-蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能

,第1章蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,Chapter1Struction&functionofProtein,本章教學(xué)重點,蛋白質(zhì)元素組成特點，氨基酸結(jié)構(gòu)通式，氨基酸分類、三字英文縮寫符號；肽、肽鍵的概念；蛋白質(zhì)一、二、三、四級結(jié)構(gòu)的概念及其穩(wěn)定的主要化學(xué)鍵；二級結(jié)構(gòu)主要形式及結(jié)構(gòu)特點；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；變構(gòu)效應(yīng)的概念；蛋白質(zhì)兩性電離，膠體性質(zhì)，蛋白質(zhì)變性概念和意義，紫外吸收和呈色反應(yīng)；模體、結(jié)構(gòu)域、分子伴侶的概念；鹽析、電泳和分子篩效應(yīng)的原理。,概述,1.什么是蛋白質(zhì)?,蛋白質(zhì)(protein)是由許多氨基酸(aminoacids)通過肽鍵(peptidebond)相連形成的高分子含氮化合物。,2.蛋白質(zhì)的生物學(xué)重要性,2-1.蛋白質(zhì)是生物體重要組成成分分布廣：所有器官、組織、細胞的各個部分都含有蛋白質(zhì)。含量高：占人體干重的45；脾、肺及橫紋肌等高達80。,1）作為生物催化劑（酶）2）代謝調(diào)節(jié)作用3）免疫保護作用4）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和存儲5）運動與支持作用6）參與細胞間信息傳遞,2-2.蛋白質(zhì)具有重要的生物學(xué)功能,2-3.氧化供能,第1節(jié)蛋白質(zhì)的分子組成,Section1theMolecularComponentofProtein,蛋白質(zhì)的元素組成,蛋白質(zhì)元素組成的特點,各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近且恒定，平均為16。,通過測定生物樣品中的含氮量，再根據(jù)以下公式推算蛋白質(zhì)的大致含量：,主要有C、H、O、N和S。有些蛋白質(zhì)含有少量磷或鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質(zhì)還含有碘。,100克樣品中蛋白質(zhì)的含量(g%)=每克樣品含氮克數(shù)6.25100,1/16%,1.氨基酸,氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且多屬L-氨基酸（僅甘氨酸除外）。,氨基酸的結(jié)構(gòu)通式,1-1氨基酸的分類,1）非極性脂肪族氨基酸2）極性中性氨基酸3）芳香族氨基酸4）酸性氨基酸5）堿性氨基酸,*20種氨基酸的英文名稱、縮寫符號及分類如下:,1-1-1非極性脂肪族氨基酸(側(cè)鏈含烴鏈),1-1-2極性中性氨基酸(側(cè)鏈有極性但不帶電荷),1-1-3芳香族氨基酸(側(cè)鏈含芳香基團),1-1-4酸性氨基酸(側(cè)鏈含負性解離基團),1-1-5堿性氨基酸(側(cè)鏈含正性解離基團),幾種特殊氨基酸,脯氨酸（亞氨基酸）,半胱氨酸(含巰基),胱氨酸,1-2氨基酸的理化性質(zhì),1-2-1.兩性解離及等電點,等電點(isoelectricpoint,pI)在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。,氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。,怎樣確定氨基酸pI,酸堿滴定,根據(jù)酸堿基團pKa計算,中性氨基酸pI,酸性氨基酸pI,堿性氨基酸pI,1-2-2.紫外吸收,芳香族氨基酸的紫外吸收,Trp、Tyr(含共軛雙鍵)最大吸收峰在280nm附近。,大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法。,1-2-3茚三酮反應(yīng),氨基酸與茚三酮水合物共熱，大多可生成藍紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。由于此峰值與氨基酸的含量存在正比關(guān)系，可作為氨基酸定量分析方法。,(氧化脫羧脫氨),2.肽,2-1肽(peptide),*肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。,*肽鍵(peptidebond)是由一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵。,+,甘氨酰甘氨酸,肽鍵,*兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽,*肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。,*由十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。,N末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C末端：多肽鏈中有自由羧基的一端,多肽鏈有兩端,*多肽鏈(polypeptidechain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結(jié)構(gòu)。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,2-2幾種重要的生物活性肽,2-2-1.谷胱甘肽(glutathione,GSH),GSH過氧化物酶,GSH還原酶,NADPH+H+,NADP+,GSH與GSSG間的轉(zhuǎn)換,體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽,神經(jīng)肽(neuropeptide),2-2-2.多肽類激素及神經(jīng)肽,第2節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu),Section2theMolecularStructureofProtein,蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括一級結(jié)構(gòu)(primarystructure)二級結(jié)構(gòu)(secondarystructure)三級結(jié)構(gòu)(tertiarystructure)四級結(jié)構(gòu)(quaternarystructure),1.蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈中氨基酸的排列順序。穩(wěn)定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵是肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)，但不是唯一的因素。,2.蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈中某個肽段的主鏈骨架原子的相對空間位置。主鏈骨架原子包括N(H)，C(O)和相鄰的2個C。穩(wěn)定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵是氫鍵。,2-1肽單元或肽單位(peptideunit),參與肽鍵的6個原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所處的位置為反式(trans)構(gòu)型，此同一平面上的6個原子構(gòu)成了所謂的肽單元。,2-2二級結(jié)構(gòu)的主要形式,-螺旋(-helix)-折疊(-pleatedsheet)-轉(zhuǎn)角(-turn)無規(guī)卷曲(randomcoil),2-2-1-螺旋,肽段主鏈圍繞中心軸做有規(guī)律的螺旋式上升,螺旋走向為順時針(右手螺旋).肽單位(肽平面)圍繞N-C鍵旋轉(zhuǎn)57(Phi角)或繞C-C鍵旋轉(zhuǎn)47(Psi角).氨基酸側(cè)鏈伸向螺旋外側(cè).每3.6個氨基酸殘基上升一圈(360),螺距為0.54nm.每個肽鍵的N-H和第四個肽鍵的C=O形成與長軸平行的氫鍵.2C間距0.15nm。,影響-螺旋形成的因素,氨基酸結(jié)構(gòu)剛性(Pro)氨基酸形成離子鍵或靜電斥力(Glu/Asp/His/Lys/Arg)氨基酸側(cè)鏈大小(Val/Ile),2-2-2-折疊,伸展(2C間的距離達0.35nm)瘦長/彎曲/桶狀，兩鏈同向或反向在不同鏈或同一條鏈不同片段形成氫鍵側(cè)鏈突出在折疊的上方或下方強度大,有剛性,2-2-3-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲,-轉(zhuǎn)角,無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)構(gòu)。,常由4個AA殘基組成1stAA-C=O與4thAA-N-H形成氫鍵2ndAA是Pro或Gly/Asp/Asn/Trp形似發(fā)夾反向常見于反向平行末端,2-3超二級結(jié)構(gòu)(模體/模序，motif),二級結(jié)構(gòu)組合形式如：，。,在許多蛋白質(zhì)分子中，二個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近所形成的有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)組合，被稱為模體(motif)。模體是賦予功能含義的超二級結(jié)構(gòu)。,鈣結(jié)合蛋白中結(jié)合鈣離子的模體,鋅指結(jié)構(gòu),2-4側(cè)鏈對二級結(jié)構(gòu)形成的影響,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是以一級結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側(cè)鏈適合形成-螺旋或-折疊，它就會出現(xiàn)相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)。,theconformationalpreferencesofthe20AAsforthe-helix,3.蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu),整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布。在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進一步折疊形成天然結(jié)構(gòu)/功能結(jié)構(gòu)穩(wěn)定因素：疏水鍵、離子鍵、氫鍵和VanderWaals力等。,肌紅蛋白(Mb)三級結(jié)構(gòu),3-1結(jié)構(gòu)域(domain),較大的蛋白質(zhì)分子中折疊形成的結(jié)構(gòu)較為緊密的具獨特空間構(gòu)象的并各行其功能的局部區(qū)域稱之,纖連蛋白分子的結(jié)構(gòu)域,3-2分子伴侶(chaperon),*熱休克蛋白70(Hsp70),*伴侶蛋白(chaperonin)(如Hsp60/GroEL、GroES),*核質(zhì)蛋白(nucleoplasmin),是為加速蛋白質(zhì)折疊成天然構(gòu)象或形成四級結(jié)構(gòu)提供合適微環(huán)境的一類蛋白質(zhì)。,*分子伴侶可逆地與未折疊肽段的疏水部分結(jié)合隨后松開，如此重復(fù)進行可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確折疊。,*分子伴侶也可與錯誤聚集的肽段結(jié)合，使之解聚后，再誘導(dǎo)其正確折疊。,*分子伴侶在蛋白質(zhì)分子折疊過程中二硫鍵的正確形成起了重要的作用。,4.蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。含有二條或多條多肽鏈的蛋白質(zhì)分子中，每條具有完整三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈稱為蛋白質(zhì)的亞基(subunit)。亞基間的結(jié)合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。由2個亞基組成的蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)中，若亞基分子結(jié)構(gòu)相同，稱之為同二聚體(homodimer)，若亞基分子結(jié)構(gòu)不同，則稱之為異二聚體(heterodimer)。,血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu),5.蛋白質(zhì)組學(xué),蛋白質(zhì)組是指一種細胞或一種生物所表達的全部蛋白質(zhì)，即“一種基因組所表達的全套蛋白質(zhì)”。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細胞或機體全部蛋白質(zhì)的表達及其活動方式(包括翻譯后修飾、轉(zhuǎn)運定位、結(jié)構(gòu)變化、蛋白質(zhì)間相互作用等)，揭示蛋白質(zhì)功能與生命活動規(guī)律的一個新的研究領(lǐng)域。,蛋白質(zhì)組學(xué)是高通量，高效率的研究，其研究技術(shù)平臺：雙向電泳分離樣品蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)點的定位、切取蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)組學(xué)研究的科學(xué)意義闡明生命在生理或病理狀態(tài)下的變化規(guī)律疾病診斷、新藥篩選、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等,第3節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,Section3TheRelationofStructure&FunctionofProtein,1.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,1-1一級結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ),天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、-巰基乙醇,去除尿素、-巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,牛核糖核酸酶,1-2一級結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)具有相似的高級結(jié)構(gòu)和功能,1-3一級結(jié)構(gòu)提供重要的生物進化信息,細胞色素(cytochromeC)的進化樹,同一種蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)差異愈小，物種間進化愈接近,1-4一級結(jié)構(gòu)改變可引起疾病,例如：鐮刀形紅細胞貧血,由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病”。,2.蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,2-1Hb亞基與Mb空間結(jié)構(gòu)相似，都具有運輸氧氣的功能,Mb,Hb,Hb,HbA,2-2Hb亞基構(gòu)象變化可影響亞基與氧結(jié)合,Hb與O2結(jié)合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數(shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。,Hb和Mb的氧結(jié)合/解離曲線,S型,矩型,變構(gòu)效應(yīng)(allostericeffect),又稱別構(gòu)效應(yīng)。是指寡聚體蛋白質(zhì)與其配體結(jié)合后，引起該蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化，而導(dǎo)致其活性改變的現(xiàn)象。,*協(xié)同效應(yīng)(cooperativity),寡聚體蛋白質(zhì)的一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中其他亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱之。如果是促進作用則稱為正協(xié)同效應(yīng)(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負協(xié)同效應(yīng)(negativecooperativity),血紅素與氧結(jié)合后，鐵原子半徑變小，就能進入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。,2-3蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病,若蛋白質(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導(dǎo)致疾病發(fā)生。這類疾病如：人紋狀體脊髓變性病、腦退行性疾病、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。,有些蛋白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。,第4節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),Section4ThePhysical&ChemicalCharactersofProtein,1.蛋白質(zhì)的兩性解離,蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下可解離成帶負電荷或正電荷的基團。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(isoelectricpoint,pI)。,2.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至數(shù)百萬kD，其分子的直徑可達1100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體的因素：顆粒表面電荷、水化膜。,水化膜,溶液中蛋白質(zhì)的聚沉,3.蛋白質(zhì)的變性、凝固和沉淀,蛋白質(zhì)的變性(denaturation)是在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。變性蛋白質(zhì)的特征：,（二硫鍵、非共價鍵破壞，溶解度降低，黏度增加，不易結(jié)晶，易沉淀，易被蛋白酶水解，生物學(xué)活性喪失）,造成變性的因素如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等。,應(yīng)用舉例臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌。此外,防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。,若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性(renaturation)。,天然狀態(tài)，有催化活性,非折疊狀態(tài)，無活性,尿素、-巰基乙醇,去除尿素、-巰基乙醇,*蛋白質(zhì)沉淀在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融合相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。,*蛋白質(zhì)的凝固作用(proteincoagulation)蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。,4.蛋白質(zhì)的紫外吸收,由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。,5.蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng),茚三酮反應(yīng)(ninhydrinreaction)蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。,雙縮脲反應(yīng)(biuretreaction)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。,Peptidesandproteins(long-chainpolypeptides)reactwithCu2+inalkalinitytocreateablueviolet/redcolor.Thepeptidemusthaveatleast2peptidebonds.So,aminoacids,第5節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析,Section5Separation,Purification&AnalysisofProtein,（自學(xué)）,1.透析及超濾,*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。,*超濾法應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。,2.丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀,*使用丙酮沉淀時，必須在04低溫下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*鹽析(saltprecipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。,*免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。,3.電泳,蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。,幾種重要的蛋白質(zhì)電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。*等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。,4.層析,層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質(zhì)的目的。,蛋白質(zhì)分離常用的層析方法*離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進行分離。*凝膠過濾(gelfiltration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。,5.超速離心,*超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量。,*蛋白質(zhì)在離心場中的行為用沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient,S)表示,沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān)。,因為沉降系數(shù)S大體上和分子量成正比關(guān)系，故可應(yīng)用超速離心法測定蛋白質(zhì)分子量，但對分子