淺議血液篩查中的“漏檢”.ppt

1、淺議血液篩查中的“漏檢”與“灰區(qū)”問題,血液篩查的終極目的,篩查試驗,一、篩查的概念 1957年WHO接受了美國慢性病委員會提出的關(guān)于篩查的定義：通過快速的篩查試驗 (screening test)和其他檢查措施，在健康的人群中去發(fā)現(xiàn)那些未被識別的病人或有缺陷的人。 篩查試驗是從可能無患病者中查出外表健康而可能患病者。篩查不一定是診斷性的，陽性者或可疑陽性者應(yīng)當(dāng)指定就醫(yī)，進一步診斷和進行必要的治療。,篩查與診斷的區(qū)別: 1、應(yīng)用目的不同 診斷試驗?zāi)康脑谟趯κ茉囌咦龀鲈\斷，而篩查則是在受試人群中發(fā)現(xiàn)可疑患者或早期患者。 2、應(yīng)用對象不同 通常診斷試驗的應(yīng)用對象是某病的可疑患者，即有一定的臨床癥狀

2、者，而篩查試驗則是外表健康的人群，常用于高危人群。 3、對兩者的要求不同 篩查時由于是在人群中應(yīng)用，其中絕大多數(shù)是健康者，所以要求必須具備快速、簡便、易行、廉價、安全、可靠、靈敏、能被受試者接受等特點。 4、應(yīng)用順序不同 篩查是第一步，診斷是第二步。,臨床實驗方法學(xué)評價,評價指標的計算： 敏感度a/(a+c) 特異度d/(b+d) 陽性預(yù)測值a/(a+b) 陰性預(yù)測值d+(b+d) 診斷指數(shù)敏感度特異度 診斷效率(準確度)(a+d)/(a+b+c+d) 陽性似然比敏感度/(1特異度) 陰性似然比(1敏感度)/特異度,1、篩查：敏感性高，不落陽性者，可假陽性2、診斷：同時具備較好的敏感性和特異性

3、3、確認：特異性好對于血站檢驗來說，主要是防止漏檢。,我國ELISA漏檢情況遠高于國外報道為什么？,防漏檢的策略,保證好的標本: 標識正確，無交叉污染，標本離體后被分析物保持穩(wěn)定，無干擾檢測的物質(zhì)。 好的檢測方法：ALT和梅毒螺旋體的檢測方法 好的設(shè)備： 好的試劑：新一代HIV、HCV檢測試劑 好的分析操作：SOP問題、人員能力 好的質(zhì)量控制： 正確的結(jié)果判讀：,理想的血液安全篩查方法應(yīng)是病原的直接檢測,HBV -HBsAg ELISA HCV -抗HCVELISA HIV -抗HIVELISA 梅毒螺旋體-梅毒抗體RPR、TRUST、ELISA ALT(速率法、賴氏法) EBV - 寄生蟲-

4、 West Nile - 目前的檢測幾乎都是間接指標,ELISA漏檢的方法學(xué)因素,窗口期問題 靈敏度 亞型或變異問題 靜默感染,高危人群獻血漏檢風(fēng)險更大,常見的ELISA漏檢因素,漏檢是絕對的，不漏檢是相對的 方法學(xué)、生理病理情況等都能引起漏檢 窗口期是漏檢最重要的因素 90%的HBV、HIV；70%的HCV（美國研究） 變異與亞型是漏檢的重要因素 不同的試劑存在著不同的亞型適應(yīng)性 對不同的亞型靈敏度也存在差異 靜默感染是難以避免的問題 針對抗體為檢測的ELISA項目 靈敏度是漏檢不可忽視的因素 靈敏度是檢出率的重要因素 實驗錯誤再所難免 在現(xiàn)實工作中，從大面積和長時間的角度來看錯誤不能杜絕,

5、防漏檢，保安全獻血者健康狀況的綜合評估策略？,基本社會背景 健康背景：既往史與現(xiàn)癥史 體格檢查 實驗室指標的綜合運用：以往與現(xiàn)在 上述信息支持下的綜合評估,醫(yī)療糾紛風(fēng)險醫(yī)院輸血前后檢查存在的問題,是否存在輸血前檢查假陰性問題？ 出現(xiàn)糾紛后，血站需要自證清白 血站規(guī)范化管理的重要性和緊迫性 血站還應(yīng)有主動保證血液安全的義務(wù),防漏檢的技術(shù)問題,一、一步法還是二步法？ 二、溫育： 1、試劑是否預(yù)溫？ 2、確保溫度均一性：邊沿效應(yīng)、空調(diào)風(fēng) 3、確保恰當(dāng)?shù)臏赜龝r間（所有孔均達到要求溫度后開始計時） 三、顯色：血站檢測的顯色時間是否可比醫(yī)院檢測稍延長？ 四、比色：1、波長是否準確？2、檢測光亮度是否合適？

6、3、雙波長優(yōu)于單波長；4、檢測線性范圍，OD值低限區(qū)是否敏感？5、比色檢測后的人工復(fù)核？ 五、發(fā)現(xiàn)加樣環(huán)節(jié)出現(xiàn)的問題: 吸量不足 六、試劑問題：可通過質(zhì)控結(jié)果反映 七、存在干擾因素導(dǎo)致的弱反應(yīng)：稀釋后檢測,八、灰區(qū)問題,ELISA 是一種定性測定,通常用“反應(yīng)性或陽性”,或“非反應(yīng)性或陰性”方式報告結(jié)果,在陽性與陰性之間必須有一個明確的分界線,即陽性判斷值(Cut off值,CO值) 。 實際上,在臨床測定所有標本中均要分出明顯的陽性或陰性是不可能的,在它們之間還有弱反應(yīng)性,此即為“灰區(qū)”。,對“灰區(qū)”樣本進行再確認是血站對血液安全高度負責(zé)任的體現(xiàn),1、 S/CO1的樣本還有假陽性。美國疾病預(yù)

7、防控制中心曾對美國O rtho的抗-HCV檢測ELISA試劑盒進行一個多中心研究,發(fā)現(xiàn)只有檢測結(jié)果才有95%以上的初篩檢測為反應(yīng)性標本是真正的陽性； 2、S/CO1者判為陰性在臨床上完全可以接受； 3、對S/CO1者“精益求精” 是血站對血液安全高度負責(zé)任的表現(xiàn)。,為什么血站要重視灰區(qū)的再甄別？,1、灰區(qū)里還有陽性標本，輕易放過可導(dǎo)致受血者染病。 解放軍第159醫(yī)院文進等將21例復(fù)查為灰區(qū)的標本（0.7s/co0.99），經(jīng)解放軍艾滋病檢測確認實驗室WB試驗確認7例陽性。 臨床輸血與檢驗2005年4月第7卷第2期,南京血液中心徐樹良等，中國輸血雜志2003，V16（1）,初篩檢測：HBsAg

8、ELISA FQ-PCR： HBV-DNA 灰區(qū)： 0.7s/co0.99,江蘇省臨檢中心許斌等，臨床檢驗雜志1998,為什么血站要重視灰區(qū)的再甄別？,2、高危人群獻血率增加，漏檢或窗口期概率增大新時期血液安全的挑戰(zhàn) 湖南邵陽市戒毒中心錢雪歸等，對51份抗-HCV ELISA檢測0. 75 S/CO 1. 0 的吸毒者血標本進行PCR檢測，13例陽性。 吸毒人群抗-HCV ELISA法“灰區(qū)”分析及其確認意義，實用醫(yī)技雜志，2008年10月第15卷第29期,“灰區(qū)”范圍界定,1、考慮到試劑批間差、板間差和操作誤差，灰區(qū)設(shè)置應(yīng)基于各實驗室常規(guī)條件下的變異來確定； 2、結(jié)合歷史經(jīng)驗：在實驗條件未改

9、變的情況下，可暫定一個灰區(qū)范圍，一段時間后分析回顧灰區(qū)樣本的復(fù)檢情況，研究決定調(diào)整灰區(qū)設(shè)定范圍。 （1）多少比例的漏檢率是可以接受的？應(yīng)以國家或政府的意思為依據(jù) （2）考慮復(fù)檢在試劑和人力方面的花費，條件好時擴大復(fù)檢范圍； （3）以最佳付出/回報比例考慮,引起“灰區(qū)”結(jié)果的原因,1 定性ELISA試劑盒CO值設(shè)定 2 試劑因素：部分市售KIT在包被抗原（或抗體）組成、包被工藝及包被板質(zhì)量等方面存在孔間、批間、不同廠家之間的差異。 3 標本因素： （1）標本中被檢物含量較低：免疫抑制藥會降低抗體滴度 （2）被檢物含量太高HOOK效應(yīng) （3）抗凝不好的血漿或短期內(nèi)采集的凝血不徹底的血清 （4）內(nèi)源

10、性和外源性干擾因素。內(nèi)源性干擾因素有類風(fēng)濕因子、補體、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體和某些自身抗體等；外源性干擾因素有標本溶血、標本被細菌污染等。 4 操作因素的影響ELISA操作步驟復(fù)雜，每一步操作不當(dāng)都會對結(jié)果產(chǎn)生影響。如加樣引起的非特異性吸附，標本間 互相污染，洗板次數(shù)不夠或過多而引起假陽性或假陰性等。,灰區(qū)樣本復(fù)檢不是簡單重做,應(yīng)認真查看標本狀態(tài)：有無血液凝固不佳？有無溶血脂血？有無其他可能干擾了檢測？ 復(fù)檢宜使用兩種不同原理（或不同廠家）試劑，復(fù)檢要遵循雙孔復(fù)檢原則 復(fù)檢同樣要嚴格質(zhì)控 只有經(jīng)復(fù)檢后完全消除了疑問的，才能放行 建議： 1、應(yīng)有額外的標本稀釋后檢測：減少抑制因素

11、的影響 2、應(yīng)采用更靈敏、特異的方法來復(fù)查，以增加對標本的差別佐證,條件具備時應(yīng)及時使用更好的試劑做血篩,臨床測定技術(shù)的發(fā)展主要在于方法學(xué)的發(fā)展，而方法學(xué)的發(fā)展依托于試劑生產(chǎn)技術(shù)不斷進步更新和型標記物的應(yīng)用。 HCV基因組有7個功能區(qū)組成：C、E1、E2/NS1 NS2 NS3 NS4 NS5(有分為NS5a和NS5b)區(qū)。目前用于檢測的抗原幾乎均是通過基因工程方法得到的。,由美國ortho公司克隆C1003抗原幾個片斷與人超氧化物歧化酶（SOD）結(jié)合。用酵母從病毒基因組非結(jié)合區(qū)得到表達，表達為融合蛋白，亦作為包被固相載體。 抗原組合：NS4 區(qū)二個基因片斷為NS 5-1-1和C1003 特性

12、：IgG抗C100在發(fā)病后數(shù)月后，才檢出，故不宜作早期診斷。 約由20%的病人不出現(xiàn)抗體。IgM抗-C100急性期檢出率只有64%。 C100的抗原性較弱，在HCV復(fù)制中，不能充分暴露宿主的免疫系統(tǒng)。 特異性和靈敏性較差。,第一代抗HCV-ELISA試劑盒,第二代HCV-ELISA試劑盒,用基因重組的HCV結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白抗原包被固相載體。 抗原組合：核心區(qū)（C區(qū)）多肽C22 NS區(qū)多肽C33 C1003和NS 5-1-1 增加C22區(qū)和C33區(qū)后，抗體出現(xiàn)早，有助早期診斷，提高陽性率。有利早期診斷。 C22是早期易出現(xiàn)病毒血癥,第三代HCV-ELISA試劑盒,人工合成多肽抗原，由36個氨

13、基酸組成的Cp9(內(nèi)殼蛋白)和19個氨基酸組成Cp10混合包被固相載體。 抗原組合：除有C 100-3 C22 C33 外又增加了core 和NS3 NS4 NS5 特點： *core NS3 NS5由Baculovirus 重組表達，沒有非特異性的 載體，試劑特異性高 ，重組的蛋白經(jīng)融合形成大分子抗原，利于提高檢測靈敏度。 * NS3 區(qū)增加了氨基酸片斷（比例十分重要）。改進了反映的靈敏度。 * NS5 經(jīng)優(yōu)化，徐去了非特異性的區(qū)域（G-D-D）NS3 NS5是血轉(zhuǎn)化最早測得的抗體，提高了診斷的準確性。 * NS4 為倆個片斷的合成多肽，去掉了非特異性反應(yīng)的區(qū)域，加強了試劑的靈敏度和特異性。

14、,第四代HCVELISA 試劑盒,美國新近推出一種包括HCV基因組7個功能區(qū)所有免疫決定基的單一融合蛋白，稱為多決定基融合抗原，采用表面活性劑處理分界病毒表面復(fù)合物，釋放HCV核心抗原（core）并用ELISA法，靈敏度可達500拷貝/ml，已接近核酸擴增檢測水平。 抗原組合：以Core和NS3作為主要檢測片斷（比例十分重要）加合成多肽NS4 特點：直接測Core抗原 不易發(fā)生變異 抗IgM 和IgG檢出率可達100% 特異性達99.8%靈敏度為100%,HIV檢測試劑,通常情況下，病毒分離培養(yǎng)和PCR法檢測HIV RNA的“窗口期”約為7天左右；檢測P24抗原的“窗口期”約為14-21天；檢

15、測抗體的“窗口期”約為31-60天。盡量縮短“窗口期”，提高檢測方法的靈敏度對于HIV感染的早期診斷，特別是在獻血員的篩查，防止病毒傳播方面具有重要意義。目前許多試劑商已推出能同時檢出HIV抗原和抗體的第四代診斷試劑，可考慮推廣應(yīng)用。,HIV抗體測定HIV抗體試劑盒進展,代次抗原方法檢測時間 1全病毒間接 2個月 2 重組或多肽 間接3-4 周 3 重組+多肽夾心4-7 天 4抗原+抗體夾心抗原 5pg,HIV抗體測定特點,第一代全病毒HIV-1型 第二代重組/蛋白/多肽聯(lián)合HIV-2型 敏感度同第一代，特異度提高 第三代重組/蛋白/多肽 間接法改為直接法 除IgG外能檢出早期IgM,縮短窗口

16、期,第四代HIV抗體試劑的特點,抗原抗體聯(lián)合檢測不能取代血液單個抗原的篩查（前者抗原檢測范圍20-100pg/ml，后者3.5-15pg/ml），增加假陰性 在急性感染期單一P24測定較第四代試劑檢出早1-2天 第四代試劑在HIV-1非B亞型、O型和HIV-2的敏感度差異較大 由于加入檢測抗原的抗-24抗體可減少單一第三代HIV抗體試劑的敏感度 可能會增加非特異性反應(yīng)的危險性（第三代假陽性率0.2%增至0.3%-0.8%） 在檢測程序上凡第四代陽性，要進行抗原的證實試驗 核酸測定比抗體提前11天 Bernard Webur首先評估了第四代試劑平均減少4天窗口期,HIV初篩檢測中值得注意的問題,

17、1、初篩檢測的陽性結(jié)果不是最終結(jié)論。不能通知受檢者本 人及其他人員，陽性樣本復(fù)檢，復(fù)檢仍為陽性或可疑的， 應(yīng)及時送HIV抗體確證試驗室用確證試驗檢測； 2、初篩檢測的宗旨是要盡可能檢出所有的陽性樣本，因此應(yīng)選用敏感性高的符合國家要求的高質(zhì)量試劑，且必須為 HIV-1/2混合型，最好能同時檢測HIV-1 O 亞群。使用不符 合規(guī)定的試劑可能導(dǎo)致錯誤結(jié)果和法律糾紛，甚至造成嚴 重后果； 3、血站對獻血員進行篩選時，應(yīng)選擇高敏感性試劑，盡可 能防止任何情況的漏檢，從而保證血液安全； 4、檢測過程應(yīng)注意生物安全和醫(yī)療垃圾處理。,NAT檢測技術(shù),核酸檢測(nucleic acid testing，NAT

18、) 技術(shù)敏感性高，可檢出標本中極微量的核酸，甚至在病毒感染后數(shù)天即可檢出病毒核酸，大大縮短了窗口期。有研究報道：NAT可將HBV、HCV和HIV感染的平均窗口期分別縮短2530d (縮短窗口期42 %50 %)、5759 d (72 %89 %) 和1011 d (50 %)；此外NAT還可以檢出因上述其他3種原因而漏檢的被感染獻血。盡管NAT 技術(shù)從理論上并不能完全消除感染窗口期，但通常在病毒核酸轉(zhuǎn)陽之前的血液傳染性很低，可以有效地預(yù)防經(jīng)輸血傳播病毒性疾病。因此，在現(xiàn)有科學(xué)技術(shù)條件下，NAT 技術(shù)的引入可使輸血傳播疾病(transfusion-transmitted viral infectio