蛋白酶專一性酶切位點的影響因素分析

1、蛋白酶專一性酶切位點的影響因素分析摘要：生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽。酶法水解蛋白質廣泛用于制備生物活性肽，但酶解法存在目標肽得率低、副產物過多的缺點。蛋白酶和蛋白質的選擇是關鍵步驟，局部構象、三維結構、實驗條件以及其它偶然因素也會影響蛋白水解酶的酶切效果。本文綜述了溫度、pH值、溫度和pH值共同作用、金屬離子對酶切位點的影響，旨在為研究酶切規(guī)律、制備高得率活性肽提供理論基礎。關鍵詞：生物活性肽；蛋白酶；水解條件；酶切位點Influencing Factors Analysis of Protease Specific Cleavage SitesA

2、bstract: Bioactive peptides are fragments with specific amino acid sequences that exert a positive physiological influence on the body. Many reported Bioactive peptides are produced by enzymatic hydrolysis,but there are disadvantages of by-product and low yield.The choice of protease and protein sou

3、rce is a key step,and many factors such as local conformation,tertiary structure, experimental conditions and causal interference can influence the protease hydyolysis.This article presents the influencing fators,temperature,pH values,temperature combined pH values and metal ions included,to provide

4、 theoretical basis for enzymatic law analysis and higher yield bioactive peptides production.Key words:bioactive peptides;protease;hydrolysis conditions;protease cleavage sites1. 前言生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽，是氨基酸以不同組成和排列方式構成的不同肽類的總稱（氨基酸數(shù)目一般小于100）。生物活性肽有的是天然存在的，如谷胱甘肽、催產素、加壓素、舒緩激肽、部分抗菌肽等，有的生

5、物活性肽是以非活性的狀態(tài)存在于某些蛋白質中，當用特定的蛋白酶水解后被釋放出來，才成為有特定生理活性的肽。同種蛋白質經不同的蛋白酶酶解后，可以產生具有不同氨基酸序列、不同生理功能的生物活性肽，如大豆蛋白、卵清白蛋白、牛乳蛋白、酪蛋白經不同的蛋白酶酶解可以產生具有降血壓、抗氧化、防病、祛病、增強人體免疫力、促消化吸收等不同生理作用的肽1。由于生物活性肽在藥物、保健品等領域具有廣闊的應用前景，因此對生物活性肽的研究與開發(fā)具有重要意義。2. 生物活性肽的制備為了研究生物活性肽的結構與功能，開發(fā)相關藥物或保健品等，需大量制備生物活性肽。目前，獲得生物活性肽的主要途徑有以下3種：直接分離提??；化學合成或重

6、組DNA技術；體外水解蛋白質1。天然生物活性肽分布很廣泛，目前已經從動物、植物、微生物及部分海洋生物中直接分離出多種生物活性肽。天然生物活性肽通常具有高效、低毒、無污染等特點2?；瘜W合成法有固相與液相兩種方式，其基本原理幾乎一樣?；瘜W合成法發(fā)展較早，也比較成熟。重組DNA法一旦建立好系統(tǒng)，就可以大量地重復性生產所要的活性肽。然而，這些制備方法存在一定的局限性。生物活性肽在生物體內的含量一般是微量的，如谷胱甘肽、催產素等，而且目前從天然生物體中分離純化獲得活性肽的工藝還不是很完善?；瘜W法合成仍有許多缺點，包括消旋化現(xiàn)象；側鏈官能團需要保護；整體效率低；使用大量的有毒溶劑，且成本高昂。因此化學合成

7、法多半用在實驗室，或是高價肽的生產上。重組DNA技術在基因的表達與產品回收上仍有問題，同時該法生產的活性肽種類也有限制，不能生產酰胺肽，也不適合制備短鏈肽3。酶法水解由于反應較溫和、對蛋白質營養(yǎng)價值破壞小、使用的試劑毒性較低、反應具有空間立體性、產物沒有消旋化現(xiàn)象、反應位點具有方向性、無異味等優(yōu)越性，在現(xiàn)階段被廣泛用于制備生物活性肽。生物活性肽具有促進礦物質吸收、抑制細菌、抗高血壓、抗氧化、抗疲勞、神經調節(jié)、免疫調節(jié)等生理活性，而這些功能是原蛋白質或其組成氨基酸不具備的，且許多活性肽的組成氨基酸不一定是必需氨基酸，選擇合適蛋白酶水解把其有生物活性肽鏈片段釋放出來，從而制備出具有各種各樣生理功能

8、的生物活性肽。這就為更充分的利用蛋白質資源，特別是為那些原本認為生物效價不高的蛋白質資源提供了新的機遇4。迄今，獲得生物活性肽的大量研究主要集中在蛋白質水解酶和蛋白質的篩選以及酶解條件的優(yōu)化上，通過改善水解工藝，進一步提高生物活性肽得率。隨著生物信息學的發(fā)展及生物活性肽研究的不斷深入，越來越多的蛋白質一級結構及活性肽的氨基酸序列得到闡明，免疫學的發(fā)展使得蛋白酶的酶切位點也越來越明確，這為從原料蛋白質中尋找已知氨基酸組成序列的生物活性肽提供了基礎。研究表明，具有特定生物活性的肽具有相似的結構特征，而其活性與肽的理化性質相關。因此，根據(jù)活性肽的氨基酸組成結構信息和不同蛋白酶的水解位點特異性可以利用

9、計算機使用特定酶模擬定向的釋放活性肽，如黎觀紅等（2003）利用Access數(shù)據(jù)庫軟件建立了一個生物活性肽數(shù)據(jù)庫，利用自編程序可用來尋找蛋白質中潛在的生物活性肽從該蛋白質中釋放出來的適宜的酶。陳征松等（2007）建立了活性肽搜尋與蛋白模擬水解數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)了蛋白質用單酶或者復酶的模擬水解。Vanessa Vermeirssen等（2004）建立蛋白質數(shù)據(jù)庫并進行了實驗，取得初步成果。但酶法制備活性肽過程中一個具有挑戰(zhàn)性的問題是，在蛋白質酶切過程中，會出現(xiàn)漏切位點和非專一性酶切位點，最終無法保證絕對把蛋白質酶切為常規(guī)的肽段，造成許多不必要的產物生成。這是利用蛋白酶催化合成活性肽最明顯的副作用。對于

10、常用的酶解來說，局部構象、三維結構、實驗條件、酶切位點附近的其它氨基酸以及其它偶然因素都會影響蛋白水解酶的酶切效果5。因此，研究蛋白質的酶切位點的影響因素，分析蛋白質的酶切規(guī)律，對制備高純度、高產率的目標活性肽以及進一步研究其活性與結構的關系，具有重要意義。3. 蛋白酶和蛋白質的選擇蛋白酶的選擇是酶法制備活性肽的關鍵步驟。在酶的篩選過程中，應以原料蛋白的組成和酶的專一性為參考，也可根據(jù)目標活性肽的結構特點進行選擇或通過酶工程來生產特定酶6。根據(jù)水解方式不同可將目前常用蛋白酶分為以下2類7：（1）內切酶：作用于蛋白質分子內部肽鍵。包括動物蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等；植物蛋白酶，

11、如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶等；以及微生物來源蛋白酶，如丹麥Novo公司生產的堿性蛋白酶Alcalase、復合蛋白酶Protamex、中性蛋白酶Neutrase等。（2）外切酶：作用于蛋白質或多肽分子氨基或羧基末端的肽鍵，生成游離氨基酸，其中作用于氨基末端的稱為氨肽酶，作用于羧基末端的稱為羧肽酶。外切酶的一個重要特性就是能夠把處于肽鏈末端的疏水性氨基酸水解出來，降低多肽的苦味。常見的一些蛋白酶及其作用位點見表1。表1常見蛋白酶的作用位點種類來源最適pH作用位點胃蛋白酶胃黏膜23Phe-，Leu-胰蛋白酶胰臟79Arg-，Lys-胰凝乳蛋白酶胰臟3.7Tyr-，Trp-，Phe-，Le

12、u-木瓜蛋白酶木瓜果實57Arg-，Lys-，Phe-X菠蘿蛋白酶菠蘿果實57.5Lys-，Ala-，Tyr-，Gly-堿性蛋白酶Carlsber 枯草桿菌6.58.5Ala-，Leu-，Val-，Tyr-，Phe-，Try-許多動物蛋白和植物蛋白都可作為的來源。部分活性肽來自乳蛋白、酪蛋白、乳清、雞蛋和肌肉蛋白質等動物蛋白質。此外，海洋生物如魚、鮭魚、牡蠣、大型藻類、魷魚、海膽、蝦、雪螃蟹、海馬也可作為活性肽的蛋白質源。植物蛋白質常用的包括大豆、豆類（扁豆、鷹嘴豆、豌豆和豆類）、燕麥、小麥、火麻仁、油菜和亞麻籽。目前，選擇用于制備活性肽的蛋白質應該基于2個標準8：（1）使用未充分利用能夠進一

13、步增值且蛋白質含量豐富的食品工業(yè)副產物；（2）含有特定氨基酸序列或特定藥理氨基酸殘基的蛋白質。蛋白質的合理選擇，對提高目標肽的產率至關重要。4. 酶切位點的影響因素分析4.1. 溫度對酶切位點的影響4.1.1. 對專一性酶切位點的影響一般情況下，蛋白酶在最適溫度時酶切速率最大，偏離最適溫度時活性降低。溫度變化影響蛋白質的空間結構，從而影響了其對蛋白酶的親和力。例如溫度升高時，蛋白質底物中更多的酶切位點暴露出來，酶切更容易進行。研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度升高，蛋白質中更多的專一性酶切位點被水解，水解范圍更廣泛。Seronei Chelulei Cheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基

14、質輔助激光解吸電離飛行時間質譜）分析了溫度變化（25、37.5、和50）結合不同的堿性pH值（7.8、8.65、9.5）對胰蛋白酶水解-乳球蛋白模式的影響9。一般情況下，胰蛋白酶為肽鏈內切酶，水解賴氨酸或精氨酸的羧基與其它氨基酸（脯氨酸除外）形成的肽鍵。結果發(fā)現(xiàn)，隨著溫度升高，更多的賴氨酸殘基和精氨酸殘基被水解。在pH7.8和50的條件下水解10分鐘之后，所有可能的專一性酶切位點都被水解。因為脯氨酸能影響蛋白酶水解肽鍵，所以Lys47-Pro48未被水解。在25，只有-乳球蛋白的末端區(qū)域被酶解，然而，隨著溫度升高，-乳球蛋白中心區(qū)域也開始被水解。Blanca Hernandez-Ledesma

15、（2006）將牛的-乳球蛋白A（-Lg A）在非變性和變性加熱條件下用嗜熱菌蛋白酶水解，用HPLC-MS/MS確定水解過程中釋放的肽段10。一般情況下，嗜熱菌蛋白酶水解疏水性或芳香族氨基酸的氨基端肽鍵，例如亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和纈氨酸。在37反應5分鐘后，總共確定了水解產物中的25個肽段，這些肽段一直到更高的保溫溫度時才進一步水解。此外，在60和80之間的范圍內發(fā)現(xiàn)了新的酶切位點，這些酶切位點位于-乳球蛋白的最深埋區(qū)域。在60和80之間的范圍內水解30分鐘后所得產物中發(fā)現(xiàn)了三個新的肽段：LDA、LKPTPEGD、LQKW，相關的位點為Leu122-Val123、Glu127-Va

16、l128、Ala132-Leu133。但它們在37和5030分鐘水解物并沒有發(fā)現(xiàn)。其中的LQKW據(jù)報道是一種高效ACE抑制劑。溫度變化引起了-乳球蛋白構象的變化，使得這些肽鍵更容易被嗜熱菌蛋白酶水解。提高酶解溫度到60以上，可在更短保溫時間內釋放出肽段LQKW。4.1.2. 對非專一性酶切位點的影響隨著溫度升高，更多的酶切位點暴露出來，在加強專一性酶切的同時，也較易出現(xiàn)非專一性酶切現(xiàn)象。Seronei Chelulei Cheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜）分析了溫度變化（25，37.5，和50）結合不同的堿性pH值（7.8，8.65，9.

17、5）對胰蛋白酶水解-乳球蛋白模式的影響9。結果發(fā)現(xiàn)，水解環(huán)境也影響非特異性裂解，在較高溫度（50）下更容易出現(xiàn)胰凝乳酶式的酶切。胰凝乳蛋白酶，和胰蛋白酶一樣是消化道的絲氨酸蛋白酶。它催化的羧基端側的肽鍵水解的酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，其中都含有一個與疏水腔相匹配的芳環(huán)。此外，它也能水解亮氨酸的羧基端。此外，二次水解胰凝乳蛋白酶能水解蛋氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、組氨酸、甘氨酸和丙氨酸的羧基端。新出現(xiàn)的酶切位點為Leu10-Asp11、Gly17-Thr18、Ser21-Leu22、Ser30-Leu31、Tyr42-Val43、Thr49-Pro50、Val118-Cys119、

18、Leu133-Glu134、Tyr20-Ser21。相關的肽段為f(43-49)、f(21-30)、f(18-28)、f(11-21)和f(119-133)。只有一個肽（f（18-28）在25和37.5能酶切生成，而大部分片段只能在50下才能生成。胰蛋白酶出現(xiàn)胰凝乳蛋白酶式的酶切，可能是由于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的本質特性催化三聯(lián)體（His57、Asp102和Ser195）是相同的。此外，胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶約40的氨基酸序列是相同的。因此，在40以上時，催化中心發(fā)生了構象變化，允許更多的氨基酸結合，而這催化中心一般情況下是很緊密的。4.2. pH對酶切位點的影響酶蛋白分子上帶有很多酸性、堿

19、性氨基酸殘基，pH值的變化直接影響到這些殘基側鏈基團的解離狀態(tài)。pH值對酶解反應的影響主要有三個方面：（1）引起酶蛋白的空間結構變化；（2）改變酶蛋白中活性部位的解離狀態(tài)；（3）改變蛋白質底物的空間結構和解離狀態(tài)。4.2.1. 對專一性酶切位點的影響研究發(fā)現(xiàn)，在最適pH值專一性酶切位點水解速率最大，偏離最適pH值時出現(xiàn)了非專一性酶切位點。部分專一性酶切位點對蛋白酶解呈抵抗性。Julian R. Reid等（1997）研究了pH值（2.66.6）對凝乳酶水解-酪蛋白及其巨肽的影響11。凝乳酶能專一地切割-酪蛋白的Phe105-Met106之間的肽鍵。結果發(fā)現(xiàn)，在pH 4.6下-酪蛋白肽鍵Phe1

20、05-Met106的水解速率最大。Seronei Chelulei Cheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜）分析了溫度變化（25、37.5和50）結合不同的堿性pH值（7.8、8.65、9.5）對胰蛋白酶水解-乳球蛋白模式的影響9。結果發(fā)現(xiàn)，Lys60, Lys75和Lys77在pH7.8下的水解時間在15s之后，在pH8.65和pH9.5下則15s內能被水解。而且，Lys91-Val92和Lys138-Ala139在pH8.65下能抵制胰蛋白酶酶解，而Lys70-Ile71是在 pH 9.5。Lys101-tyr102在50、較高的pH值8

21、.65和9.5下能抵抗酶解，而在pH值7.8下卻不能。Seronei Chelulei Cheison等認為，堿性pH可能通過以下方式改變-乳球蛋白和/或胰蛋白酶的結構，從而影響鍵酶切。首先，結合較高溫度（50）和較高pH值（8.65、9.5）引起-乳球蛋白結構改變進而導致變性。在pH 9.5，羧基端的酪氨酸殘基也有影響，在該pH下開始去質子化，因此，對胰蛋白酶的親和力可能會受到影響。這些結果證實了水解條件變化對酶解模式的影響。在這些條件下未能水解一些肽鍵，可用以保護某些肽段，使酶解朝著某一特定目標產物進行。4.2.2. 對非專一性酶切位點的影響研究發(fā)現(xiàn)，在蛋白酶最適pH值和偏離最適pH值下均

22、檢測到了蛋白酶的非專一性酶切，在后者條件下發(fā)生的范圍更廣泛。Seronei Chelulei Cheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜）分析了溫度變化（25、37.5和50）結合不同的堿性pH值（7.8、8.65、9.5）對胰蛋白酶水解-乳球蛋白模式的影響9。結果發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶的酶切位點由羧基端變?yōu)榘被说默F(xiàn)象。在pH7.8下檢測到了精氨酸殘基氨基端的裂解，在pH7.8、8.65、9.5下均檢測到了精氨酸殘基氨基端的裂解。Julian R. Reid等（1997）研究了pH值（2.66.6）對凝乳酶水解-酪蛋白及其巨肽的影響11。結果發(fā)現(xiàn)，在pH

23、6.6下，檢測到了低濃度的肽段Phe18-Leu32、Ser33-Tyr42和Trp76-Phe105，在pH5.6及以下則發(fā)現(xiàn)了其互補肽段Tyr43-Gln75。這些是-酪蛋白每個pH值主要的TCA可溶二次水解產物，其相關的肽鍵為Phe17-Phe18、Leu32-Ser33、Tyr42-Tyr43和Gln75-Trp76。4.3. 溫度和pH值對酶切位點的共同影響研究發(fā)現(xiàn)，某些酶切位點只在特定的溫度和pH值裂解。肽鍵裂解的時間也有所差異，從而釋放出相應的肽段。這表明，可通過對酶解條件的控制而獲得某些擁有特定序列的肽或者保護某些重要的肽段。Seronei Chelulei Cheison等（

24、2011）使用MALDI-TOF-MS（基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜）分析了溫度變化（25、37.5和50）結合不同的堿性pH值（7.8、8.65、9.5）對胰蛋白酶水解-乳球蛋白模式的影響9。結果發(fā)現(xiàn)，在每個水解條件下的前15s，Lys8、Lys100、Arg124、Lys141和Arg148的羧基端酶切位點都被水解了?？赏ㄟ^-乳球蛋白的結構解釋，因為在反應起點，所有這些肽鍵位于暴露的氨基端和羧基端，容易被酶水解。在所有條件下的-乳球蛋白水解結果顯示，肽鍵Lys8-Gly9、Lys141-Ala142和Arg148-Leu149是初始酶切位點。在最優(yōu)條件37.5和pH7.8下，八個肽鍵在

25、最初的15s內被水解 ，而最多肽鍵的斷裂出現(xiàn)在50和pH7.8時，一共有10個。因為此條件下，-乳球蛋白的降解速率很高。此外，可能是因為較高的溫度引起蛋白結構變化，pH值7.8是胰蛋白酶的最適pH值，蛋白質更易被水解。這也符合為何-乳球蛋白的中心區(qū)域（Lys60、Lys75和Lys77）在此條件下也被水解了。Seronei Chelulei Cheison等將胰蛋白酶在最適溫度和pH（37.5，pH7.8）的酶解結果和25和pH7.8的進行比較，最適條件下的部分酶切位點在25和pH7.8下水解時間延長或不水解。例如Lys60-Trp61和Lys70-Ile71，在在25和pH7.8下10分鐘內

26、并未水解，而Lys75-Thr76，Lys77-Ile78，Lys83-Ile84，Lys91-Val92，Lys101-Tyr102，Lys135-Phe136，Lys138-Ala139的裂解時間比最優(yōu)條件（37.5，pH值7.8）長。這表明，可通過控制胰蛋白酶水解-乳球蛋白的條件來獲得某些特定的肽。結果還發(fā)現(xiàn)，在所有水解條件下，Arg124-Thr125和Arg148-Leu149的酶切割時間沒有差異，Arg40-Val41也幾乎相同。因此，精氨酸殘基的裂解受水解條件的影響更小一些。4.4. 金屬離子對酶切位點的影響部分金屬離子能作為蛋白酶的激活劑，金屬蛋白酶更是本身活性中心就含有金屬離

27、子（如鋅、鈷、鎳等），且依靠金屬離子催化肽鍵水解。另外，金屬離子也能和蛋白質底物結合引起蛋白質結構變化，從而對酶切位點造成影響。Jean-Francois Lapointe等（2003）研究了鈣離子對嗜熱菌蛋白酶水解-酪蛋白胰蛋白酶水解肽的影響12。結果發(fā)現(xiàn)，嗜熱菌蛋白酶水解-CN 1-25肽過程中，鈣離子的存在改變了一些肽段的釋放速度，特別是那些由Ser22-Ile23和Glu11-Ile12肽鍵裂解所得的肽。這些肽鍵都位于磷酸絲氨酰基附近。鈣離子和磷酸絲氨酸殘基的結合可能會引起肽結構的變化，反過來影響了這些特異性酶切肽鍵與酶之間的親和力。Jean-Francois Lapointe等認為磷

28、酸絲氨?；外}離子的相互作用能使負磷酸基團之間的靜電斥力，從而提高分子的靈活性。因此，加入鈣離子能加速肽段-CN 6-22和-CN 12-22的釋放，這兩個肽段含有-CN 1-25原始序列中4個磷酸絲氨酸殘基的完整酰基。5. 結論通過酶解蛋白制備活性肽有許多的優(yōu)點，但酶法存在一個問題，在酶解過程中，局部構象、三維結構、實驗條件、酶切位點附近的其它氨基酸以及其它偶然因素都會影響蛋白水解酶的酶切效果，從而產生很多不必要的副產物。研究蛋白酶酶切位點的影響因素，分析其酶切規(guī)律，提高目標肽的得率，具有重要意義。當溫度、pH值、金屬離子等水解條件變化時，蛋白酶酶切位點會發(fā)生不同程度的變化。（1）在最適溫度

29、和最適pH下，專一性酶切速率加快，不易出現(xiàn)非專一性酶切位點；（2）當偏離最適溫度和最適pH時，容易出現(xiàn)非專一性酶切位點。部分專一性酶切位點對蛋白酶酶切呈抵抗性。（3）金屬離子會影響某些肽段的釋放速率。這表明，控制酶解條件可以作為制備高得率目標肽的一種方法，更多的研究應該集中在酶切規(guī)律總結以及具體操作方法上。參考文獻:1張少斌,張力,梁玉金,等.生物活性肽制備方法的研究進展J.黑龍江畜牧獸醫(yī),2011,39(6):39-41.2魏宗友,潘曉花,季昀.生物活性肽的制備、功能及在動物生產中的應用研究進展J.中國飼料,2010,23:22-26.3尹樹花,郭麗梅,劉宏魏.酶解植物蛋白制備小分子肽的研究進展J.江西飼料,2010,11(4):11-14.4李建杰,葉磊,榮瑞芬.生物活性肽的酶法制備及分離鑒定研究進展J.食品研究與開發(fā),2012,33(2):195-199.5劉輝,張紀陽,孫漢昌,等. 基于馬爾科夫鏈的胰蛋白酶肽段蛋白酶切位點概率預測J.生物物理學報,2011,27(6):528-536.6 朱少娟,施用暉,樂國偉.超聲波對胰蛋白酶水解酪蛋白的影響J.食品與生物技術學報,2005,24(2):50-547郭紅英.麥胚蛋白酶解物的制備及其抗氧化功能研究D.江蘇大學,20098 Udenigwe C C,Aluko R E. Food Protein-Derived Bioact