xiàn)狀DNA在瓊脂糖凝膠上泳動(dòng)速度和電壓成正比。隨著電壓升高，高分子量的DNA片段泳動(dòng)速度和電壓不成正比關(guān)系，分辨率下降了，因此為了得到良好的分離效果，電場(chǎng)電壓不宜超過(guò)5V/CM。,指示劑,常用的電泳上樣緩沖液含溴酚藍(lán)，有的還含有二甲苯青，這些指示劑可以指示電泳的速度，也可以利用其遷移率大致估計(jì)DNA的分子量，而與瓊脂糖濃度無(wú)關(guān)。 （本試劑已包含指示劑，電泳時(shí)無(wú)需另加）,染色,溴化乙淀（EB）是核酸的染色劑，能插入DNA分子中形成熒光結(jié)合物， EB在紫

5、外線(xiàn)照射下的發(fā)射熒光。熒光的強(qiáng)度與DNA的含量成正比，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置及估計(jì)出待測(cè)樣品的濃度 EB是強(qiáng)致癌劑. 今天采用的是廠家提供的替代染料,染色劑即可以在電泳前加入樣液，又可以電泳后再對(duì)凝膠染色,材料和設(shè)備,材料：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 設(shè)備：微量移液器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置，微波爐，凝膠成像系統(tǒng)等。,試劑準(zhǔn)備,1.TAE電泳緩沖液： 50X TAE 1X TAE ：取50TAE緩沖液20ml，加水至1000ml 2. DNA Marker標(biāo)準(zhǔn)分子量,電泳操作步驟,2、膠槽準(zhǔn)備 取出膠板和梳子，將膠板放入膠槽中; 將梳子垂直插入到膠槽的小凹槽內(nèi)，梳齒底端和板面有1mm的間

6、隙; 將膠槽放在調(diào)整好的水平臺(tái)上。,一、瓊脂糖凝膠的制備（示教視頻）,1 、電泳緩沖液準(zhǔn)備 取50TAE緩沖液20ml，加水至1000ml，配制成1TAE稀釋緩沖，待用。,電泳操作步驟,3、凝膠準(zhǔn)備 用1TAE配制1瓊脂糖凝膠。 稱(chēng)1g瓊脂糖置三角瓶中，加100ml 1TAE; 微波爐加熱大約3-5分鐘，熔化瓊脂糖; 熔化的瓊脂糖自然冷卻到5060時(shí)，輕輕混勻準(zhǔn)備鋪膠。 4、鋪膠：將冷卻致60的凝膠倒入準(zhǔn)備好的膠槽內(nèi)，凝膠厚度35mm,室溫下靜置半小時(shí)左右，凝膠固化。,5、輕輕拔出固定在凝膠中的梳子。將帶凝膠的膠板置于電泳槽中，并使樣品孔位于電場(chǎng)負(fù)極，向電泳槽中加入1TAE電泳緩沖液，越過(guò)凝膠

7、表面即可。,6、原梳齒處(樣品孔)即被緩沖液充滿(mǎn)，如發(fā)現(xiàn)有氣泡，應(yīng)設(shè)法去除。,電泳操作步驟,二 瓊脂糖凝膠電泳,1、加樣： 直接從PCR擴(kuò)增后的反應(yīng)管中取5l紅色液體加入電泳孔中，注意不要加到孔外； marker：5ul,2、電泳：蓋上電泳槽，接通電源，開(kāi)始電泳 開(kāi)始電泳前，再次確認(rèn)凝膠樣品孔處于電場(chǎng)的負(fù)極。 電泳條件：電壓120-130V；時(shí)間20-30分鐘左右,電泳操作步驟,分組實(shí)驗(yàn),1-4號(hào)第一個(gè)槽， 5-8號(hào)第二個(gè)槽 樣品 加樣孔,陽(yáng)性 1 2 marker 3 4 陰性 對(duì)照,陽(yáng)性 5 6 marker 7 8 陰性 對(duì)照,3、電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠,4、電泳結(jié)果分析： 紫外

8、檢測(cè)儀直接觀察電泳條帶 凝膠成像系統(tǒng)拍照 觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，判斷基因型。,電泳操作步驟,1 2 3 4 5 6 7 8,1 2 3 4 5 6 7 8,（- 3.7/-3.7） （-4.2/ -4.2） （- 3.7 / -SEA ) （-3.7/ -4.2） （- 4.2 / -SEA ) （ - - / - 4.2) （ - - / -3.7) （ - - /-SEA ),注意事項(xiàng),實(shí)驗(yàn)用具和溶液均有可能受到染料的污染，操作過(guò)程應(yīng)戴手套! 2 加樣時(shí)小心操作,槍頭伸入孔中緩慢加入，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。 3 本體系含有正常

9、對(duì)照條帶，無(wú)論有無(wú)發(fā)生缺失，每個(gè)樣本至少應(yīng)有一條電泳條帶，否則，提示擴(kuò)增失敗，應(yīng)重新檢測(cè),-地貧實(shí)驗(yàn)原理,考慮到四對(duì)引物要在同一管擴(kuò)增并通過(guò)電泳來(lái)判斷結(jié)果，設(shè)計(jì)引物位置時(shí)各PCR產(chǎn)物的條帶大小要有區(qū)別，最終-3.7、-4.2和SEA的擴(kuò)增條帶分別約為：2.0kbp、1.7kbp、1.4kbp和1.2kbp,電泳條帶與基因型的對(duì)應(yīng)關(guān)系,條帶大小 基因型基因型條帶大小 2.0 kb -3.71.4 kb-4.2 1.7 kb 1.2 kb-SEA,電泳條帶與基因型判斷,出現(xiàn)電泳條帶 基因型 1.7Kb (- /- ) 1.7Kb 2.0Kb (- / -3.7) 1.7Kb 1.4Kb (-/ -

10、4.2) 1.7Kb 1.2Kb (-/-SEA ) 2.0Kb 1.2Kb (-3.7 / -SEA ) 2.0Kb 1.4Kb （-3.7/ -4.2） 1.4Kb 1.2Kb (- 4.2 / -SEA ) 2.0Kb （- 3.7/- 3.7） 1.4 kb （-4.2/ -4.2） 1.2Kb （- SEA /- SEA ）。,地中海貧血的血液學(xué)表型特征 RBC 參數(shù) MCV MCH 細(xì)胞形態(tài)變化 Hb電泳分析 Hb A2 () 或 () Hb Barts Hb H () Hb E (),a地貧的基因型與表現(xiàn)型,正常,靜止型單一基因缺失或喪失功能 臨床無(wú)任何癥狀，一般血液學(xué)檢查無(wú)異樣，僅平均紅細(xì)胞體積(MCV) 位于正常值下限。,a地貧的基因型與表現(xiàn)型,血紅蛋白H病3個(gè)基因缺失或喪失功能 肝脾腫大，中度貧血。小細(xì)胞，低色素，HbH含 量較高，易發(fā)生溶血，有些病例需不定期輸血， 癥重者甚至需切除脾臟。,標(biāo)準(zhǔn)型2個(gè)基因缺失或喪失功能 臨床無(wú)癥狀，血液學(xué)檢查出現(xiàn)輕微貧血，紅細(xì)胞大小不均一，平均紅細(xì)胞體積(MCV) 及平均血紅蛋白含量(MCH)明顯偏低。,a地貧的基因型與表現(xiàn)型,Hb Barts 水腫胎兒綜合癥 4個(gè)基因缺失或喪失功能 患胎于妊娠晚期或產(chǎn)后數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡，全身水腫，肝脾腫大