藥學分子生物學

1、第一章 基因與基因組基因 (gene) ：是指合成有功能的蛋白質(zhì)、多肽或RNA所需的全部DNA序列（除部分病毒RNA），是基因組的一個功能單位?；蚪M（genome）：是指生物體一套完整的單倍體遺傳信息的總和，包括所有基因和基因間的區(qū)域。基因組的主要功能是貯存和表達遺傳信息，是物種及其個體之間區(qū)別和聯(lián)系的最本質(zhì)生物學特征?；蚪M學（genomics）：是研究生物基因組的結(jié)構(gòu)、功能及表達調(diào)控的一門科學。調(diào)控序列（順式作用元件）：一個基因的調(diào)控區(qū)和其結(jié)構(gòu)基因位于同一個DNA分子的相鄰部位，這種調(diào)節(jié)方式稱為順式調(diào)節(jié)，相應的DNA序列成為順式作用元件。（1）啟動子：RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的DNA

2、序列。 （2）增強子：能強化轉(zhuǎn)錄起始的一段DNA序列。（3）沉默子（4）終止子。反式作用因子：通過識別或結(jié)合順式作用元件上的核心序列從而參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。也稱轉(zhuǎn)錄因子。 原核生物基因組結(jié)構(gòu)特點:1. 具有類核結(jié)構(gòu)2. 以操縱子為功能單位/多順反子mRNA3. 結(jié)構(gòu)基因大多為單拷貝，編碼序列一般不重疊4. 結(jié)構(gòu)基因大多沒有內(nèi)含子5. 非編碼序列比例約為一半6. 含可移動 DNA 序列操縱子（operon）n 操縱子是原核生物的一段DNA序列，由幾個串聯(lián)排列的功能相關的結(jié)構(gòu)基因，加上調(diào)節(jié)序列組成的一個完整的連續(xù)的功能單位。n 操縱子結(jié)構(gòu)通常與啟動子區(qū)域有部分重疊，可通過代謝物與調(diào)節(jié)蛋白相互

3、作用而激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄，這是原核生物最常見的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方式。真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點1. 基因組龐大，為線狀雙鏈DNA2. 斷裂基因3. 非編碼區(qū)與單順反子 4. 大量重復序列5. 基因家族與假基因斷裂基因（split gene）:真核生物結(jié)構(gòu)基因由外顯子與內(nèi)含子間隔排列，內(nèi)含子在轉(zhuǎn)錄后被剪切掉。基因家族（multi gene family）：是來源相同，結(jié)構(gòu)相似，功能相關的一組基因，由某一共同祖先基因經(jīng)重復和突變產(chǎn)生。假基因（pseudogene）：與具正常功能基因序列相似，但無轉(zhuǎn)錄功能或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物無功能的基因。人類基因組計劃（HGP）HGP的主要目標: 遺傳圖譜：基因或DNA標記在染色體的相

4、對位置與遺傳距離。 物理圖譜：一級結(jié)構(gòu)上兩個DNA片段之間的實際距離。 序列圖譜：基因組DNA的全部核苷酸序列。 轉(zhuǎn)錄圖譜：正?；蚴芸貤l件全基因表達的時空圖。HGP的意義: 鑒定人類全部基因，推動生物技術發(fā)展。 理解疾病與基因的關系。 推動模式生物研究。 促進多學科發(fā)展與交叉融合。不同生物基因組結(jié)構(gòu)特點：病毒原核生物真核生物基因組較小，只含一種核酸 （DNA或RNA）具有類核結(jié)構(gòu)、通常一條環(huán)狀雙鏈DNA分子（基因組、質(zhì)粒DNA）基因組龐大，為多條線狀雙鏈DNA（細胞核、細胞器DNA）含有重疊基因以操縱子為功能單位（多順反子mRNA）斷裂基因存在轉(zhuǎn)錄單元結(jié)構(gòu)基因大多為單拷貝，編碼序列一般不重疊非

5、編碼區(qū)遠多于編碼區(qū)單順反子 噬菌體基因連續(xù)，感染真核細胞的病毒基因不連續(xù) 結(jié)構(gòu)基因大多沒有內(nèi)含子、是連續(xù)的存在大量重復序列編碼序列占絕大部分非編碼序列比例約為一半基因家族與假基因主要為單拷貝序列 （反轉(zhuǎn)錄病毒含有兩個拷貝）含可移動 DNA 序列 （轉(zhuǎn)座子）DNA末端具有端粒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組（proteome）：一個細胞、一個組織或者一個有機體的基因組表達的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學（proteomics）：闡明生物體各種生物基因組在細胞中表達的全部蛋白質(zhì)的表達模式及功能模式的學科。第二章 PCR、核酸雜交、基因芯片PCR基本原理：以待擴增的DNA為模板，以一對分別與模板互補的寡核苷酸片段為引物，在DN

6、A聚合酶作用下，以dNTP為底物，按照半保留復制的原理，通過變性、退火、延伸三個步驟完成新的DNA合成，并反復重復這一過程。PCR反應步驟： 高溫變性：94 獲單鏈模板 低溫退火：55 引物結(jié)合單鏈模板 適溫延伸：72 DNA新鏈合成PCR反應體系：DNA 模板、引物（決定PCR反應特異性）、耐熱DNA聚合酶、dNTP、緩沖體系 一、二價陽離子PCR與DNA復制的比較：相同點：n DNA合成反應n DNA聚合酶參與n 需要引物n 4種dNTP為原料不同點：n 體外反應n 僅合成特定DNA片段（由1對引物限定）n 變溫條件下進行n 僅一種耐熱的DNA聚合酶參與n DNA引物n 循環(huán)多次PCR反應

7、體系的優(yōu)化：特異性、有效性、忠實性1、DNA聚合酶：耐高溫、保真性、激活劑2、模板DNA：種類、用量 、質(zhì)量3、dNTP: 濃度一致、穩(wěn)定4、DNA引物：決定PCR擴增產(chǎn)物的特異性和長度。引物設計一般遵循的原則：長度；堿基隨機分布； 避免引物間、引物自身互補；引物的3端不能修飾、不應錯配；兩條引物之間退火溫度不大于5 oC。PCR技術的應用1) 基因克隆2) 基因檢測(1) PCR產(chǎn)物的限制性片段長度多態(tài)性分析 （PCR-RFLP)基因突變會導致基因序列中產(chǎn)生新的限制性核酸內(nèi)切酶位點或使原有限制性核酸內(nèi)切酶位點消失。 因此，突變基因經(jīng)相應的限制性核酸內(nèi)切酶水解后，其電泳條帶的數(shù)量和大小就會發(fā)生

8、改變，根據(jù)這些改變可以判斷突變是否存在，即限制性片段長度多態(tài)性技術。(2) PCR產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 (PCR-SSCP)q 基于單鏈DNA構(gòu)象差別來檢測點突變的方法。相同長度的單鏈DNA由于堿基組成或排列順序不同，形成不同的構(gòu)象。q 利用PCR擴增目的基因片段，通過變性成為單鏈，然后進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，單個核苷酸的改變會造成單鏈DNA片段構(gòu)象的改變，其遷移率隨之改變，從而檢測基因的突變。(3) PCR產(chǎn)物的等位基因特異性寡核苷酸探針雜交 (PCR-ASO)采用PCR擴增受檢者基因的目標片段，并與相應的ASO探針雜交。 針對已知突變位點的基因，設計一對寡核苷酸探針，其中一條為野

9、生型探針（N），與正常序列互補，另一個為突變型探針（M），突變堿基應位于探針的中央，與突變序列互補。PCR衍生技術（一）巢式PCR（二）逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)先將RNA用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再加入特異引物對目標片段進行擴增，擴增產(chǎn)物的分析與普通PCR類似。反轉(zhuǎn)錄酶：AMV和MoMLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄引物：隨機引物、Oligo (dT)、特異性引物用途：檢測基因表達水平；檢測RNA病毒（三）多重PCR在同一反應中采用多對引物同時擴增幾個不同的DNA片段的方法。優(yōu)點：多個致病基因同時檢測。（四）定量PCR實時熒光定量PCR在PCR反應體系中加入反應PCR擴增進程的熒光染料或熒光標記

10、探針，實時監(jiān)測PCR過程中熒光信號的變化，通過參照基因或標準曲線對起始模板DNA的濃度進行精確定量分析。實時熒光定量PCR原理q 如何對起始模板定量？通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析q 三個基本概念：擴增曲線、熒光閾值、Ct值擴增曲線圖：橫坐標：擴增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標：熒光強度q 熒光染料：SYBR Green I核酸分子雜交原理：核酸變性與復性核酸分子雜交技術用標記的已知序列的核酸片段（探針）來檢測樣品中未知核酸序列（形成異源雜交體），再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合的核酸的位置或大小顯示出來。 核酸探針（probe）能與待測的靶核酸序列特異性互補雜交，雜交后又能被特殊方法檢

11、測的已知被標記的核酸片段。 核酸探針類型q DNA探針： 基因組DNA探針；cDNA探針； 寡核苷酸探針 q RNA探針核酸探針標記物q 放射性標記物：32P, 3H ,35S靈敏度高; 但存在環(huán)境污染和半衰期短等缺點。q 非放射性標記物: 生物素、光敏生物素、地高辛、酶、熒光素等，但靈敏度和特異性較放射性標記物差。 核酸分子雜交技術應用n 固相雜交印跡雜交 (blotting hybridization)：Southern blot、Northern blot斑點雜交 (dot hybridization)原位雜交 (in situ hybridization)n 液相雜交印跡雜交的一般步驟

12、： 1. 樣品制備和電泳分離2. 樣品變性處理、轉(zhuǎn)印3. 探針制備和標記4. 預雜交與雜交 5. 洗去未雜交的游離探針6. 檢測雜交信號7. 結(jié)果判斷與分析印跡技術（blotting）將核酸或蛋白質(zhì)等生物大分子通過一定方式轉(zhuǎn)移并固定到固相支持物上以便進一步分析的方法。1. Southern blot (DNA檢測)通過核酸內(nèi)切酶降解樣品中DNA，再經(jīng)凝膠電泳分離，將分離后的DNA片段從凝膠轉(zhuǎn)移到吸附薄膜上并固定，隨后用標記的探針進行雜交，以檢測目的DNA。 步驟：1.DNA片段分離變性 2.DNA片段轉(zhuǎn)移與固定 3.雜交反應 4.雜交信號檢測2. Northern blot（RNA檢測）RNA

13、經(jīng)變性凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移固定到固相支持物上，與標記的探針雜交并檢測。（分析基因的轉(zhuǎn)錄和mRNA分子的大?。?。 3. Western blot（蛋白檢測）基本原理：通過電泳區(qū)分不同的蛋白組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物，通過特異性抗體作為探針，對靶蛋白（抗原）進行檢測。也稱為免疫印跡（immunoblotting）。主要用途：1. 鑒定蛋白質(zhì)表達情況 2. 比較不同樣本中特定蛋白質(zhì)相對表達量 3. 分析蛋白-蛋白間相互作用(蛋白質(zhì)組學研究)三種印跡技術的共同點基本步驟相同（電泳、轉(zhuǎn)印、雜交反應、雜交信號檢測）三種印跡技術的不同點Southern BlotNorthern BlotWestern Blo

14、t檢測對象DNA RNA 蛋白質(zhì)凝膠種類瓊脂糖瓊脂糖聚丙烯酰胺預處理（變性劑）限制性酶切NaOH甲醛熱變性SDS檢測探針DNAcDNA抗體原位雜交：在保持細胞形態(tài)的條件下，檢測與探針互補的核酸序列在細胞內(nèi)的空間位置。熒光原位雜交采用熒光標記的探針與待測樣本中的核酸進行原位雜交，從而檢測核酸序列在組織或細胞中的定性、定位及相對定量。 遺傳性疾病的產(chǎn)前診斷熒光原位雜交篩選21三體（間期）FISH檢測白血病細胞BCR-ABL融合基因 熒光原位雜交檢測上皮細胞中人乳頭瘤病毒的感染 基因芯片(gene chip) 將大量探針有序排列于固相支持物表面或直接在固相支持物上原位合成探針，然后與標記的待測核酸樣

15、品進行雜交，通過對探針分子雜交信號強度的分析來獲知樣品中相應分子的數(shù)量和序列信息。 由于常用計算機硅芯片作為固相支持物，所以稱為基因芯片。蛋白質(zhì)芯片 高通量的蛋白質(zhì)功能分析技術，用于分析蛋白質(zhì)表達譜，研究蛋白質(zhì)間或蛋白質(zhì)與其他分子間相互作用，篩選藥物作用蛋白靶點。 基本原理：將各種蛋白質(zhì)有序地固定于載體上成為檢測用的芯片，然后用標記的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用，洗去未結(jié)合的成分，再利用掃描技術測定芯片上各點的熒光強度，來分析蛋白質(zhì)間或蛋白質(zhì)與其他分子之間的相互作用關系。三、基因克隆、表達和調(diào)控基因克隆 五個基本部分：一、目的DNA的分離獲?。ǚ郑?；二、載體的選擇與限制酶切（切）；三、目的DNA

16、與載體連接（連）；四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞（轉(zhuǎn)）；五、重組體的篩選與鑒定（篩）。（一）目的基因的獲得化學合成基因組文庫與cDNA文庫：包含全面的基因和mRNA信息 基因組文庫（genomic library，G-文庫） 是指含有某種生物全部基因隨機片段的重組DNA克隆群。 cDNA文庫（cDNA library，C-文庫） 以細胞全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄，制備出全套的cDNA克隆集合。 利用PCR及RT-PCR擴增技術合成序列已知的基因其它技術（二）目的基因與表達載體的重組載體（vector）：攜帶外源DNA進入宿主細胞進行擴增或表達的工具。 按功能分：克隆載體；表達載體多克隆位點（MCS）：一

17、段人工合成的DNA序列，含有密集排列的多種限制性內(nèi)切酶識別序列，以便不同來源的外源DNA片段插入載體。 1. 限制性核酸內(nèi)切酶 識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的一類核酸內(nèi)切酶，為原核生物所特有。分類：、類基因工程技術中常用的是類（分子剪刀），識別位點與切割位點序列特異，且在識別序列內(nèi)切割 2. DNA連接酶（基因工程的“縫紉針”）一種封閉DNA鏈上缺口的酶，催化DNA鏈相鄰的3羥基與5磷酸基團生成磷酸二酯鍵。 3、目的基因與載體重組及其策略(一) 粘性末端連接缺點：載體自身環(huán)化；雙向插入；堿性磷酸酶（ALP）催化去除DNA、RNA或dNTP上的 5-磷酸基團。主要用途有：防止載體DNA自身

18、環(huán)化，提高重組效率。（二） 定向克?。菏鼓康幕虬凑_方向插入載體中的方法。 定向克隆的兩種連接方式：粘粘 連接：粘平 連接（三）人工接頭(linker)化學合成的含一種或多種限制酶切位點的平端雙鏈寡核苷酸片段。 本法適用于在載體和目的基因上沒有相同的限制酶切位點（四）同聚物加尾連接 本法適用于在載體和目的基因上沒有相同的限制酶切位點（五） PCR引入粘性末端后連接 可在PCR擴增目的基因時將限制性酶切作用位點人為添加到引物的5末端。以目的基因為模板，經(jīng)PCR擴增獲得帶有引物序列的目的基因，用相應的限制性核酸內(nèi)切酶切割后，產(chǎn)生粘性末端，隨后與載體（也經(jīng)相應的限制性核酸內(nèi)切酶切割）進行粘性末端連

19、接?；蚩寺≈谐Ｓ玫墓ぞ呙?、限制性核酸內(nèi)切酶用于切割DNA片段2、DNA連接酶用于催化DNA片段連接3、堿性磷酸酶去除核酸分子末端的磷酸基團 4、末端轉(zhuǎn)移酶介導DNA末端加尾，產(chǎn)生限制酶切作用位點5、DNA聚合酶常用于PCR擴增DNA6、逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA轉(zhuǎn)化：將重組質(zhì)粒導入受體細胞 轉(zhuǎn)染或稱為轉(zhuǎn)導：將噬菌體重組子或病毒重組子導入受體細胞質(zhì)粒：是在細菌內(nèi)除染色體之外的能自主復制到的共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA，隨著細菌分裂能夠穩(wěn)定地把自己的遺傳特性傳遞給子細胞。重組體的篩選和鑒定陽性克隆：含有目的基因的宿主細胞克隆。篩選出含有重組DNA(目的基因+載體)的克隆陽性克隆的篩選方法（一

20、）針對載體攜帶的篩選標記 根據(jù)遺傳表型進行篩選n 抗生素抗性篩選 n 遺傳標記補救篩選 n 噬菌斑篩選 （二）針對重組體結(jié)構(gòu)和表達產(chǎn)物篩選基因工程技術的應用：1. 制備基因組文庫、cDNA文庫、核酸探針、基因工程藥物、疫苗及抗體2. 制造轉(zhuǎn)基因動植物（改良生物性狀）3. 基因診斷、基因治療基因工程生產(chǎn)胰島素藥物流程：1，目的基因的獲?。和ㄟ^各種手段（基因組文庫，化學合成，PCR技術等）獲取胰島素基因。2，基因表達載體的構(gòu)建：用限制酶切割質(zhì)粒和目的基因（胰島素基因）使產(chǎn)生不同的粘性末端，再用DNA連接酶使質(zhì)粒和胰島素基因連接形成重組質(zhì)粒。3，將重組質(zhì)粒導入受體細胞（如大腸桿菌，用感受態(tài)細胞法即C

21、aCl2轉(zhuǎn)化法），篩選陽性重組體。4，將含有胰島素基因的陽性重組體在宿主細胞內(nèi)進行誘導表達、檢測、并純化表達產(chǎn)物。RNA干擾 ：在生物體細胞內(nèi)，雙鏈RNA分子誘導同源 mRNA特異性降解，導致基因表達抑制，又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默。RNA干擾作用機制（1）siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA（2）RISC (RNA-induced silencing complex)形成（3）RISC 活化：siRNA解旋成為單鏈，無活性的RISC轉(zhuǎn)變成活性形式 (包含siRNA反義鏈)（4）誘導靶mRNA降解：在siRNA反義鏈引導下，RISC識別并切割與siRNA反義鏈互補的靶mRNA（5）

22、dsRNA的再生成細胞中存在兩種RNA干擾現(xiàn)象：siRNA (小干擾RNA)：21-23nt，由長dsRNA裂解而成的小片段，可誘導mRNA降解。siRNA主要參與抵御外源性病毒核酸的侵染。 miRNA (微小RNA)：約22nt，由miRNA前體剪切而成，可抑制mRNA翻譯。 miRNA主要參與內(nèi)源性基因的表達調(diào)節(jié)。siRNA (小干擾RNA) miRNA (微小RNA)來源siRNA是外源性的，是RNA干擾的中間產(chǎn)物miRNA是內(nèi)源的是生物體固有結(jié)構(gòu)siRNA是雙鏈RNAmiRNA是單鏈RNADicer酶加工過程對稱地來源于雙鏈RNA不對稱加工，僅剪切miRNA的側(cè)臂作用位置siRNA可作

23、用于mRNA的任何部位miRNA主要作用于靶標基因 3端非翻譯區(qū)（3-UTR）作用方式siRNA一般導致靶mRNA的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。miRNA可抑制靶mRNA的翻譯，也可以導致靶mRNA降解，即在轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平起作用作用階段siRNA不參與生物生長，主要作用是抑制病毒感染miRNA主要在發(fā)育過程中起作用，調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達RNA干擾技術的應用q 基因治療（基因失活性治療）（1）病毒感染性疾病：通過RNAi抑制 RNA病毒的復制（2）基因過表達引起的疾?。ㄈ缒[瘤）：siRNA藥物q 基因功能研究（功能失活策略） 基因失活性治療：將特定的反義核酸（反義RNA、反義DNA）、核酶、si

24、RNA、miRNA等導入細胞，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平阻斷某些基因的異常表達?；蚴Щ钚灾委熋媾R的問題：1. 藥物的穩(wěn)定性2. 藥物的安全性3. 藥物的轉(zhuǎn)運載體基因靶向：利用同源重組原理對生物細胞特定的內(nèi)源基因進行改造的技術?；蚯萌耄和庠垂δ芑蚺c宿主基因組中的同源序列進行同源重組，插入到基因組中，從而在細胞內(nèi)獲得表達。基因敲除：宿主基因組中特定功能靶基因的部分片段被同源的外源DNA片段替代，從而使靶基因失活第七章 藥物基因組學藥物基因組學：是研究遺傳變異與藥物反應相互關系的一門學科，以提高藥物的療效及安全性為目標。單核苷酸多態(tài)性 (SNP)：在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性

25、。SNP:是RFLP、STR之后的第三代遺傳標記。SNP特點：1. 最常見可遺傳變異；2. 數(shù)量多分布廣；3. 具有遺傳穩(wěn)定性；4. 具有二態(tài)性，易于自動化規(guī)?；治觯?. 可直接影響基因功能SNP檢測技術：1. PCR技術；2. 核酸雜交技術；3. 生物芯片技術；4. DNA測序技術。單體型：位于一條染色體特定區(qū)域的一組相互關聯(lián)，并傾向于以整體遺傳給后代的單核苷酸多態(tài)組合。遺傳變異與藥物應答（一）基因多態(tài)性與藥物代謝（二）基因多態(tài)性與藥物轉(zhuǎn)運（三）基因多態(tài)性與藥物效應靶分子基因分型指導臨床用藥隨著藥物基因組學研究對多種基因多態(tài)性與藥物應答關系的逐漸闡明，隨著各種基因檢測和基因分型技術的快速發(fā)展，特