《酶的分離純化》PPT課件.ppt

1、第三章 酶的分離純化與保存,酶的分離純化是酶學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)之一。 針對化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)的酶而言，其分離純化的方法主要沿用蛋白質(zhì)分離提純的方法。 酶的分離純化又有其自身特點(diǎn)： 難點(diǎn)：目標(biāo)酶在細(xì)胞中含量少 優(yōu)勢：可通過測定酶活性的方法進(jìn)行示蹤 酶的分離純化是一門實(shí)驗(yàn)科學(xué),酶的分離純化，就是將酶從細(xì)胞或者其他含酶的原料中釋放出來，再與雜質(zhì)分開，而獲得符合研究和使用要求的酶制品的過程,細(xì)胞結(jié)構(gòu)與酶分布,胞內(nèi)酶：在細(xì)胞中，酶在核糖體上合成后，即轉(zhuǎn)運(yùn)到各個作用部位，并不斷補(bǔ)充和更新 胞外酶：合成后穿過質(zhì)膜，定域到質(zhì)膜外表面、周質(zhì)空間、外膜及細(xì)胞外環(huán)境中的酶 不同的酶分離純化的方法不同：胞內(nèi)產(chǎn)物需經(jīng)細(xì)胞破

2、碎，細(xì)胞碎片分離等步驟；胞外產(chǎn)物則將細(xì)胞去除后，對余下的液體即可進(jìn)行初步純化,選用技術(shù)前，需考慮：,1.目標(biāo)酶分子特性及其他物理、化學(xué)性質(zhì) 2.酶分子和雜質(zhì)的主要性質(zhì)差異 3.酶的使用目的和要求 4.技術(shù)實(shí)施的難易程度 5.分離成本的高低 6.是否造成環(huán)境污染,不同酶的分離、提純方法，主要根據(jù)：,酶分子之間各種選擇性的差異 分子大小和形狀酸堿性質(zhì)溶解度吸收性質(zhì)對其他分子的生物學(xué)親和力 等等,酶的提取、分離純化技術(shù)路線,細(xì)胞破碎,酶提取,酶分離純化,酶濃縮,酶貯存,動物、植物或微生物細(xì)胞,發(fā)酵液,離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。,酶的分離純化可以分為三個階

3、段,1、粗蛋白：多使用鹽析沉淀法，可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)； 2、部分純化：使用各種層析法； 3、均質(zhì)酶：目標(biāo)酶的進(jìn)一步精制純化，常用電泳或者色譜法。,主要過程： 細(xì)胞破碎 酶的提取 離心分離 過濾 沉淀 層析 電泳 萃取濃縮干燥 結(jié)晶 保存。,一、酶分子制備的前處理,1、生物材料的選擇 選擇目的酶含量高的 選擇容易取材的 利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和基因工程重組DNA技術(shù)。 目前，酶的來源大都為來自微生物,材料選定后要盡可能保持新鮮，盡快加工處理，如暫不提取，應(yīng)冰凍保存，且動物材料則需深度冷凍保存：,動物組織要先除去結(jié)締組織、脂肪等，絞碎后在適當(dāng)?shù)娜軇┲刑崛　Ｈ绻蟮某煞衷诩?xì)胞內(nèi)，則要先破碎細(xì)

4、胞。 植物要先去殼、除脂。 微生物材料要及時將菌體與發(fā)酵液分開。,2、 細(xì)胞的破碎,將細(xì)胞和組織破碎，使酶分子（胞內(nèi)酶）充分釋放到溶液中，并不丟失生物活性。 不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細(xì)胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同 如動物臟器的細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅(jiān)固的纖維素、半纖維素組成的細(xì)胞壁，要采取專門的細(xì)胞破碎方法。,機(jī)械破碎,搗碎法 研磨法 勻漿法,物理破碎,溫度差破碎法 壓力差破碎法 超聲波破碎法,化學(xué)破碎,有機(jī)溶劑： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性劑： Triton、Tween,酶促破碎 （酶解破碎）,自溶法 外加酶制劑法,通過機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生的

5、剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。,通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。,通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎,通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎,細(xì)胞破碎方法及其原理,機(jī)械法（注意預(yù)冷）：,搗碎法：10000rpm 研磨法： 勻漿法：研桿和管壁間只有幾百微米,DY89-I型 電動玻璃勻漿機(jī),物理法：,反復(fù)凍融法：時間長，需加蛋白酶抑制劑（PMSF、EDTA等） 超聲波處理法：處理時間盡量短，避免局部過熱使得酶失活 滲透壓法： 冷熱交替法：,JY92-II D超聲波 細(xì)胞粉碎機(jī),高壓細(xì)胞破碎機(jī),化學(xué)與生物化學(xué)方法,自溶

6、法：利用細(xì)胞自身酶系，保持一定pH和溫度條件，使細(xì)胞破壞 有機(jī)溶劑處理法：通過有機(jī)溶劑對細(xì)胞膜的作用，使得細(xì)胞破碎（Tween,Triton，氯仿等） 酶解法：根據(jù)細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，加適當(dāng)?shù)拿钙茐募?xì)胞壁，并在低滲溶液中使細(xì)胞破碎 如：霉菌：幾丁質(zhì)酶, 酵母細(xì)胞：葡聚糖酶,3.生物大分子的提?。ǔ樘幔?“提取”是在分離純化之前將經(jīng)過預(yù)處理或破碎的細(xì)胞置于溶劑中，使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)不丟失生物活性的過程。 酶的定位不同，其提純難度也不相同 “固相轉(zhuǎn)入液相”，或“從細(xì)胞內(nèi)的生理狀況轉(zhuǎn)入外界特定的溶液中”。 相似相溶,酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，

7、選擇適當(dāng)?shù)娜軇?一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中（水、稀酸、稀堿、稀鹽溶液等） ，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中,提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。,為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。, 鹽溶液提?。?一般以低鹽溶液(0.05-0.2mol/L)為主。稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。 鹽溶：在低鹽濃度條件下，酶的溶解度隨鹽濃度增大而增大 鹽析：當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定界

8、限后，酶的溶解度隨著鹽濃度增大而降低,大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。,(2)稀酸（堿）溶液提取,在偏離等電點(diǎn)0.5左右，溶解度增大 根據(jù)等電點(diǎn)，選擇合適的pH 注意，不能采用極端pH值，操作時要注意避免局部過酸或過堿,(3)變性劑的使用,如：脲、胍等 膜（蛋白）酶，包涵體形式的酶等 有變性劑，蛋白結(jié)構(gòu)松散，易于溶解 去除變性劑，又可恢復(fù)原來構(gòu)象,典型的抽提液組成,離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑：蔗糖、KCl、NaCl等 pH緩沖劑：各種緩沖液 溫度效應(yīng)劑：DMSO、甘油 蛋白酶抑制劑：PMSF、亮肽素 抗氧化劑:DTT,巰基乙醇 重金屬絡(luò)

9、合劑：EDTA 增溶劑：Triton-100,（4） 有機(jī)溶劑提取,一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶。 常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時具有親水性和親脂性，因此常用來提取與脂結(jié)合較牢或含非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)、酶和脂類。,酶的主要提取方法,二、酶分離純化的基本技術(shù)（簡介）,溶解度：鹽析、沉淀 分子大?。弘x心、凝膠層析、過濾 電荷：離子交換層析、電泳 親和性：親和層析 萃取 結(jié)晶 等等,(一)沉淀 根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的 溶解度不同而分離,沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過程 溶解度的大小與溶質(zhì)和溶劑的化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)

10、有關(guān)，溶劑組分的改變或加入某些沉淀劑以及改變?nèi)芤旱膒H值、離子強(qiáng)度和極性都會使溶質(zhì)的溶解度產(chǎn)生明顯的改變。,水化膜,溶液中蛋白質(zhì)的聚沉,酶分子制備中最常用的幾種沉淀方法, 中性鹽沉淀（鹽析法）： 有機(jī)溶劑沉淀： 選擇性沉淀 等電點(diǎn)沉淀： 有機(jī)聚合物沉淀： 聚乙二醇,中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀。 優(yōu)點(diǎn)是：成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。操作簡單、安全。對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。,1、中性鹽沉淀,在鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)

11、象。,中性鹽的選擇,常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等，其中最重要的是（NH4）2SO4： 溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當(dāng)高的溶解度（酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，鹽析操作也要求在低溫下（04）進(jìn)行）, 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75的雜蛋白，純度提高了四倍。 不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用23mol/L的(NH4)2SO4保存可達(dá)數(shù)年之久。 可以分級沉淀:半飽和硫酸銨溶液可沉淀血漿球蛋白，而飽和硫酸銨溶液可沉淀血漿清蛋白。 價(jià)格便宜，廢液不污染環(huán)境。,影響鹽析的因素 鹽飽和度的影響 不同的蛋白質(zhì)，所需

12、的飽和度不同 蛋白質(zhì)濃度的影響 在相同的鹽析條件下，蛋白質(zhì)濃度越大越易沉淀 蛋白質(zhì)的濃度愈高，其它蛋白質(zhì)的共沉作用也愈強(qiáng)，分辨率降低，一般常將蛋白質(zhì)濃度控制在23 為宜,pH的影響但硫酸銨具腐蝕性且緩沖能力差，飽和溶液的pH值在4.55.5之間，使用時多用濃氨水調(diào)整到pH7左右。進(jìn)行鹽析時的pH，要選擇在被鹽析的蛋白質(zhì)的pI附近 溫度的影響 在高鹽濃度下，它們的溶解度隨溫度的升高反而降低。另外，高溫還易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)的鹽析一般在室溫下進(jìn)行。,注意事項(xiàng)：,添加固體時，要加粉末狀的鹽 并且緩慢分批添加 并緩緩攪拌，避免局部濃度過高 且注意不要產(chǎn)生泡沫,2、有機(jī)溶劑沉淀,有機(jī)溶劑對于許多蛋白

13、質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。,有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機(jī)溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20時水的介電常數(shù)為80，而82乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時，對于具有水膜的分子來說，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。,常用于酶的沉淀分離的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等,基本原理,有機(jī)溶劑沉淀主要是降低水溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，削弱溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，增加了蛋白質(zhì)分子間的相互作用，導(dǎo)

14、致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。 由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用 溶液介電常數(shù)的減少就意味著溶質(zhì)分子異性電荷庫侖引力的增加，使帶電溶質(zhì)分子更易互相吸引而凝集，從而發(fā)生沉淀。,優(yōu)點(diǎn)： 分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì) 只在一個比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。 沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機(jī)溶劑）。 缺點(diǎn)：對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。,3、選擇性變性沉淀法,利用蛋白質(zhì)、酶與核酸等生物大分子與非目的生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異，選擇

15、一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純，稱為選擇性變性沉淀法。 方法：加熱、大幅度改變pH，加有機(jī)溶劑（丙酮、乙醇等）、加重金屬離子如Ag+ 、Cu2 、Pb2 等、加有機(jī)酸如三氯乙酸、水楊酸、苦味酸、鞣酸、過氯酸等及表面活性劑。,4 、等電點(diǎn)沉淀法,等電點(diǎn)沉淀法是利用具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，在達(dá)到電中性時溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)分離的方法。 此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物,氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì) 由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，

16、效果不理想 因而此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。,5、 有機(jī)聚合物沉淀法,有機(jī)聚合物是六十年代發(fā)展起來的一類重要的沉淀劑，最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細(xì)菌和病毒。近年來廣泛用于核酸和酶的純化。 應(yīng)用最多的是聚乙二醇(PEG)，它的親水性強(qiáng)，溶干水和許多有機(jī)溶劑，對熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為600020000的 PEG。作用機(jī)制不明。,優(yōu)點(diǎn)： 操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。 沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子。 沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。,（二） 透析,利用透析袋把大分

17、子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。 袋內(nèi)：大分子量的生物大分子 袋外：鹽和小分子物質(zhì) 不斷擴(kuò)散透析到，直到袋內(nèi)外兩邊的濃度達(dá)到平衡為止。,（三） 過濾,過濾的分類及其特性 (根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同 ),四種常用膜分離過程的截留特性,超濾,超過濾即超濾，超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化。,優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，成本低廉，不需增加任何化學(xué)試劑，尤其是超濾技術(shù)的實(shí)驗(yàn)條件溫和，與蒸發(fā)、冰凍干燥相比沒有相的變化，而且不引起溫度、pH的變化，因而可以防止生物大分子的變性、失活

18、和自溶。,缺點(diǎn)：不能直接得到干粉制劑。對于蛋白質(zhì)溶液，一般只能得到1050的濃度。 超濾技術(shù)的關(guān)鍵是膜。 在生物大分子的制備技術(shù)中，超濾主要用于生物大分子的脫鹽、脫水和濃縮等。,（四）電泳,電泳是指在電場的作用下，這些帶電顆粒向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動。 電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。 瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。,瓊脂糖凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳,1、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE),聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacryl

19、amide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，這一聚合過程需要有自由基催化完成。,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）,SDS(十二烷基磺酸鈉)-陰離子表面活性劑即去污劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)舒展。并且每2個氨基酸與一個SDS結(jié)合，使得每個蛋白質(zhì)分子所帶電荷基本相同。這樣就消除了各種蛋白質(zhì)本身電荷上的差異，電泳遷移率只與蛋白質(zhì)分子量大小有關(guān),制備式電泳通常以不含 SDS 的原態(tài) disc-PAGE 進(jìn)行，以便回收具有活性的蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)樣本

20、要先經(jīng)過部分純化，否則效果不佳，并先以分析式電泳確定所要色帶的位置。,有幾個方法可以鑒定蛋白質(zhì)的位置： (1) Coomassie Blue 染色法; (2) 活性染色; (3) UV 照射呈像。定位后要把含有目標(biāo)酶的凝膠切出來，進(jìn)行電泳分離，獲得酶,（五）離心,離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。,密度梯度區(qū)帶離心法（簡稱區(qū)帶離心法）,差速離心法,（六）層析,層析法又稱色譜法（Chromatography），是一種

21、基于被分離物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性的不同，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相為固定的(稱為固定相)，另一個相則流過此固定相(稱為流動相)并使各組分以不同速度移動，從而達(dá)到分離。,層析分離方法,離子交換層析,凝膠滲透層析,親和層析,-利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù),酶與底物 酶與競爭性抑制劑 酶與輔助因子 抗原與抗體 酶RNA與互補(bǔ)的RNA分子或片段 RNA與互補(bǔ)的DNA分子或片段,（七）濃縮、干燥和結(jié)晶,濃縮：低濃度 高濃度 離心、沉淀、吸水劑（PEG、硅膠等） 蒸發(fā)濃縮：通過加熱或者減壓方法，使得溶液中部分溶劑汽化蒸發(fā)，常采用真空

22、濃縮。,酶高溫失活，一般在60以下，真空條件下進(jìn)行濃縮或干燥真空干燥，另外還有冷凍干燥、噴霧干燥、吸附干燥、氣流干燥等。,冷凍干燥,將酶液降溫到冰點(diǎn)以下，使之凍結(jié)成固態(tài)，然后在低溫狀態(tài)抽真空，使冰升華，得到干燥的酶制劑 酶質(zhì)量高，結(jié)構(gòu)完整，活力損失少，但是成本高，適合對熱敏感而價(jià)值較高的酶類,結(jié)晶,結(jié)晶與沉淀的區(qū)別 沉淀和結(jié)晶在本質(zhì)上同屬一種過程，都是新相析出的過程。兩者的區(qū)別在于構(gòu)成單位（原子、離子或分子）的排列方式不同 在條件變化緩慢時，溶質(zhì)分子具有足夠時間進(jìn)行排列，有利于結(jié)晶形成；相反，當(dāng)條件變化劇烈，強(qiáng)迫快速析出，溶質(zhì)分子來不及排列就析出，結(jié)果形成無定形沉淀。 由于只有同類分子或離子才

23、能排列成晶體，故結(jié)晶法具有高度的選擇性。,酶在結(jié)晶之前，酶液必須經(jīng)過純化達(dá)到一定的純度。總的趨勢是酶的純度越高，越容易進(jìn)行結(jié)晶。如果酶液純度太低，不能進(jìn)行結(jié)晶。 通常酶的純度應(yīng)當(dāng)在50%以上，方能進(jìn)行結(jié)晶。 不同的酶對結(jié)晶時的純度要求不同。 有些酶在純度達(dá)到50%時就可能結(jié)晶，而有些酶在純度很高的條件下也無法析出結(jié)晶。所以酶的結(jié)晶并非達(dá)到絕對純化，只是達(dá)到相當(dāng)?shù)募兌榷选?常用方法：鹽析結(jié)晶、有機(jī)溶劑結(jié)晶、透析平衡結(jié)晶、等電點(diǎn)結(jié)晶等。,三、分離純化方法的選擇及基本步驟,生物大分子能否高效率地制備成功，關(guān)鍵在于分離純化方案的正確選擇和各個分離純化方法實(shí)驗(yàn)條件的探索。選擇與探索的依據(jù)就是生物大分子

24、與雜質(zhì)之間的生物學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)上的差異。由本章前述的生物大分子制備的各種特點(diǎn)可以看出，分離純化方案必然是千變?nèi)f化的,四、分離提純操作要求,盡量減少酶活性的損失 低溫 05、有機(jī)溶劑：-15-20 抽提液加入EDTA（絡(luò)合金屬） 抽提液加入巰基乙醇（防止含-SH酶失活） 不能過度攪拌，以免產(chǎn)生大量泡沫，使酶變性 pH值和鹽濃度的控制 抗菌、抑菌 測定酶的比活力, 早期分離純化,特點(diǎn)：粗提取液中物質(zhì)成份十分復(fù)雜。欲制備的生物大分子濃度很稀。物理化學(xué)性質(zhì)相近的物質(zhì)很多。希望能除去大部分與目的產(chǎn)物物理化學(xué)性質(zhì)差異大的雜質(zhì)。對所選方法的要求：要快速、粗放。能較大地縮小體積。分辨力不必太高。負(fù)荷能力要大

25、?？蛇x用的方法：吸附；萃取；沉淀法（熱變性、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等）；離子交換（批量吸附）；親和層析等。,晚期分離純化,可選用的方法：吸附層析、鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、等電聚焦制備電泳、制備HPLC等。,注意的問題：,鹽析后要及時脫鹽。用凝膠過濾時如何縮小上樣體積，因?yàn)槟z層析柱的上樣體積只能是柱床體積的1/101/6，也可以使用串聯(lián)柱以加大柱床體積。必要時也可以重復(fù)使用同一種分離純化方法，例如分級有機(jī)溶劑沉淀，分級鹽析，連續(xù)兩次凝膠過濾或離子交換層析等。,分離純化步驟前后要有科學(xué)的安排和銜接，盡可能減少工序，提高效率。例如吸附不可以放在鹽析之后，以免大量鹽離子影響吸附效率；離子

26、交換要放在凝膠過濾之前，因?yàn)殡x子交換層析的上樣量可以不受限制，只要不超過柱交換容量即可。 分離純化后期，目的產(chǎn)物的純度和濃度都大大提高，此時對于很多敏感的酶極易變性失活，因此操作步驟要連續(xù)、緊湊，盡可能在低溫下（如在冷室中）進(jìn)行。得到最終產(chǎn)品后，必要時要立即冰凍干燥，分裝并寫明標(biāo)簽，20 或70保存,五、酶的活力測定與純度測定,1.酶的活力測定與比活性 評價(jià)提純方法好壞的指標(biāo) 總活力的回收率 反映提純過程中酶活力的損失情況 比活力提高的倍數(shù) 反映純化的效率 在酶純化的每個階段，都需要進(jìn)行上述測定 兩者合理安排，但通常不可兼顧，根據(jù)具體情況取舍。,2.純度鑒定：,方法很多，檢驗(yàn)是否還有繼續(xù)純化的必要 由于酶分子高度復(fù)雜，不同方法檢驗(yàn)出的結(jié)果可能不同 酶純度要注明：電泳純、層析純、HPLC純。,鑒定依據(jù)：,酶分子的大小、形狀：超速離心法、凝膠層析等 酶分子的電荷性質(zhì)：離子交換層析、電泳等 酶分子的化學(xué)性質(zhì)：一級結(jié)構(gòu)測序（N端或C端） 酶分子