第六章核酸的分離與純化

1、第六章 核酸的分離與純化第一節(jié) 核酸分離與純化的設(shè)計(jì)與原則細(xì)胞內(nèi)的核酸包括DNA與RNA兩種分子，均與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成脫氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）。其中真核生物的DNA又有染色體DNA與細(xì)胞器DNA之分。前者位于細(xì)胞核內(nèi)，約占95%，為雙鏈線性分子；后者存在于線粒體或葉綠體等細(xì)胞器內(nèi)，約占5%，為雙鏈環(huán)狀分子。除此之外，在原核生物中還有雙鏈環(huán)狀的質(zhì)粒DNA；在非細(xì)胞型的病毒顆粒內(nèi)，DNA的存在形式多種多樣，有雙鏈環(huán)狀、單鏈

2、環(huán)狀、雙鏈線狀和單鏈線狀之分。DNA分子的總長(zhǎng)度在不同生物間差異很大，一般隨生物的進(jìn)化程度而增長(zhǎng)。如人的DNA大約由3.0109個(gè)堿基對(duì)（base pair, bp）組成，與5243bp的猿猴病毒（simian virus 40, SV40）相比，其長(zhǎng)度約為后者的5.7105倍。相對(duì)來(lái)講，RNA分子比DNA分子要小得多。由于RNA的功能是多樣性的，RNA的種類(lèi)、大小和結(jié)構(gòu)都較DNA多樣化。DNA與RNA性質(zhì)上的差異決定了兩者的最適分離與純化的條件是不一樣的。一、 材料與方法的選擇（一）材料與方法的選擇臨床常見(jiàn)的標(biāo)本有血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等；核酸分離與純化的方法非常多，如何恰當(dāng)?shù)厥占?/p>

3、與準(zhǔn)備材料，選擇適宜的分離與純化方法是一個(gè)首要的問(wèn)題。首先我們應(yīng)當(dāng)明確核酸的分離與純化并不是最終的目的，不同的實(shí)驗(yàn)研究與應(yīng)用對(duì)核酸的產(chǎn)量、完整性、純度和濃度可能有不同的要求；至于分離與純化核酸所需的時(shí)間與成本也往往需要考慮；在不影響核酸質(zhì)量的情況下，應(yīng)選擇安全無(wú)毒的試劑與方案。近年來(lái)，有關(guān)試劑盒的開(kāi)發(fā)與自動(dòng)化儀器的使用，能批量制備核酸樣品，大大提高了分離與純化的效率。（二）選擇的原則核酸分離與純化的方法很多，應(yīng)根據(jù)具體生物材料的性質(zhì)與起始量、待分離核酸的性質(zhì)與用途而采取不同的方案。無(wú)論采取何種方法，都應(yīng)遵循總的原則：一是保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性，因?yàn)橥暾囊患?jí)結(jié)構(gòu)是核酸結(jié)構(gòu)和功能研究的最基本的

4、要求；二是盡量排除其它分子的污染，保證核酸樣品的純度，這是本章討論的主要內(nèi)容。（三）核酸完整性的保持為了保證核酸的完整性，在操作過(guò)程中，首先應(yīng)盡量避免各種有害因素對(duì)核酸的破壞。影響核酸完整性的因素很多，包括物理、化學(xué)與生物學(xué)的因素，其中有些是可以避免的。如過(guò)酸或過(guò)堿，對(duì)核酸鏈中的磷酸二酯鍵有破壞作用，在核酸的提取過(guò)程中，采用適宜的緩沖液，始終控制pH在410之間，就可以很好地避免其危害；另外如高溫加熱，除高溫本身對(duì)核酸分子中的化學(xué)鍵的破壞作用外，還可能因煮沸帶來(lái)液體剪切力，因此核酸提取常常在04的條件下進(jìn)行。其次對(duì)無(wú)法避免的有害因素，應(yīng)采取多種措施，盡量減輕各種有害因素對(duì)核酸的破壞。應(yīng)盡量簡(jiǎn)化

5、分離純化的步驟，縮短提取的時(shí)間，減輕各種有害因素對(duì)核酸完整性的破壞； DNA酶（DNase或DNAase）的激活需要Mg2+、Ca2+等二價(jià)金屬離子，若使用EDTA、檸檬酸鹽并在低溫條件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性。RNA酶（RNase或RNAase）的廣泛存在與不易失活的特點(diǎn)，決定了生物降解是RNA提取過(guò)程中的主要危害因素。二、 技術(shù)路線的設(shè)計(jì)（一）核酸的釋放正常情況下，無(wú)論是DNA還是RNA均位于細(xì)胞內(nèi)，因此核酸分離與純化的第一步就是破碎細(xì)胞、釋放核酸。細(xì)胞的破碎方法非常多，包括機(jī)械法與非機(jī)械法兩大類(lèi)。機(jī)械法又可分為液體剪切法與固體剪切法。機(jī)械剪切作用的主要危害對(duì)象是高分子量的線

6、性DNA分子，因此該類(lèi)方法不適合于染色體DNA的分離與純化。非機(jī)械法可分為干燥法與溶胞法，目前，大多采用溶胞法。其中采用適宜的化學(xué)試劑與酶裂解細(xì)胞的溶胞法因裂解效率高，方法溫和，能保證較高的得率與較好地保持核酸的完整性而得到了廣泛的應(yīng)用。（二）核酸的分離與純化細(xì)胞裂解物是含核酸分子的復(fù)雜混合物，核酸分子本身可能仍與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起。在保證核酸分子完整性的前提下，要從中分離出一定量的、符合純度要求的核酸分子，并不是一件很容易的事情，這需要我們?cè)趯?duì)核酸分子有關(guān)性質(zhì)的充分認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，利用核酸與其它物質(zhì)在一個(gè)或多個(gè)性質(zhì)上的差異而設(shè)計(jì)有效方案加以分離。這種差異是多方面的，包括細(xì)胞定位與組織分布上的差異

7、、物理化學(xué)性質(zhì)上的不同以及各自獨(dú)特的生物學(xué)特性。應(yīng)該去除的污染物主要包括三個(gè)部分：即非核酸的大分子污染物，非需要的核酸分子和在核酸的分離純化過(guò)程中加入的對(duì)后繼實(shí)驗(yàn)與應(yīng)用有影響的溶液與試劑。非核酸大分子污染物主要包括蛋白質(zhì)、多糖和脂類(lèi)物質(zhì)等；非需要的核酸分子，是指制備DNA時(shí)，RNA為污染物，制備RNA時(shí)，DNA為污染物，制備某一特定核酸分子時(shí)，其它的核酸分子均為污染物；至于在核酸分離純化過(guò)程中加入的有機(jī)溶劑和某些金屬離子，由于對(duì)后繼實(shí)驗(yàn)有影響，往往需要很好地去除。（三）核酸質(zhì)量與提取步驟的關(guān)系一般地，分離純化步驟越多，核酸的純度也越高，但得率會(huì)逐漸下降，完整性也愈難以保證。相反，通過(guò)分離純化步

8、驟少的實(shí)驗(yàn)方案，我們可以得到比較多的完整性較好的核酸分子，但純度不一定很高。這需要結(jié)合核酸的用途而加以選擇。（四）核酸的濃縮、沉淀與洗滌隨著核酸提取試劑的逐步加入，以及去除污染物過(guò)程中核酸分子不可避免的丟失，樣品中核酸的濃度會(huì)逐漸下降，及至影響到后面的實(shí)驗(yàn)操作或不能滿(mǎn)足后繼研究與應(yīng)用的需要時(shí)，需要對(duì)核酸進(jìn)行濃縮。沉淀是核酸濃縮最常用的方法，其優(yōu)點(diǎn)在于核酸沉淀后，可以很容易地改變?nèi)芙饩彌_液和調(diào)整核酸溶液至所需濃度；另外，核酸沉淀還能去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子，有一定的純化作用。加入一定濃度的鹽類(lèi)后，用有機(jī)溶劑沉淀核酸。其中常用的鹽類(lèi)有醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂等，常用的有機(jī)溶劑

9、則有乙醇、異丙醇和聚乙二醇。核酸沉淀往往含有少量共沉淀的鹽，需用70%75%的乙醇洗滌去除。對(duì)于濃度低并且體積較大的核酸樣品，可在有機(jī)溶劑沉淀前，采用固體的聚乙二醇或丁醇對(duì)其進(jìn)行濃縮處理。 三、 鑒定、保存與應(yīng)用（一）核酸的鑒定1濃度鑒定 核酸濃度的定量鑒定可通過(guò)紫外分光光度法與熒光光度法進(jìn)行。（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的堿基均具有一定的紫外線吸收特性，最大吸收波長(zhǎng)在250nm270nm之間。這些堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波長(zhǎng)不變。由核苷酸組成核酸后，其最大吸收波長(zhǎng)為260nm，該物理特性為測(cè)定溶液中核酸的濃度奠定了基礎(chǔ)。在波長(zhǎng)260nm的紫外線下，

10、1個(gè)OD值的光密度大約相當(dāng)于50g/ml的雙鏈DNA，38g/ml的單鏈DNA或單鏈RNA，33g/ml的單鏈寡聚核苷酸。如果要精確定量已知序列的單鏈寡核苷酸分子的濃度，就必須結(jié)合其實(shí)際分子量與摩爾吸光系數(shù)，根據(jù)朗伯-比爾定律進(jìn)行計(jì)算。若DNA樣品中含有鹽，則會(huì)使A260的讀數(shù)偏高，尚需測(cè)定A310以扣除背景，并以A260與A310的差值作為定量計(jì)算的依據(jù)。紫外分光光度法只用于測(cè)定濃度大于0.25g/ml的核酸溶液。（2）熒光光度法：熒光光度法以核酸的熒光染料溴化乙錠（ethidium bromide，EB）嵌入堿基平面后，使本身無(wú)熒光的核酸在紫外線激發(fā)下發(fā)出橙紅色的熒光，且熒光強(qiáng)度積分與核酸

11、含量呈正比。該法靈敏度可達(dá)1ng5ng，適合低濃度核酸溶液的定量分析。另外，SYBR Gold作為一種新的超靈敏熒光染料，可以從瓊脂糖凝膠中檢出低于20pg的雙鏈DNA。2純度鑒定 紫外分光光度法還是熒光光度法，均可用于核酸的純度鑒定。（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法主要通過(guò)A260與A280的比值來(lái)判定有無(wú)蛋白質(zhì)的污染。在TE緩沖液中，純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA的A260/A280比值為2.0。比值升高與降低均表示不純。其中蛋白質(zhì)與在核酸提取中加入的酚均使比值下降。蛋白質(zhì)的紫外吸收峰在280nm與酚在270nm的高吸收峰可以鑒別主要是蛋白質(zhì)的污染還是酚的污染。RN

12、A的污染可致DNA制品的比值高于1.8，故比值為1.8的DNA溶液不一定為純的DNA溶液，可能兼有蛋白質(zhì)、酚與RNA的污染，需結(jié)合其它方法加以鑒定。A260/A280的比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的一個(gè)良好指標(biāo)，2.0是高質(zhì)量RNA的標(biāo)志。但要注意，由于受RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)不同的影響，其讀數(shù)可能會(huì)有一些波動(dòng)，一般在1.82.1之間都是可以接受的。另外，鑒定RNA純度所用溶液的pH值會(huì)影響A260/A280的讀數(shù)。如RNA在水溶液中的A260/A280比值就比其在Tris緩沖液（pH 7.5）中的讀數(shù)低0.20.3。（2）熒光光度法：用溴化乙錠等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可用于判定核酸的純度。由于DNA

13、分子較RNA大許多，電泳遷移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%85%，tRNA及核內(nèi)小分子RNA占15%20%，mRNA占1%5%。故總RNA電泳后可呈現(xiàn)特征性的三條帶。在原核生物為明顯可見(jiàn)的23S、16S的rRNA條帶及由5S的rRNA與tRNA組成的相對(duì)有些擴(kuò)散的快遷移條帶。在真核生物為28S、18S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA構(gòu)成的條帶（圖6-1）。mRNA因量少且分子大小不一，一般是看不見(jiàn)的。通過(guò)分析以溴化乙錠為示蹤染料的核酸凝膠電泳結(jié)果，我們可以鑒定DNA制品中有無(wú)RNA的干擾，亦可鑒定在RNA制品中有無(wú)DNA的污染。3完整性鑒定 常規(guī)使用凝膠電泳法。（1

14、）凝膠電泳法：以溴化乙錠為示蹤染料的核酸凝膠電泳結(jié)果可用于判定核酸的完整性?；蚪MDNA的分子量很大，在電場(chǎng)中泳動(dòng)很慢，如果有降解的小分子DNA片段，在電泳圖上可以顯著地表現(xiàn)出來(lái)。而完整的無(wú)降解或降解很少的總RNA電泳圖，除具特征性的三條帶外，三條帶的熒光強(qiáng)度積分應(yīng)為一特定的比值。沉降系數(shù)大的核酸條帶，分子量大，電泳遷移率低，熒光強(qiáng)度積分高；反之，分子量小，電泳遷移率高，熒光強(qiáng)度積分低。一般28S（或23S）RNA的熒光強(qiáng)度約為18S（或16S）RNA的2倍，否則提示有RNA的降解。如果在加樣槽附近有著色條帶，則說(shuō)明有DNA的污染。（2）其它方法：必要時(shí)，還可以通過(guò)一些特殊的試驗(yàn)來(lái)分析RNA的

15、完整性，如小規(guī)模的第一鏈cDNA合成反應(yīng)、以放射性標(biāo)記的寡脫氧胸苷酸oligo(dT)為探針的Northern雜交以及對(duì)已知大小的mRNA的Northern雜交。另外，隨著毛細(xì)管電泳與生物芯片技術(shù)的飛速發(fā)展，有關(guān)核酸的分離、純化、鑒定與回收的手段日益豐富。（二）核酸的保存核酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，無(wú)需每次制備新鮮的核酸樣品，且一次性制備的核酸樣品往往可以滿(mǎn)足多次實(shí)驗(yàn)研究的需要，因此有必要探討核酸的貯存環(huán)境與條件。與分離純化一樣，DNA與RNA的保存條件也因性質(zhì)不同而相異。1DNA的保存 對(duì)于DNA來(lái)講，溶于TE緩沖液在-70可以?xún)?chǔ)存數(shù)年。其中TE的pH值為8，可以減少DNA 的脫氨反應(yīng)而pH低

16、于7.0時(shí)DNA容易變性；EDTA作為二價(jià)金屬離子的螯合劑，通過(guò)螯合Mg2+、Ca2+等二價(jià)金屬離子以抑制DNA酶的活性；低溫條件則有利于減少DNA分子的各種反應(yīng)；雙鏈DNA因結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)而具有很大的惰性，常規(guī)4亦可保存較長(zhǎng)時(shí)間；在DNA樣品中加入少量氯仿，可以有效避免細(xì)菌與核酸的污染。2RNA的保存 RNA可溶于0.3mol/L的醋酸鈉溶液或雙蒸消毒水中，-70至-80保存。若以焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNA酶阻抑蛋白（RNasin）或氧釩核糖核苷復(fù)合物（vanadyl-ribonucleoside complex

17、，VRC），則可通過(guò)抑制RNA酶對(duì)RNA的降解而延長(zhǎng)保存時(shí)間。另外，RNA沉淀溶于70%的乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中，可于-20長(zhǎng)期保存。其中，甲酰胺溶液能避免RNase對(duì)RNA的降解，而且RNA極易溶于甲酰胺溶液，其濃度可高達(dá)4mg/ml。需要注意的是，這些所謂RNA酶抑制劑或有機(jī)溶劑的加入，只是一種暫時(shí)保存的需要，如果它們對(duì)后繼的實(shí)驗(yàn)研究與應(yīng)用有影響，則必須予以去除。由于反復(fù)凍融產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對(duì)DNA與RNA核酸樣品均有破壞作用，在實(shí)際操作中，核酸的小量分裝是十分必要的。（三）核酸的應(yīng)用分離純化的核酸樣品，既可用于核酸本身功能與性質(zhì)的研究，亦可利用其功能與性質(zhì)進(jìn)行廣泛的應(yīng)用，如基因工

18、程與蛋白質(zhì)工程均以核酸分子作為原始材料。可以說(shuō)，目前包括聚合酶鏈反應(yīng)，核酸的分子雜交與DNA重組與表達(dá)技術(shù)在內(nèi)的絕大多數(shù)分子生物學(xué)技術(shù)，都是以核酸分子為處理對(duì)象，利用核酸分子的堿基配對(duì)原理與核酸的一種或多種酶修飾性進(jìn)行的。絕大多數(shù)分子生物學(xué)技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是對(duì)DNA和RNA的分析。沒(méi)有核酸的分離與純化，分子生物學(xué)技術(shù)就沒(méi)有研究與應(yīng)用的基礎(chǔ)。第二節(jié) 基因組DNA的分離與純化一、 分離與純化的方法雙鏈DNA因固有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，是一種惰性很強(qiáng)的化學(xué)分子，可用于重現(xiàn)犯罪現(xiàn)場(chǎng)和進(jìn)行古生物學(xué)分析。但由于是很長(zhǎng)的線性分子（如人的染色體DNA平均長(zhǎng)度為100150Mb）而且缺乏橫向的穩(wěn)定性，因此很容易斷裂。在溶液中

19、，由于堿基堆砌力的相互作用與磷酸基團(tuán)的靜電排斥作用，DNA分子非常粘稠，沉淀后很難溶解，而且也增加了它對(duì)剪切力的敏感性。即便是最輕柔的方式，高分子量的DNA也很容易因剪切力發(fā)生橫向的斷裂。常規(guī)方法分離基因組DNA時(shí)，大于150kb的DNA分子很容易發(fā)生斷裂。（一）酚抽提法本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通過(guò)改進(jìn)，以含EDTA、SDS及無(wú)DNA酶的RNA酶的裂解緩沖液裂解細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復(fù)抽提至一定純度后，根據(jù)不同需要行透析或沉淀處理，獲得所需的DNA樣品。其中，EDTA為二價(jià)金屬離子螯合劑，可以抑制DNA酶的活性，同時(shí)降低細(xì)

20、胞膜的穩(wěn)定性；SDS為生物陰離子去垢劑，主要引起細(xì)胞膜的降解并能乳化脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，與這些脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的結(jié)合可以使它們沉淀，其非極性端與膜磷脂結(jié)合，極性端使蛋白質(zhì)變性、解聚，所以SDS同時(shí)還有降解DNA酶的作用；無(wú)DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化；蛋白酶K則有水解蛋白質(zhì)的作用，可以消化DNA酶、DNA上的蛋白質(zhì)，也有裂解細(xì)胞的作用；酚可以使蛋白質(zhì)變性沉淀，也抑制DNA酶的活性；pH8.0的Tris溶液能保證抽提后DNA進(jìn)入水相，而避免滯留于蛋白質(zhì)層。多次抽提可提高DNA的純度。一般在第三次抽提后，移出含DNA的水相，作透析或沉淀處理。透析處理能減少對(duì)DNA的剪切效應(yīng)，因此

21、可以得到200kb的高分子量DNA。沉淀處理常以醋酸銨為鹽類(lèi)，用2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，并用70%的乙醇洗滌，最后得到的DNA大小在100kb150kb。運(yùn)用該法可以從單層或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮組織及血液標(biāo)本中制備少于10mg至大到數(shù)百mg的DNA樣品。由于分離純化的每一步都有剪切力的影響，最后得到的DNA樣品中分子量超過(guò)100kb150kb的很少，但這種大小的DNA足以作為PCR反應(yīng)的模板和進(jìn)行Southern blotting分析以及構(gòu)建以噬菌體為載體的基因組DNA文庫(kù)。從5107個(gè)培養(yǎng)的非整倍體哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如HeLa細(xì)胞）大約可以制備分子量在100kb150kb的DNA 200mg，自2

22、0ml血液可得250mg。（二）甲酰胺解聚法為構(gòu)建高容量載體的DNA文庫(kù)和進(jìn)行分子量巨大的DNA片段的脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分析，需要制備分子量大于200kb的DNA。該法的細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)水解同酚抽提法相似，但不進(jìn)行酚的抽提，而是以高濃度的甲酰胺裂解DNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合物（即染色質(zhì)），然后通過(guò)火棉膠袋的充分透析以除去蛋白酶和有機(jī)溶劑。甲酰胺是一種離子化溶劑，既可以裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物，還可使釋放的蛋白質(zhì)變性。但甲酰胺對(duì)蛋白酶K的活性無(wú)顯著影響。本法因操作步驟少，尤其省卻了酚的多次提取，所得DNA分子量一般可以大于20

23、0kb。（三）玻棒纏繞法纏繞法適于同時(shí)從不同的細(xì)胞或組織標(biāo)本中提取DNA。與前兩個(gè)方案不同，它有兩個(gè)關(guān)鍵步驟：一是基因組DNA沉淀于細(xì)胞裂解液與乙醇液的交界面；二是要將沉淀的DNA纏繞于帶鉤玻棒上。通過(guò)帶鉤玻棒將高分子量DNA沉淀從乙醇溶液中轉(zhuǎn)移到pH8.0的TE溶液重溶。小的DNA片段與RNA不能有效形成凝膠狀線卷。該方案以鹽酸胍裂解細(xì)胞，制備的DNA分子量只有大約80kb，不能有效構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)，但用于Southern雜交和PCR反應(yīng)可以獲得很好的結(jié)果。（四）DNA樣品的進(jìn)一步純化純化的方法包括透析、層析、電泳及選擇性沉淀等。其中電泳法簡(jiǎn)單、快速、易于操作、分辨率高、靈敏度好、易于觀

24、察及便于回收，在DNA的進(jìn)一步純化中占有重要的地位。由于聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel）與瓊脂糖凝膠（agarose gel）可以制成各種形狀、大小和孔徑不一的支持體，并可以在多種裝置中進(jìn)行電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）與瓊脂糖凝膠電泳（AGE）廣泛用于核酸的分離、純化與鑒定。二、 DNA片段的回收通過(guò)凝膠電泳，我們可以對(duì)各種大小與來(lái)源的DNA片段進(jìn)行分離、純化與鑒定。目前，瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺凝膠是最常使用的電泳支持體，電泳分離的DNA處于凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。下面介紹從瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段的主要方法。（一）總的原則與要求無(wú)論采用何種方法從

25、何種支持介質(zhì)中回收DNA片段，都要注意兩個(gè)原則。一是要提高DNA片段的回收率；二是要去除回收DNA樣品中的污染?；厥盏腄NA樣品往往因支持介質(zhì)的不純、回收溶液的使用及不慎操作等因素而引入污染，這些污染可能?chē)?yán)重影響后繼的實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，應(yīng)對(duì)回收的DNA樣品進(jìn)行純化，以除去污染物。常用的純化方法包括有機(jī)溶劑抽提法與商品化的柱層析法。其中柱層析法采用陰離子交換層析的原理，主要是利用帶負(fù)電荷的DNA在低離子強(qiáng)度的緩沖液中與陰離子交換樹(shù)脂結(jié)合，洗去雜質(zhì)，然后再用高離子強(qiáng)度的緩沖液洗脫下來(lái)。上述兩種純化方法以及其它回收DNA片段的方法，最終均要在有鹽的情況下進(jìn)行乙醇沉淀，并以70%的乙醇除去有機(jī)分子與

26、共沉淀的鹽。（二）從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的方法主要包括二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）纖維素膜插片電泳法、電泳洗脫法、冷凍擠壓法及低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠挖塊回收法等。1DEAE纖維素膜插片電泳法 DEAE纖維素是一種陰離子交換纖維素，可以結(jié)合帶負(fù)電荷的DNA分子。將DEAE纖維素膜插入到經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離的核酸條帶前，繼續(xù)電泳直至所需回收的DNA片段剛好轉(zhuǎn)移到膜上。取出DEAE纖維素膜，低鹽條件下洗去雜質(zhì)，高鹽條件下洗出DNA分子。該法操作比較簡(jiǎn)單，可同時(shí)回收多個(gè)DNA片段，對(duì)500bp5kb的DNA片段回收率好，純度高，能滿(mǎn)足大多

27、數(shù)實(shí)驗(yàn)的要求。但DNA片段大于5kb時(shí)，因結(jié)合力增大而回收率下降。至10kb或?yàn)閱捂淒NA時(shí)，其與膜的結(jié)合變得很牢固而難以回收。因此，本法不適合于分子量大于10kb的DNA片段的回收，也不能回收單鏈DNA。2電泳洗脫法 電泳洗脫法包括兩個(gè)主要步驟，一是將待回收的DNA片段電泳出凝膠介質(zhì)，使其進(jìn)入一個(gè)便于回收的小容積溶液中；二是分離純化出DNA片段。按是否使用透析袋可分為透析袋電泳洗脫法與非透析袋電泳洗脫法兩大類(lèi)。其中，透析袋電泳洗脫法需要切下含待回收DNA片段的凝膠條，然后放入透析袋內(nèi)進(jìn)行電泳，使DNA分子遷移出凝膠條進(jìn)入透析袋的溶液中，最后經(jīng)抽提純化回收DNA分子。該法操作很不方便而且不適合

28、于同時(shí)回收大量不同的DNA片段，但可有效回收從200bp至大于50kb的DNA，尤其對(duì)大于5kb的DNA有良好的回收率。3低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠挖塊回收法 該法是從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中切出含待回收DNA的凝膠塊，利用其純度高、熔點(diǎn)低（65）及凝固溫度低（30）的特點(diǎn)，在室溫大于30，瓊脂糖仍為液態(tài)的情況下，對(duì)DNA片段進(jìn)行回收的方法。根據(jù)不同的提取純化方案，又可分為有機(jī)試劑提取法、玻璃珠（或玻璃粉）洗脫法和瓊脂水解酶（agarase）法。有機(jī)試劑法以酚、氯仿抽提DNA，可以有效回收0.5kb5kb的DNA片段。玻璃珠（或玻璃粉）洗脫法是將瓊脂糖凝膠溶于高濃度的碘化鈉（NaI）溶液或高氯酸鈉溶液中，然后

29、加入玻璃珠（或玻璃粉）以結(jié)合DNA，經(jīng)分離、洗滌后，在低鹽緩沖液中將DNA洗脫下來(lái)。玻璃珠（或玻璃粉）洗脫法較有機(jī)試劑提取法快，但回收率略低。瓊脂水解酶法對(duì)切下的含DNA的凝膠塊進(jìn)行消化，將瓊脂糖水解為二糖，釋放的DNA用酚抽提，乙醇沉淀回收。目前，有許多能從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的方法與改良方案，但至今尚無(wú)一種方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同時(shí)回收幾種DNA片段并有效去除凝膠中酶促反應(yīng)抑制劑（如多糖類(lèi)）。每種方法各有其特點(diǎn)，各有其適用范圍，應(yīng)根據(jù)不同的要求選擇不同的方法并對(duì)某些步驟做出相應(yīng)的調(diào)整。（三）從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA的標(biāo)

30、準(zhǔn)方法是壓碎與浸泡法。它是將含待回收DNA條帶的凝膠塊切出，用吸頭或接種針將其壓碎，然后以洗脫緩沖液浸泡，使DNA洗脫出來(lái)。該法能很好回收小于1kb的單鏈或者雙鏈DNA，且純度很高，無(wú)酶抑制劑，也無(wú)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞或微注射細(xì)胞有毒的污染物，雖費(fèi)時(shí)但操作簡(jiǎn)單，是小片段DNA回收的較好方法。依分子量不同，其回收率從小于30%至大于90%不等。如果將切下的聚丙烯酰胺凝膠塊包埋于瓊脂糖凝膠中，再進(jìn)行DEAE纖維素膜插片法電泳或透析袋電泳洗脫，可以縮短雙鏈DNA的回收時(shí)間。三、 基因組DNA分離純化的方法學(xué)評(píng)價(jià)與質(zhì)量保證有關(guān)基因組DNA分離純化的方法很多，每一種方法下又可衍生出許多具體的實(shí)驗(yàn)方案。對(duì)每一個(gè)具體

31、的實(shí)驗(yàn)方案，大體上我們可以從方法的可行性與可靠性?xún)蓚€(gè)方面來(lái)加以考察?？尚行苑矫姘ǚ椒ㄊ欠窈?jiǎn)便、快速、安全及成本如何?？煽啃詣t包括了方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性、特異性、產(chǎn)出比、最大產(chǎn)量及最小樣品用量等。另一方面，由于酚具有高度的腐蝕性，需要采取特別的安全防護(hù)措施。第三節(jié) 質(zhì)粒DNA的提取與純化大多數(shù)質(zhì)粒都是雙鏈的共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒（CCC plasmid）DNA，簡(jiǎn)稱(chēng)閉環(huán)質(zhì)粒（closed circular plasmid，CC plasmid）。作為攜帶外源基因在細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要載體（vector），質(zhì)粒在基因工程中應(yīng)用十分廣泛。有關(guān)質(zhì)粒的提取與純化是必須掌握的基本技術(shù)。一、 提取與純化的方法

32、質(zhì)粒DNA的提取與純化的方法很多，經(jīng)典的方法包括堿裂解法、煮沸裂解法、SDS裂解法等。這些方法主要由細(xì)菌的培養(yǎng)（質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增）、細(xì)菌的裂解（質(zhì)粒DNA的釋放）及質(zhì)粒DNA的分離與純化等三個(gè)步驟組成。按制備量的不同，質(zhì)粒DNA提取與純化的方法可分為質(zhì)粒DNA的小量（1ml2ml）制備、質(zhì)粒DNA的中量（20ml50ml）制備及質(zhì)粒DNA的大量（500ml）制備。（一）堿裂解法堿裂解法簡(jiǎn)單、重復(fù)性好而且成本低，是使用最廣泛的方法。在NaOH提供的高pH（12.012.6）條件下，用強(qiáng)陽(yáng)離子去垢劑SDS破壞細(xì)胞壁，裂解細(xì)胞，與NaOH共同使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA

33、。盡管堿液能破壞核酸的堿基配對(duì)，但CCC質(zhì)粒DNA因纏結(jié)緊密而不會(huì)解鏈。只要不在堿性條件下變性太久，當(dāng)pH調(diào)至中性時(shí)，CCC質(zhì)粒DNA就可重新恢復(fù)其天然狀態(tài)。裂解后，細(xì)胞壁碎片與變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA形成大的復(fù)合物，這些復(fù)合物在高鉀鹽條件下，可有效沉淀，而質(zhì)粒DNA保留于上清中。直接通過(guò)無(wú)水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，并用70%的乙醇洗滌，其純度可滿(mǎn)足DNA測(cè)序與PCR等實(shí)驗(yàn)的要求。堿裂解法是一種適用范圍很廣的方法，能從所有的大腸桿菌（E.coli）菌株中分離出質(zhì)粒DNA，制備量可大可小。（二）煮沸裂解法煮沸裂解法是將細(xì)菌懸浮于含Triton X-100和溶菌酶的緩沖液中，Triton X-100

34、和溶菌酶破壞細(xì)胞壁后，沸水浴裂解細(xì)胞的同時(shí)可破壞DNA鏈的堿基配對(duì)，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA變性，但CCC質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會(huì)解鏈。當(dāng)溫度下降后，CCC質(zhì)粒DNA可重新恢復(fù)其超螺旋結(jié)構(gòu)。通過(guò)離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，然后回收上清中的質(zhì)粒DNA。煮沸裂解法是一種條件比較劇烈的方法，對(duì)于大質(zhì)粒（15kb）有明顯的剪切作用，故只能用于小質(zhì)粒DNA（15kb）的制備。該法能用于小質(zhì)粒DNA的小量與大量制備，并且適用于大多數(shù)的E.coli菌株。由于糖類(lèi)很難去除，而且糖抑制限制性酶和聚合酶的活性，故該法不適用于在去污劑、溶菌酶和加熱情況下可釋放大量糖類(lèi)的E.coli菌株，如HB10

35、1及其衍生菌株（TG1）。另外，煮沸不能完全滅活核酸內(nèi)切酶A（endonuclease A，endA）的活性，故表達(dá)endA的菌株亦不適用于本法。在細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中，加入氯霉素可抑制細(xì)菌的蛋白合成和細(xì)菌分裂，有利于質(zhì)粒DNA的選擇性擴(kuò)增。（三）SDS裂解法大于15kb的質(zhì)粒DNA容易因細(xì)胞裂解和后繼操作而遭到破壞，因此需要溫和的裂解方法。SDS裂解法是將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細(xì)胞壁，去壁細(xì)菌再用SDS裂解，從而溫和地釋放質(zhì)粒DNA到等滲液中，然后用酚/氯仿抽提。由于條件溫和，SDS裂解法有利于大質(zhì)粒DNA的提取。但該法在處理過(guò)程中，有一部分質(zhì)粒DNA因纏結(jié)在細(xì)胞

36、碎片上而丟失，故產(chǎn)率不高。（四）其它方法其它方法如小量一步提取法、牙簽少量制備法及Triton-溶菌酶法等，各有特點(diǎn)與適用范圍。小量一步提取法，直接將酚/氯仿與細(xì)菌培養(yǎng)物混合，同時(shí)完成細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)變性?xún)蓚€(gè)過(guò)程，然后離心去除大部分胞核DNA與蛋白質(zhì)，最后從上清中回收質(zhì)粒DNA。該法簡(jiǎn)單快速、經(jīng)濟(jì)可行，可用于內(nèi)切酶圖譜分析。（五）質(zhì)粒DNA的純化目前，關(guān)于純化的方法與方案非常多，都利用了質(zhì)粒相對(duì)較小和共價(jià)閉環(huán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。其中，純化效果好而且適用范圍廣的方法主要有氯化銫-溴化乙錠等密度梯度超速離心法（簡(jiǎn)稱(chēng)CsCl-EB法）、聚乙二醇沉淀法和柱層析法。1CsCl-EB法 CsCl-EB法是一種沉降

37、平衡離心法，經(jīng)超速離心，離心介質(zhì)CsCl形成一連續(xù)的密度梯度，在過(guò)量EB存在的條件下，各種不同密度的物質(zhì)經(jīng)離心平衡后得以分開(kāi)。其中蛋白質(zhì)密度小（1.3 g/cm31.4g/cm3），浮于液面；RNA密度大（2.0g/cm3），沉于管底；各種DNA密度介于蛋白質(zhì)與RNA之間，處于中部。過(guò)量EB處理前，細(xì)菌染色體DNA與不同分子構(gòu)型的質(zhì)粒DNA的密度均為1.7g/cm3左右，難以區(qū)分。經(jīng)過(guò)量EB處理后，不同分子構(gòu)型的DNA與EB的結(jié)合能力不一樣，因而密度下降不一致，可有效分離。其中，閉環(huán)質(zhì)粒DNA為超螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)，EB不易插入，結(jié)合量少，密度下降小，約為1.59 g/cm3；而染色體DNA、開(kāi)環(huán)質(zhì)

38、粒DNA以及帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒DNA可以嵌入更多的EB，密度下降較多，約為1.54 g/cm3，從而能與閉環(huán)質(zhì)粒DNA分開(kāi)?；厥盏拈]環(huán)質(zhì)粒DNA含有嵌入的EB，可采用有機(jī)溶劑抽提法或離子交換層析加以去除。經(jīng)典的CsCl-EB法由于其容量大、分辨率高、純化效果好，至今仍是質(zhì)粒DNA純化的標(biāo)準(zhǔn)方法。但該法很費(fèi)時(shí)并需要昂貴的設(shè)備與試劑。2聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）沉淀法是一種分級(jí)沉淀法。質(zhì)粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子RNA，并用RNase消化小分子RNA；然后在高鹽條件下，用PEG選擇性地沉淀大的質(zhì)粒DNA；沉淀的質(zhì)粒DNA進(jìn)一步用酚/氯仿抽

39、提，乙醇沉淀。該法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、適用廣，尤其對(duì)堿裂解法提取的質(zhì)粒純化效果好，適用于分子克隆中所有常規(guī)的酶學(xué)反應(yīng)，也能用于高效的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。但PEG法不能有效分離帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒DNA與閉環(huán)質(zhì)粒DNA。3柱層析法 柱層析法純化質(zhì)粒DNA的關(guān)鍵是其填充的樹(shù)脂。大體上，樹(shù)脂可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是利用疏水的相互作用來(lái)純化質(zhì)粒DNA樣品；一類(lèi)則通過(guò)離子交換與吸附的相互作用進(jìn)行純化。以硅基質(zhì)作為填充材料的柱層析，其作用原理是在多鹽條件下，依靠DNA與硅基質(zhì)的可逆性結(jié)合來(lái)進(jìn)行純化。多鹽造成磷酸二酯骨架的脫水，通過(guò)暴露的磷酸鹽殘基，DNA吸附到硅基質(zhì)上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖類(lèi)等生物大分子，然后加

40、入TE或水溶液使DNA分子重新水合，并通過(guò)離心洗脫出來(lái)。DNA與硅基質(zhì)的吸附作用與DNA的堿基組成和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)，因此可用于環(huán)型質(zhì)粒DNA和線性DNA的純化。小于100bp200bp的DNA分子由于與硅基質(zhì)的吸附力很弱，不能用于小分子DNA片段的純化。但在純化大分子DNA時(shí)，可有效去除小分子DNA的污染。第四節(jié) RNA的分離與純化包括Northern雜交在內(nèi)的許多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)均是以RNA為材料，mRNA的制備也需要一定質(zhì)量的總RNA樣品，RNA的數(shù)量、純度與完整性將直接影響這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。RNA中rRNA的數(shù)量最多，占總量的80%85%；tRNA及核內(nèi)小分子RNA占15%20%；mRNA僅占

41、1%5%。由于各種rRNA、tRNA及核內(nèi)小分子RNA的結(jié)構(gòu)與功能已比較清楚，從基因克隆、表達(dá)與診斷的目的出發(fā)，目前對(duì)RNA的分離與純化，主要集中在總RNA與mRNA上。一、 RNA制備的條件與環(huán)境為防止RNase對(duì)RNA 的水解，一要全力避免細(xì)胞外RNase的污染并抑制其活性，二要盡快地抑制細(xì)胞內(nèi)RNase的活性并極力地去除RNase。對(duì)廣泛存在的細(xì)胞外RNase，應(yīng)在RNA制備的全過(guò)程中保持高度的警惕，并采取嚴(yán)格的措施以避免其污染和抑制其活性。從RNA提取的初始階段開(kāi)始，就選擇性地使用針對(duì)RNase的蛋白質(zhì)變性劑（如酚、氯仿等有機(jī)溶劑以及強(qiáng)烈的胍類(lèi)變性劑）、蛋白的水解酶（如蛋白酶K）和能與

42、蛋白質(zhì)結(jié)合的陰離子去污劑（如SDS、sarkosyl或脫氧膽酸鈉等）并聯(lián)合使用RNase的特異性抑制劑（如RNasin與DEPC等）能極大地防止內(nèi)源性RNase對(duì)RNA的水解。另外，在變性液中加入-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）等還原劑可以破壞RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活。二、 總RNA的分離與純化由于RNase的影響，為獲得完整的RNA分子，就必須在總RNA分離純化的最初階段，盡可能快地滅活胞內(nèi)RNase的活性。在-巰基乙醇的協(xié)同作用下，高濃度的(異)硫氰酸胍可以極大極快地抑制RNase的活性，能從胰腺等富含RNase的組織細(xì)胞中分離

43、出完整的RNA分子，目前已成為常規(guī)使用的試劑。pH8.0的Tris飽和酚用于DNA的制備，但在RNA純化時(shí)，應(yīng)使用pH4.55.5的水飽和酸性酚，這既有利于DNA的變性又有利于RNA的分離。盡管對(duì)剪切力不敏感，但RNA具有堿易變性，需要嚴(yán)格控制pH值。另外，在DNA與RNA的提取過(guò)程中，酚與氯仿經(jīng)常結(jié)合、交替使用，主要在于兩者合用時(shí)去除蛋白的效果更好，而且氯仿還能有效抑制RNase的活性，通過(guò)使酚脫水防止mRNA的丟失，加速有機(jī)相與水相的分層，去除植物色素和蔗糖以及核酸樣品中的痕量酚。少量異戊醇的加入，其目的在于消除抽提過(guò)程中因蛋白質(zhì)變性而產(chǎn)生的泡沫。由于高濃度胍類(lèi)的使用，為防止SDS的沉淀，

44、常改用十二烷基肌氨酸鈉。對(duì)含量較低的樣品，加入糖原可以提高RNA的回收率?？俁NA提取法中最常使用的是一步法。需要指出的是，目前常用的一步法均以異丙醇沉淀RNA，由于其選擇性地沉淀大分子rRNA和mRNA，故提取的總RNA中含有的小分子量RNA較少，rRNA和mRNA所占的比例相應(yīng)增高。當(dāng)然，目前的研究重點(diǎn)不是小分子量RNA，而是分子量較高的mRNA，不必苛求真正的總RNA。 （一）(異)硫氰酸胍-酚氯仿一步法(異)硫氰酸胍-酚氯仿法是經(jīng)典的一步法，由Chomczynski和Sacchi 于1987年提出。它以含4mmol/L的(異)硫氰酸胍與0.1mmol/L的-巰基乙醇的變性溶液裂解細(xì)胞，

45、然后在pH4.0的酸性條件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通過(guò)異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌來(lái)制備RNA。該法與以前的(異)硫氰酸胍-CsCl超速離心法相比，具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和高效的特點(diǎn)，能同時(shí)迅速地處理多個(gè)標(biāo)本，且RNA的完整性與純度均很高。目前仍用于從培養(yǎng)細(xì)胞和大多數(shù)動(dòng)物組織中分離純化總RNA?？俁NA的產(chǎn)量取決于標(biāo)本的起始量，每毫克組織總RNA的產(chǎn)量大約為47mg，每106個(gè)細(xì)胞大約為510mg。但該法不適合從富含甘油三酯的脂肪組織中提取RNA，而且有時(shí)RNA會(huì)帶有多糖和蛋白多糖的污染，這些污染將影響乙醇沉淀后RNA的溶解，同時(shí)抑制RT-PCR反應(yīng)，并通過(guò)結(jié)合到膜上而影響RNA雜交中的印跡步驟。脂肪組織RNA的提取可換用(異)硫氰酸胍-CsCl超速離心法。當(dāng)多糖與蛋白多糖的污染比較嚴(yán)重時(shí)，可下一個(gè)方法，通過(guò)增加一個(gè)有機(jī)溶劑的抽提步驟并改變RNA的沉淀?xiàng)l件而加以消除。（二）可同時(shí)制備RNA、DNA與蛋白質(zhì)的一步法該法是(異)硫氰酸胍-酚氯仿一步法的改進(jìn)方法。它是以(異)硫氰酸胍-酚的單相裂解試劑裂解細(xì)胞，然后加入氯仿后形成兩相。變性的D