新一代測序技術(shù)的原理

,Next-generationsequencingtechnologyoverview,Agenda,測序技術(shù)簡史第一代測序技術(shù)第二代測序技術(shù)第三代測序技術(shù),1測序技術(shù)簡史,1950,1960,1970,1980,1990,2000,2010,Inventionofpersonalgenomemachine,Inventionofopticalmappingsystem,1977年，英國人FredSanger發(fā)現(xiàn)，如果在DNA復(fù)制過程中摻入ddNTP，就會產(chǎn)生一系列末端終止的DNA鏈，并能通過電泳按長度分辨。不同末端終止DNA鏈的長度是由摻入到新合成鏈上隨機(jī)位置的ddNTP決定的。由此誕生了以Sanger命名的測序原理即雙脫氧鏈終止法測序原理。,5磷酸,3羥基,3,5-磷酸二酯鍵,核苷酸形成3,5-磷酸二酯鍵示意圖,核酸序列形成的基礎(chǔ),“雙脫氧末端終止”的含義,dNTP,終止物標(biāo)記方法,因為顏色不同，4種終止物可以在一起進(jìn)行反應(yīng)。,3730 xlSequenceMap,2005,2006,2007,Birthday,Principle,Pyrosequencing,Sequencing-by-Synthesis,Sequencing-by-Ligation,Roche454,GenomeAnalyzer/Hiseq2000,ABISOLiD,Next-generationsequencing/Deepsequencingtechnologymainplatforms,454測序原理,測序反應(yīng)以磁珠上大量擴(kuò)增的ssDNA為模板，在每一輪測序反應(yīng)中，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入，每次只進(jìn)入一個堿基。如果這種dNTP能與待測序列配對，則會在合成后釋放焦磷酸基團(tuán)。釋放的焦磷酸基團(tuán)會與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化酶反應(yīng)形成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化反應(yīng)體系中的熒光素分子并發(fā)出熒光。通過檢測熒光信號釋放的有無和強(qiáng)度，確定被測分子的序列。光信號由CCD攝像機(jī)檢測并反應(yīng)為峰。每個峰的高度（光信號）與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。反應(yīng)結(jié)束后，ATP和未摻入的dNTP由雙磷酸酶降解，淬滅光信號，并再生反應(yīng)體系。,454測序流程,待測DNA文庫的構(gòu)建將基因組DNA/cDNA片段打斷至400-800bp，將用于后繼的擴(kuò)增測序的接頭A和一段含有生物素的接頭B連接到DNA片段上，會產(chǎn)生含有接頭AA、AB、BB、BA四種DNA片段，然后與可結(jié)合生物素的磁珠結(jié)合，其中片段AA被洗脫掉，片段ABBABB結(jié)合到磁珠上，通過變性處理回收含有接頭A和接頭B的單鏈DNA。,EmulsionPCR將這些ssDNA分別單獨與水油包被的直徑大約28m的磁珠在一起孵育、退火，由于磁珠表面含有與接頭互補的寡聚核苷酸序列，因此ssDNA會特異地連接到磁珠上。同時孵育體系中含有PCR反應(yīng)試劑，因此可以保證每一個與磁珠結(jié)合的小片段都會在各自的孵育體系內(nèi)獨立擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物仍可以結(jié)合到磁珠上。反應(yīng)完成后，破壞孵育體系并富集帶有DNA的磁珠。經(jīng)過擴(kuò)增反應(yīng)，每一個小片段都將被擴(kuò)增大約100萬倍，從而達(dá)到下一步測序反應(yīng)所需的模板量。,測序?qū)y帶DNA的磁珠與其他反應(yīng)物混合物，放入PTP板中進(jìn)行測序。PTP板上含有很多直徑約為44m的小孔，每個小孔僅能容納一個磁珠，通過這種方法固定每個磁珠的位置以監(jiān)測接下的測序反應(yīng)。,454的特點,較高的測序通量，每個循環(huán)能產(chǎn)生總量為400-600Mb的序列。提高測序讀長，長度達(dá)到400bp，使得后繼的序列拼接工作更加高效、準(zhǔn)確。主要缺點是無法準(zhǔn)確測量同聚物的長度。例如當(dāng)待測序列中出現(xiàn)Poly(A)的情況下，測序反應(yīng)中會一次加上多個T，而加入T的數(shù)目只能從熒光信號的強(qiáng)度來推測，有可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確。因此454技術(shù)主要的錯誤不是來自核苷酸的替換，而是來自插入或缺失。,2005,2006,2007,Birthday,Principle,Pyrosequencing,Sequencing-by-Synthesis,Sequencing-by-Ligation,Roche454,GenomeAnalyzer/Hiseq2000,ABISOLiD,Next-generationsequencing/Deepsequencingtechnologymainplatforms,n=degeneratebasesz=universalbases,SOLiD的特點,通量大成本低序列短Ligase的方式雖然能一定程度避免phasing/pre-phasing，但增加的復(fù)雜度也降低了效率靈活性差，對小數(shù)據(jù)量測序不適用Two-basecoding,2005,2006,2007,Birthday,Principle,Pyrosequencing,Sequencing-by-Synthesis,Sequencing-by-Ligation,Roche454,GenomeAnalyzer/Hiseq2000,ABISOLiD,Next-generationsequencing/Deepsequencingtechnologymainplatforms,2Hiseq2000（Solexa）測序原理Solexa是一種基于邊合成邊測序技術(shù)(Sequencing-By-Synthesis，SBS)的新型測序方法。通過利用單分子陣列實現(xiàn)在小型芯片(FlowCell)上進(jìn)行橋式PCR反應(yīng)。由于新的可逆阻斷技術(shù)可以實現(xiàn)每次只合成一個堿基，并標(biāo)記熒光基團(tuán)，再利用相應(yīng)的激光激發(fā)熒光基團(tuán)，捕獲激發(fā)光，從而讀取堿基信息。,可逆阻斷技術(shù),合成第一個堿基,Cycle1:按順序加入反應(yīng)試劑,清除未反應(yīng)的堿基和試劑,激發(fā)堿基熒光并收集熒光信號去除阻斷基團(tuán)和熒光基團(tuán),Cycle2-n:重復(fù)前面的步驟,基于SBS的Solexa測序技術(shù),3Hiseq2000測序技術(shù)流程,制備芯片,模板雜交橋式PCR擴(kuò)增測序引物準(zhǔn)備測序,2,測序,測序生成basecalls,3,3.1文庫制備Solexa有三種不同的測序種類：Single-ReadSequencing單向測序Paired-EndSequencing雙向測序IndexedSequencing混合樣品測序這三種測序類型的文庫構(gòu)建大體一致，主要區(qū)別在于接頭。,Single-ReadSequencing,FragmentDNA,PCRenrichment,P7,PCRenrichment(cont.),Paired-EndSequencing雙向測序IndexedSequencing混合樣品測序,3.2芯片制備和測序,Cluster生成步驟:固定擴(kuò)增線性化阻斷引物雜交,Cluster生成化學(xué)步驟,cBOT,FlowCell,進(jìn)樣孔,出樣孔,Single-ReadSequencing(SR,單向測序),堿基片段雜交固定,diol,diol,1stcycle變性,堿基片段擴(kuò)增成簇,Cluster擴(kuò)增完成,OH,diol,diol,OH,ClusterStation結(jié)束,NaIO4,每一個基因簇就是信號收集照片上一個亮點,通過熒光信號讀取序列信息,TTTTTTTGT,TGCTACGAT,通過熒光信號讀取序列信息,3.3測序,Paired-EndSequencing(PE,雙向測序)和IndexedSequencing,SR與PE的FlowCell接頭對比,SingleRead,PairedEnd,OH,OH,Graftedflowcell芯片上的接頭,U,P7P5,DNA片段雜交和固定,1stcycledenaturation變性,堿基片段擴(kuò)增成簇,ClusterStation結(jié)束,ClusterAmplification擴(kuò)增后的