SNP檢測(cè)方法匯總

1、TaqMan SNP基因分型技術(shù)方法：此技術(shù)是由美國(guó)Life technologies公司研發(fā)的SNP分型技術(shù)，其技術(shù)原理如下簡(jiǎn)介。PCR 反應(yīng)時(shí)，加入一對(duì)兩端有不同熒光標(biāo)記的特異探針來識(shí)別不同的等位基因（allele1和allele2），5端為報(bào)告熒光基團(tuán)（reporter），3端為淬滅熒光基團(tuán) (quencher)。PCR過程中，兩個(gè)探針能與正向引物和反向引物之間的互補(bǔ)序列特異退火結(jié)合。當(dāng)探針以完整形式存在時(shí)，由于能量共振轉(zhuǎn)移，熒光基團(tuán)只發(fā)出微弱熒光。特異的探針與相應(yīng)的等位基因雜合后，DNA聚合酶發(fā)揮5到3外切酶活性，把報(bào)告熒光基團(tuán)切割下來，脫離了3端淬滅熒光基團(tuán)的淬滅作用 (quench

2、)，從而發(fā)出熒光。兩個(gè)探針的5端標(biāo)有不同的熒光 (FAM或VIC)，3端標(biāo)有MGB 淬滅基團(tuán)結(jié)合體。根據(jù)檢測(cè)到的不同熒光，可以判斷相應(yīng)的樣本的SNP 等位基因型。整個(gè)技術(shù)的示意圖如下：應(yīng)用領(lǐng)域：本方法適用于多個(gè)涉及到SNP分型的遺傳研究領(lǐng)域。尤其適合針對(duì)全基因組SNP關(guān)聯(lián)研究獲得的初步陽性位點(diǎn)，以及全基因組測(cè)序得到的大量初篩突變位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的大樣品驗(yàn)證研究。RFLP (多重?zé)晒?SNP分型技術(shù)已知的很多SNP位點(diǎn)正好位于限制性內(nèi)切酶的識(shí)別區(qū)域，針對(duì)這些SNP位點(diǎn)我們就可以使用此方法進(jìn)行SNP分型。尤其是對(duì)于大樣品量的多個(gè)SNP分型來說，此方法的優(yōu)勢(shì)較為明顯。技術(shù)方法：RFLP技術(shù)于1980年

3、由人類遺傳學(xué)家Bostein提出。它是第一代DNA分子標(biāo)記技術(shù)。DonisKeller利用此技術(shù)于1987年構(gòu)建成第一張人的遺傳圖譜。DNA分子水平上的多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)是進(jìn)行基因組研究的基礎(chǔ)。已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物進(jìn)化和分類的研究。RFLP是根據(jù)不同品種（個(gè)體）基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，或酶切位點(diǎn)之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，導(dǎo)致酶切片段大小發(fā)生了變化，通過電泳將其區(qū)分?，F(xiàn)在我們用熒光標(biāo)記其PCR引物，通過測(cè)序毛細(xì)管電泳來精確區(qū)分酶切片段大小，精度可以達(dá)到1bp的差異。通過對(duì)同一個(gè)位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物不同SIZE的引物設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了多樣本的多重酶切，大大降低了

4、檢測(cè)成本。我們可以利用限制性內(nèi)切酶的特殊屬性來對(duì)一些SNP進(jìn)行分型。有些SNP多態(tài)位點(diǎn)正好處于限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)處，其中一種多態(tài)對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增片斷能夠被相應(yīng)的內(nèi)切酶切動(dòng)，而另一種卻不能，因此通過對(duì)酶切后的PCR產(chǎn)物電泳后的片斷長(zhǎng)度分析可知檢測(cè)樣本在該位點(diǎn)處的基因型。如果檢測(cè)SNP位點(diǎn)不存在合適的酶切位點(diǎn)，往往可以通過在PCR引物3端改變個(gè)別堿基引入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，通過這種引物修飾法可以實(shí)現(xiàn)絕大多數(shù)SNP位點(diǎn)的分型都能用RFLP分析來實(shí)現(xiàn)。整個(gè)技術(shù)的示意圖(以KpnI酶切位點(diǎn)SNP為例)如下：現(xiàn)在我們通過熒光標(biāo)記PCR引物中的一條引物，另一條引物設(shè)計(jì)在序列的不同位置實(shí)現(xiàn)了，多位點(diǎn)擴(kuò)增

5、，多樣本一起酶切，酶切PCR產(chǎn)物通過跑測(cè)序毛細(xì)管電泳將其精確區(qū)分，大大降低其檢測(cè)成本。應(yīng)用領(lǐng)域：本方法涉及到很多需要對(duì)突變或者SNP多態(tài)進(jìn)行分型的遺傳研究領(lǐng)域。高溫連接酶檢測(cè)反應(yīng)技術(shù)多個(gè)SNP位點(diǎn)（3-8個(gè)）的分型項(xiàng)目，樣本量可以幾百個(gè)到上千個(gè)技術(shù)方法：連接酶檢測(cè)反應(yīng) (ligase detection reaction，LDR)是利用高溫連接酶實(shí)現(xiàn)對(duì)基因多態(tài)性位點(diǎn)的識(shí)別。高溫連接酶一旦檢測(cè)到DNA與互補(bǔ)的兩條寡聚核苷酸接頭對(duì)應(yīng)處存在著基因點(diǎn)突變類型的堿基錯(cuò)配，則連接反應(yīng)就不能進(jìn)行。如下左圖：右邊的探針與模板有一個(gè)堿基不配對(duì)，所以連接反應(yīng)不能進(jìn)行，沒有連接產(chǎn)物；左邊的探針與模板DNA完全互補(bǔ)，

6、故進(jìn)行連接反應(yīng)。通過溫控循環(huán)該特異性連接反應(yīng)可反復(fù)進(jìn)行，達(dá)到線性擴(kuò)增的效果。當(dāng)檢測(cè)到DNA與互補(bǔ)的兩條寡聚核昔酸接頭對(duì)應(yīng)處存在著堿基錯(cuò)配，則連接反應(yīng)就不能進(jìn)行。在同時(shí)存在著熒光標(biāo)記的探針時(shí)，由于前者與模板DNA互補(bǔ)，故它與下游探針的連接反應(yīng)得以進(jìn)行，而后者則無法與下游探針連接。在連接反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行測(cè)序儀檢測(cè)，檢測(cè)到的結(jié)果即為G，從而可認(rèn)定該SNP位點(diǎn)為G。LDR檢測(cè)方法利用長(zhǎng)度差異可以將多重LDR產(chǎn)物在ABI測(cè)序系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)多個(gè)SNP位點(diǎn)。應(yīng)用領(lǐng)域：本方法適用于多個(gè)涉及到SNP分型的遺傳研究領(lǐng)域。Multiplex SNaPshot 針對(duì)性的解決多個(gè)SNP位點(diǎn)（8-16個(gè)）的基

7、因分型項(xiàng)目，樣本量靈活，從幾百到上千個(gè)樣品。我公司利用由美國(guó)Life Technologies公司開發(fā)的SNaPshot技術(shù)，針對(duì)中等通量的SNP分型項(xiàng)目進(jìn)行了技術(shù)上的改進(jìn)大大提高了分型的通量和準(zhǔn)確性。SNaPshot又稱為小測(cè)序技術(shù)，是在一個(gè)含有測(cè)序酶，四種熒光標(biāo)記的ddNTP,緊挨多態(tài)位點(diǎn)5端的不同長(zhǎng)度延伸引物和PCR產(chǎn)物模板的反應(yīng)體系中，引物延伸一個(gè)堿基即終止，經(jīng)ABI測(cè)序儀跑膠后，根據(jù)峰的顏色可知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。通過針對(duì)不同的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的延伸引物來做到多個(gè)SNP在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行分型，目前我們已經(jīng)可以做到15個(gè)位點(diǎn)同時(shí)分型通量。由于此方法為四色熒光

8、標(biāo)記，所以可以針對(duì)各種SNP類型進(jìn)行分型，同時(shí)還可以對(duì)插入、缺失進(jìn)行分析。技術(shù)體系的示意圖如下：應(yīng)用領(lǐng)域：本方法適用于多個(gè)涉及到SNP分型的遺傳研究領(lǐng)域。尤其適合針對(duì)全基因組SNP關(guān)聯(lián)研究獲得的初步陽性位點(diǎn)，以及全基因組測(cè)序得到的大量初篩突變位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的大樣品驗(yàn)證研究。改進(jìn)的多重高溫連接酶檢測(cè)反應(yīng)技術(shù) 該技術(shù)適合大樣本（數(shù)百個(gè)以上）多位點(diǎn)（15-30個(gè)）的分型，能夠提高SNP分型的通量，大大降低分型成本。iMLDR技術(shù)是基于傳統(tǒng)的連接酶反應(yīng)經(jīng)過改進(jìn)后的具有天昊自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的多重SNP分型技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的連接酶反應(yīng)技術(shù)，iMLDR提高了準(zhǔn)確性和分型的成功率，經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)和雙盲樣本的初步驗(yàn)證

9、，該技術(shù)的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性超過98%，僅次于測(cè)序和SNaPshot。分型原理：應(yīng)用領(lǐng)域：本方法適用于多個(gè)涉及到SNP分型的遺傳研究領(lǐng)域。尤其適合針對(duì)全基因組SNP關(guān)聯(lián)研究獲得的初步陽性位點(diǎn)，以及全基因組測(cè)序得到的大量初篩突變位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的大樣品驗(yàn)證研究。SNPscan高通量SNP分型技術(shù) 適合于針對(duì)中等通量到大通量SNP位點(diǎn)的分型項(xiàng)目，至少800個(gè)以上樣本、48個(gè)以上的SNP位點(diǎn)；對(duì)絕大多數(shù)SNP位點(diǎn)都具有很好的分型效果。技術(shù)方法：SNPscan是由上海天昊生物科技有限公司自主專利開發(fā)的多重SNP分型專利技術(shù)，能在一個(gè)檢測(cè)流程中同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)48/96/144/192個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型。該技術(shù)基本原

10、理是采用連接酶連接反應(yīng)的高特異性實(shí)現(xiàn)對(duì)SNP位點(diǎn)等位基因的識(shí)別，然后通過在連接探針末段引入不同長(zhǎng)度的非特異序列以及通過連接酶加接反應(yīng)獲得位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的不同長(zhǎng)度連接產(chǎn)物，利用標(biāo)記熒光的通用引物對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過熒光毛細(xì)管電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，最后通過對(duì)GeneMapper軟件分析獲取各個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型。應(yīng)用領(lǐng)域：本方法可涉及到多個(gè)需要SNP分型的遺傳研究領(lǐng)域。適合對(duì)于大量候選生物通路或者候選染色體區(qū)域的基因SNP分型，尤其適合針對(duì)全基因組SNP關(guān)聯(lián)研究獲得的初步陽性位點(diǎn)，以及全基因組測(cè)序得到的大量初篩突變位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的大樣品驗(yàn)證研究。超高通量目的SNP分型技術(shù)-SNPseq高

11、效快速：每個(gè)反應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)數(shù)千個(gè)SNP位點(diǎn)分型檢測(cè)，同時(shí)可將上千個(gè)樣本標(biāo)記混在一起檢測(cè)，1臺(tái)IlluminaHiseq2500可以在3天之內(nèi)完成800萬個(gè)分型 ，而常規(guī)芯片只能單個(gè)或數(shù)個(gè)樣本同時(shí)檢測(cè)。應(yīng)用領(lǐng)域：本方法適用于很多的遺傳研究領(lǐng)域，例如疾病基因組研究、腫瘤基因組研究、臨床分子診斷研究、植物動(dòng)物基因組研究等，尤其適合大規(guī)模樣品多基因復(fù)雜性狀表型的相關(guān)基因的確定、腫瘤基因組體細(xì)胞突變研究等。SNP介紹：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs），即指由于單個(gè)核苷酸堿基的改變而導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性。在不同個(gè)體的同一條染色體或同一位點(diǎn)的核苷酸序

12、列中，絕大多數(shù)核苷酸序列一致而只有一個(gè)堿基不同的現(xiàn)象，這就是SNP。由于SNP在人類基因組中數(shù)量較多，發(fā)生頻率較高，因此被認(rèn)為是繼微衛(wèi)星之后的新一代遺傳學(xué)標(biāo)記，在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)、藥物遺傳學(xué)、疾病遺傳學(xué)、疾病診斷學(xué)、以及人類進(jìn)化等研究領(lǐng)域都有著很高的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。上海邃志生物科技在SNP位點(diǎn)分析和研究方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，擁有開展SNP研究的先進(jìn)儀器設(shè)備，具有自己獨(dú)到的研究策略和方法，并且已經(jīng)建立大樣本量人群的SNP基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫，能通過這些資源的有效挖掘，更好地幫助客戶開展SNP方面的研究工作，包括SNP的功能學(xué)研究。SNP檢測(cè)技術(shù)介紹及比較：質(zhì)譜分析法（mass spectrometry）該方

13、法利用質(zhì)譜分析對(duì)質(zhì)量的靈敏度特別高的特點(diǎn),很容易將僅含有一個(gè)不同堿基的兩段基因序列區(qū)別開的特點(diǎn),使用質(zhì)譜直接或間接檢測(cè)等位基因特異性延伸區(qū)的反應(yīng)產(chǎn)物,推導(dǎo)出SNP。單堿基延伸或其修飾形式與基質(zhì)輔助激光吸收/離子飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜結(jié)合已被廣泛的應(yīng)用,并已被美國(guó)公司(Sequenom)發(fā)展為商業(yè)性產(chǎn)品。我公司提供的SNP檢測(cè)技術(shù)服務(wù)，就是基于這樣的方法。DNA芯片技術(shù)（DNA chip）將已知序列的寡核苷酸DNA排列在1塊集成電路板上，將熒光標(biāo)記的正常DNA和突變DNA發(fā)別與2塊DNA芯片雜交，由于至少存在1個(gè)堿基的差異，正常和突變的DNA將會(huì)得到不同的雜交圖譜，經(jīng)過共聚集顯微鏡檢測(cè)兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)，確定是否存在突變。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(RFLP)RFLP技術(shù)利用限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別并剪切特定DNA序列的能力,檢測(cè)基因片段上限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)處是否存在核苷酸突變。應(yīng)用限制性內(nèi)切酶對(duì)兩個(gè)等位基因識(shí)別的差異,產(chǎn)生不同大小的切割片段,通過電泳遷移率的不同來判定是否存在SNP。實(shí)時(shí)熒光PCR分析法使用針對(duì)核酸中不同多態(tài)性序列的熒光Taqman探針，它們?cè)赑CR擴(kuò)增中被水解釋放熒光信號(hào)，只有與靶序列完全匹配