2011.3.3原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化.ppt

1、文獻(xiàn)匯報,2011.3.3,Company Logo,Company Logo,微生物學(xué)實(shí)驗教程 周德慶（酵母）,1、接種于液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 2、取培養(yǎng)液10ml，4000r/min離心5min, 棄上清液，用Tris-HCl(pH 7.4)、0.5mol/LEDTA、高滲緩沖液各洗滌一次。 3、用含10mmol/L巰基乙醇的高滲緩沖液稀釋裂解酶液。 4、加酶液，100r/min搖床50-100min酶解。脫壁效果達(dá)70%左右即停止酶解。 5、100r/min離心三分鐘，去沉淀，取上清。再2000r/min離心10min收集沉淀原生質(zhì)體。 6、高滲緩沖液洗滌2次，2000r/min離心10m

2、in收集原生質(zhì)體，最終用1ml高滲緩沖液懸浮原生質(zhì)體。,高滲緩沖液： 蔗糖0.5mol/L, MgCl2 10mmol/L,Tris-HCl(pH 7.4) 10mmol/L,Company Logo,1、原生質(zhì)體混合、PEG助融 2、雙層平板：底層10ml的固體培養(yǎng)基（1.2%瓊脂），將樣品加入5ml融化后的半固體培養(yǎng)基（0.6%瓊脂，預(yù)保溫42）中，快速混合，導(dǎo)入鋪有底層培養(yǎng)基的平板上。待上層凝固后，置于恒溫箱培養(yǎng),Company Logo,工業(yè)微生物育種學(xué) 施巧琴 吳松剛,*菌絲培養(yǎng)基： 1、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基 2、PDA培養(yǎng)基（一種普遍用于酵母菌和霉菌計數(shù)培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，被推薦用于各類

3、食品和飲料中酵母菌和霉菌檢測和計數(shù) ） 3、査氏培養(yǎng)基（用于真菌的分離鑒定，霉菌、白色念珠菌、酵母等微生物） *再生培養(yǎng)基：同查氏培養(yǎng)基，其中含NaCl濃度為0.8mol/L,Company Logo,*緩沖液：pH5.8-6.8磷酸氫二鈉-檸檬酸溶液 *高滲溶液：0.6mol/L NaCl溶液 *酶溶液：蝸牛酶、纖維素酶，用0.7mol/L的NaCl配制，G6砂芯漏斗抽濾除菌,Company Logo,取107個/mL的單孢子懸浮液 ，涂布于平板表面的玻璃紙上，培養(yǎng)后用無菌鑷子將培養(yǎng)菌絲體的玻璃紙轉(zhuǎn)移并倒復(fù)在已配好的酶液內(nèi)，輕輕抖動玻璃紙，菌絲體散落在酶液中，然后去玻璃紙，酶解，定時取樣觀察

4、。 （該法收集的菌絲體會十分干凈，免去了洗滌、離心等手續(xù)，減少對菌絲的傷害和雜菌污染） 酶解1-2h，將培養(yǎng)皿內(nèi)破碎菌絲體和原生質(zhì)體混合液用吸管吹吸數(shù)次，用G2或G3砂芯漏斗過濾，使原生質(zhì)體同菌絲體碎片分開，濾液1500-2000r/min離心10min，洗滌去上清，懸浮于同一高滲溶液中。再將含有原生質(zhì)體的濾液用再生培養(yǎng)基洗滌三次，以清除酶液，然后用保存液懸浮。血球計數(shù)板計數(shù)，冷藏備用。 雙層平板，再生，計算原生質(zhì)體再生率。,Company Logo,林艷學(xué)姐：,挑Aspergillus oryzae P5菌絲于葡萄糖-蛋白胨斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)67天，至孢子成黃綠色 取新鮮培養(yǎng)的斜面7支，用20

5、mL無菌水洗下成熟孢子于鋪滿玻璃珠的三角瓶中，置搖床上150r/min振蕩分散30min 經(jīng)四層無菌鏡頭紙過濾，制成孢子濃度約為107個/mL的單孢子懸浮液 將上述制得的孢子懸浮液每1mL接種于一瓶盛有50mL菌絲培養(yǎng)基的三角瓶中，于30靜止培養(yǎng)2325h 6000r/min，離心10min收集幼嫩的菌絲體 用無菌水洗滌菌絲體，4000r/min，離心5min收集菌絲體 用PBA溶液洗滌菌絲體兩次，每次4000r/min，離心5min收集菌絲體,Company Logo,以0.15g濕菌體用酶量1mL的比例，加入酶液，置于滅菌平板中,置33搖床上80r/min振蕩酶解，每半小時取樣，在顯微鏡下

6、觀察原生質(zhì)體的釋放情況 待酶解完全后，加等體積1mol/L山梨醇溶液，用四層無菌鏡頭紙過濾，除去未酶解的菌絲體殘片，收集原生質(zhì)體液 4000r/min室溫離心10min，收集原生質(zhì)體沉淀 去上清，沉淀用1mol/L 山梨醇溶液洗滌2次，每次4000r/min離心10min 棄上清將原生質(zhì)體懸浮于5mL 1mol/L 山梨醇溶液中，-70冰箱冷凍保存?zhèn)溆?Company Logo,將制備好的原生質(zhì)體溶液3200r/min，4離心10min； 棄上清，沉淀重懸于預(yù)冷的STC溶液中，將原生質(zhì)體濃度調(diào)整為5106 5107個細(xì)胞/mL； 將約25g質(zhì)粒DNA(體積不超過10L)與100L米曲霉原生質(zhì)體

7、置冰上輕輕混勻； 加入25L PTC溶液，冰浴20min； 加入1 mL PTC溶液，室溫放置15min； 最后加入2mL STC溶液，混勻。,將適量上述轉(zhuǎn)化液涂布于高滲再生基本培養(yǎng)基上，30培養(yǎng)57天，所長出的菌落即為轉(zhuǎn)化成功的菌株；同時設(shè)置未加質(zhì)粒而轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體涂布平板作為陰性對照。,Company Logo,菌絲培養(yǎng)基 葡萄糖含量為0.5%的葡萄糖-蛋白胨完全培養(yǎng)基。,高滲再生培養(yǎng)基 以1.2mol/L Sorbitol（山梨糖醇）配制的葡萄糖-蛋白胨基本固體培養(yǎng)基。,0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH6.0）：0.2 mol/L NaH2PO42H2O（約240mL）和0.2 mo

8、l/L Na2HPO412H2O（約60mL）混合至pH為6.0,Company Logo,混合酶液：2%纖維素酶，1%蝸牛酶，5mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）用pH6.0的含0.4 mol/L NH4Cl的0.2mol/L磷酸緩沖液配置混合酶液，經(jīng)0.45m微孔濾膜過濾除菌，保存于4,PTC溶液：25%PEG8000，50mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris-HCl (pH 7.5),STC溶液：1.2mol/L Sorbitol，50mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris-HCl (pH 7.5),Company Logo,1. 米曲霉C-2在2% G-P

9、斜面培養(yǎng)6天至長出孢子，滅菌去離子水洗下孢子，經(jīng)四層擦鏡紙過濾制成孢子懸液，接種于50mL 0.5%G-P菌絲全培養(yǎng)基，30靜置培養(yǎng)2325h； 2. 過濾收集菌體，用無菌水與0.8M NaCl各洗滌一次； 3. 菌體置于滅菌培養(yǎng)皿中，加入15ml 酶解液（2%纖維素酶、1%蝸牛酶、3mM DTT）； 4. 置30搖床（80r/min）酶解3h左右，在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的釋放情況； 5. 酶解完全后，四層擦鏡紙過濾，除去未酶解菌絲，離心收集原生質(zhì)體； 6. 用0.8M NaCl洗滌二次，0.8M NaCl-50mM CaCl2 洗滌一次； 7. 棄上清原生質(zhì)體重懸于100L 0.8M NaC

10、l-50mM CaCl2中，血球板計數(shù)。,王金良學(xué)長：,Company Logo,1、將構(gòu)建的pMD-pyrG質(zhì)粒與100L原生質(zhì)體置冰上輕輕混勻； 加入25L預(yù)冷PTC，冰浴30 min； 2、再加入500L上述PTC溶液，平靜混勻，室溫20min； 加入預(yù)冷1mL 0.8M NaCl-50mM CaCl2 ，混勻； 3、與100mL米曲霉高滲再生培養(yǎng)基混合，倒平板； 30培養(yǎng)4-7天。,Company Logo,Company Logo,取培養(yǎng)20h的康氏木霉菌絲體懸液10mL，4000r/min離心30min收集菌絲體，用無菌水4000r/min離心30min洗滌2次，加2.0%蝸牛酶溶

11、液30水浴酶解至原生質(zhì)體形成率接近100%時停止酶解，用0.6mol/L NaCl 5min條件下離心洗滌2次，最后將原生質(zhì)體懸于0.6mol/L NaCl溶液中。,在原生質(zhì)體制備過程中每隔一定時間取酶解液制成水封片于顯微鏡下觀察。,Company Logo,取原生質(zhì)體懸液1mL與5mL上層再生培養(yǎng)基混勻，傾倒于下層再生培養(yǎng)基平板上，待培養(yǎng)基凝固后于28培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。用下式計算再生率： 再生率（%）=（A-B）/C100% 式中：A為經(jīng)高滲溶液稀釋的原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基上長出的菌落數(shù)；B為經(jīng)無菌水稀釋的原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基上長出的菌落數(shù)；C為顯微鏡下計數(shù)的原生質(zhì)體數(shù)。,Company Logo,原生質(zhì)體制備,Company Logo,原生質(zhì)體再生,康氏木霉原生質(zhì)體制備的最適菌齡為22h，蝸牛酶濃度為2.0%，酶解溫度為30，酶解時間為2.5h，蝸牛酶溶液中的滲透壓穩(wěn)定劑為0.6mol/L NaCl，再生培養(yǎng)基中的滲透壓穩(wěn)定劑為0.8mol/L蔗糖,Company Logo,菌絲體培養(yǎng)60 h,用1. 5%溶菌酶+ 0. 5%蝸牛酶