細(xì)菌典型生理生化鑒定技術(shù).pptx

細(xì)菌典型生理生化鑒定技術(shù),第一節(jié)細(xì)菌的生化試驗(yàn),一、概述,（一）、什么是生化試驗(yàn)?指通過(guò)利用生物化學(xué)的方法來(lái)測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物、代謝方式和條件等來(lái)鑒別細(xì)菌的類(lèi)別、屬種的試驗(yàn)。,（二）檢驗(yàn)細(xì)菌的生化試驗(yàn)范圍,1、糖（醇）類(lèi)代謝試驗(yàn)2、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)3、有機(jī)酸鹽和銨鹽的利用試驗(yàn)4、呼吸酶類(lèi)試驗(yàn)5、毒性酶類(lèi)試驗(yàn),（三）生化試驗(yàn)的方法,在培養(yǎng)物中加入某種底物與指示劑,經(jīng)接種、培養(yǎng)后,觀察培養(yǎng)基的pH值變化。在培養(yǎng)物中加入試劑，觀察它們同細(xì)菌代謝產(chǎn)物所生成的顏色反應(yīng)。根據(jù)酶作用的反應(yīng)特性，測(cè)定酶的存在。根據(jù)細(xì)菌對(duì)理化條件和藥品的敏感性，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。,（四）生化試驗(yàn)的注意事項(xiàng),1、待檢菌應(yīng)是新鮮培養(yǎng)物。培養(yǎng)1824h。2、待檢菌應(yīng)是純種培養(yǎng)物。3、遵守觀察反應(yīng)的時(shí)間。觀察結(jié)果的時(shí)間，多為24或48小時(shí)。4、應(yīng)做必要的對(duì)照試驗(yàn)。5、提高陽(yáng)性檢出率，至少挑取23待檢的疑似菌落分別進(jìn)行試驗(yàn)。,二、糖醇類(lèi)代謝試驗(yàn),（一）糖醇類(lèi)發(fā)酵試驗(yàn)（二）葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗(yàn)（三）V-P試驗(yàn)（四）甲基紅（MethylRed）試驗(yàn)MR（五）七葉苷水解試驗(yàn)（六）甘油品紅試驗(yàn),（一）糖醇類(lèi)發(fā)酵試驗(yàn),原理：不同的細(xì)菌對(duì)各種糖醇的分解能力及所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各不同，有的能分解多種糖醇，有的只能分解12種糖醇，有的分解糖醇能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的分解糖醇只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，根據(jù)這些特點(diǎn)，可鑒別細(xì)菌。,1、常用的糖醇,單糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖雙糖：乳糖、蔗糖、麥芽糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇類(lèi)：甘露醇、山梨醇、肌醇、衛(wèi)茅醇,2、試驗(yàn)方法：,用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于糖發(fā)酵管中，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。置361.0培養(yǎng)13天，每天觀察結(jié)果。,3、結(jié)果觀察和記錄,記錄：產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，陽(yáng)性，以“+”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陽(yáng)性，以“”表示不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陰性，以“-”表示,氣泡,導(dǎo)管,氣泡,氣泡,陽(yáng)性,陽(yáng)性,陰性,培養(yǎng)基變?yōu)辄S色,培養(yǎng)基未變色、無(wú)氣泡產(chǎn)生,（二）葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗(yàn),1、原理：細(xì)菌對(duì)葡萄糖的分解，分為氧化型和發(fā)酵型。氧化型細(xì)菌在有氧的條件下才能分解葡萄糖，無(wú)氧的條件下不能分解葡萄糖；發(fā)酵型細(xì)菌在有氧無(wú)氧條件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的細(xì)菌稱(chēng)為產(chǎn)堿型。根據(jù)糖管的色澤變化可鑒別細(xì)菌。,2、方法,取待檢菌，以穿刺法接種于兩管葡萄糖半固體培養(yǎng)基上，在其中一管加入一層（約1cm）滅菌的液體石蠟以隔絕空氣，在37培養(yǎng)24h天，每天觀察結(jié)果。,3、結(jié)果觀察與記錄,（三）V-P試驗(yàn),1、原理：某些細(xì)菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸經(jīng)縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為雙乙酰，在-萘酚和肌酸的催化作用下，雙乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱(chēng)VP（+）反應(yīng)。,2、試驗(yàn)方法,（1）奧梅拉（OMeara）法（2）貝立脫（Barritt）氏法（3）快速法,（）奧梅拉法：,將試驗(yàn)菌接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于361培養(yǎng)48h，每1mL培養(yǎng)液加奧梅拉OMeara試劑0.1mL，搖動(dòng)試管12min，靜置于37恒溫箱4h，或在4850水浴放置2h后判定結(jié)果。,（2）貝立脫法：,將試驗(yàn)菌接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于361培養(yǎng)2天，每2mL培養(yǎng)液先加入6%a-萘酚純酒精溶液1mL，再加40%氫氧化鉀水溶液0.4mL，搖動(dòng)25min，陽(yáng)性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無(wú)紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或361培養(yǎng)4h，如顯現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，呈黃色或有類(lèi)似銅色者，可判定為陰性。,（3）快速法：,將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中，挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動(dòng)后放置5min，判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。,3、結(jié)果觀察與記錄,（1）發(fā)酵管出現(xiàn)紅色者，為陽(yáng)性，記V-P+（2）發(fā)酵管為黃色或銅綠色者，為陰性，記V-P-,（四）甲基紅試驗(yàn)（MR）,1、原理細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸后，由于代謝的途徑不同，有的細(xì)菌可使丙酮酸轉(zhuǎn)化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，使培養(yǎng)基pH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅色，為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性；有的細(xì)菌使丙酮酸脫羧后形成酮、醇類(lèi)中性產(chǎn)物，培養(yǎng)液pH5.4，甲基紅指示劑呈桔黃色，為甲基紅試驗(yàn)陰性。,2、試驗(yàn)方法,挑取新鮮的待試培養(yǎng)物少許，接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于361或30（以30較好）培養(yǎng)35天，從第48h起，每日取培養(yǎng)液1mL，加入甲基紅指示劑12滴，立即觀察結(jié)果。,MR-VP試驗(yàn)原理及照片,V-P,3、結(jié)果觀察與記錄,（1）呈鮮紅色或橘紅色為陽(yáng)性，呈淡紅色為弱陽(yáng)性，記MR+；（2）呈橘黃色或黃色為陰性，記MR-，迄至發(fā)現(xiàn)陰性并培養(yǎng)至第5天仍為陰性，即可判定結(jié)果。,MR+,MR-,（五）七葉苷水解試驗(yàn),、原理：七葉苷被細(xì)菌分解后，生成葡萄糖和七葉素，七葉素與Fe2+結(jié)合，生成黑色化合物，使培養(yǎng)基呈黑色，以此鑒別細(xì)菌。,2、試驗(yàn)方法,將待試純培養(yǎng)物少許，接種于七葉苷培養(yǎng)基，于361培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果。,3、結(jié)果觀察與記錄,（1）培養(yǎng)基變?yōu)楹谏蜃睾谏?，為?yáng)性，記錄為+（2）培養(yǎng)基不變色者，為陰性，記錄為-,（六）甘油品紅試驗(yàn),1、原理：某些細(xì)菌可分解甘油成為丙酮酸，并進(jìn)一步脫羧生成乙醛，乙醛與無(wú)色品紅生成醌式化合物，呈深紫紅色，以此鑒別細(xì)菌。,2、試驗(yàn)方法,取待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，接種于甘油品紅肉湯培養(yǎng)基中，于361培養(yǎng)8天,并用未接種的培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)作為陰性對(duì)照，觀察結(jié)果。,3、結(jié)果觀察與記錄,（1）出現(xiàn)紫色或紫紅色者,為陽(yáng)性，記錄為+；（2）與對(duì)照管顏色相同者,為陰性，記錄為-,（六）甘油品紅試驗(yàn),1、原理：某些細(xì)菌可分解甘油成為丙酮酸，并進(jìn)一步脫羧生成乙醛，乙醛與無(wú)色品紅生成醌式化合物，呈深紫紅色，以此鑒別細(xì)菌。,2、試驗(yàn)方法：,取待檢菌的新鮮純培養(yǎng)物，接種于甘油品紅肉湯培養(yǎng)基中，于361培養(yǎng)8天,并用未接種的培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)作為陰性對(duì)照，觀察結(jié)果。,3、結(jié)果觀察與記錄,（1）出現(xiàn)紫色或紫紅色者,為陽(yáng)性，記錄為+；（2）與對(duì)照管顏色相同者,為陰性，記錄為-,（一）靛基質(zhì)（吲哚）試驗(yàn)（二）H2S試驗(yàn)（三）尿素酶試驗(yàn)（四）氨基酸脫羧酶試驗(yàn)（五）苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)（六）明膠（Gelatin）液化試驗(yàn),三、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn),（一）靛基質(zhì)試驗(yàn),1、原理：某些細(xì)菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基質(zhì)（吲哚）。吲哚與對(duì)二甲氨基苯甲醛結(jié)合，可形成紅色化合物，即玫瑰吲哚，以此鑒別細(xì)菌。,2、試驗(yàn)方法：,所用試劑:（1）柯凡克(Kovacs)試劑;（2）歐波試劑,將待檢菌小量接種于培養(yǎng)基中，于361培養(yǎng)2448h時(shí)后，加入柯凡克試劑數(shù)滴，輕搖試管，呈紅色者為陽(yáng)性?；蜓卦嚬鼙诰徛尤霘W-波試劑約0.5mL覆蓋液面，兩液接觸處呈現(xiàn)玫瑰紅色者，為陽(yáng)性反應(yīng)，無(wú)紅色者為陰性反應(yīng)。,靛基質(zhì)試驗(yàn)原理及照片,靛基質(zhì)+,3、結(jié)果觀察與記錄,呈現(xiàn)玫瑰紅色，為陽(yáng)性反應(yīng)，記+無(wú)紅色者，為陰性反應(yīng)，記-,（二）硫化氫（H2S）試驗(yàn),1、原理：某些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸或含硫化合物，產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇鉛鹽或鐵鹽可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鑒別細(xì)菌。,2、試驗(yàn)方法：,挑取待檢菌，用穿刺接種法接種于三糖鐵培養(yǎng)上，于361培養(yǎng)2448h，觀察結(jié)果。,3、結(jié)果觀察與記錄,培養(yǎng)基底部呈黑色，為陽(yáng)性，記+培養(yǎng)基底部無(wú)黑色，為陰性，記-,（三）尿素酶試驗(yàn),1、原理：某些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解產(chǎn)生氨，氨使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使培養(yǎng)基中的酚紅指示劑呈粉紅色，培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色，為陽(yáng)性。以此鑒別細(xì)菌。,2、試驗(yàn)方法：,挑取大量培養(yǎng)1824h的待試菌，濃密涂布接種于尿素瓊脂斜面上，不要到達(dá)底部，留底部作變色對(duì)照。培養(yǎng)2、4和24h分別觀察一次結(jié)果，培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色為陽(yáng)性，顏色不變者為陰性。如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定。,尿素酶試驗(yàn)圖,陽(yáng)性,3、結(jié)果觀察與記錄,培養(yǎng)基變呈粉紅色，為陽(yáng)性，記+培養(yǎng)基顏色不變，為陰性，記-,（四）氨基酸脫羧酶試驗(yàn),1、原理：某些細(xì)菌能產(chǎn)生氨基酸脫羧酶,可使賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)氨酸生產(chǎn)脫羧作用,生成胺類(lèi)物質(zhì)和CO2。胺類(lèi)物質(zhì)使培養(yǎng)基呈堿性變紫色，為陽(yáng)性,如呈黃色為陰性，以此鑒別細(xì)菌。,2、試驗(yàn)方法,取待檢菌，分別接種于含有氨基酸的培養(yǎng)基內(nèi)和不含氨基酸的對(duì)照培養(yǎng)基內(nèi)，在361培養(yǎng)14天，每天觀察結(jié)果。,3、結(jié)果觀察與記錄,試驗(yàn)管呈紫色，對(duì)照管呈黃色，為陽(yáng)性，記+試驗(yàn)管、對(duì)照管都呈黃色，為陰性，記-,試驗(yàn)管,對(duì)照管,陽(yáng)性+,陰性-,對(duì)照管變黃,試驗(yàn)管變黃,陽(yáng)性反應(yīng)試驗(yàn)管顏色變化過(guò)程,紫色黃色紫色原理：對(duì)照管呈黃色，說(shuō)明有細(xì)菌生長(zhǎng)。在培養(yǎng)的早期（1012h），細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸使培養(yǎng)液pH下降，指示劑溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色，以后由于氨基酸脫羧生成胺，pH又回升至堿性，指示劑顯紫色。,陽(yáng)性反應(yīng)試驗(yàn)管顏色變化過(guò)程：紫色黃色紫色,（五）苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn),1、原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸與氯化鐵作用生成綠色化合物，以此鑒別細(xì)菌。,2、試驗(yàn)方法,從待檢菌瓊脂斜面上挑取大量培養(yǎng)物，接種于苯丙氨酸培養(yǎng)基上，在361培養(yǎng)1824h后，加入氯化鐵溶液45滴，轉(zhuǎn)動(dòng)試管，使試劑與菌苔表面充分接觸，立即觀察結(jié)果。,3、結(jié)果觀察與記錄,試驗(yàn)管立即出現(xiàn)綠色，為陽(yáng)性，記+無(wú)色為陰性，記-。,加氯化鐵試劑,出現(xiàn)綠色+,（六）明膠液化試驗(yàn),1、原理有些細(xì)菌具有明膠酶（亦稱(chēng)類(lèi)蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步將多肽水解為氨基酸，明膠失去凝膠性質(zhì)，使培養(yǎng)基由固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)。,2、試驗(yàn)方法,挑取培養(yǎng)1824h的待試菌，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度。于2022培養(yǎng)714天。明膠高層亦可培養(yǎng)于361。另取一支未接種的培養(yǎng)基一同培養(yǎng)作對(duì)照，每天取出兩支試管，放入冰箱放置2030min后，再觀察結(jié)果。,3、結(jié)果觀察與記錄,明膠液化，為陽(yáng)性，+。明膠凝固，為陰性，-。,四、有機(jī)酸鹽和銨鹽的利用試驗(yàn),檸檬酸鹽利用試驗(yàn)丙二酸鹽利用試驗(yàn),（一）枸櫞酸鹽利用試驗(yàn),1、原理：某些細(xì)菌能利用檸檬酸鹽作為唯一碳源，分解枸櫞(檸檬)酸鹽生成碳酸鹽；同時(shí)分解培養(yǎng)基的銨鹽生成氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使指示劑溴麝香草酚藍(lán)由淡綠轉(zhuǎn)為深藍(lán)色，為陽(yáng)性。,2、試驗(yàn)方法,挑取待檢菌，在西蒙檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上密集劃線(xiàn)接種，在361培養(yǎng)14天，每天觀察結(jié)果。,3、結(jié)果觀察與記錄,斜面有菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基斜面變?yōu)樗{(lán)色或深藍(lán)色，為陽(yáng)性，記+；無(wú)菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基斜面仍為綠色者，為陰性，記-,檸檬酸鹽試驗(yàn)原理及斜面照片,陽(yáng)性+,（二）丙二酸鹽利用試驗(yàn),1.原理:某些細(xì)菌可以利用培養(yǎng)基中的丙二酸鹽作為唯一碳源,丙二酸鹽被分解成碳酸鈉,使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性,培養(yǎng)基由草綠色變成藍(lán)色，為陽(yáng)性，以此鑒別細(xì)菌。,2、試驗(yàn)方法,取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，接種于丙二酸鈉培養(yǎng)基上，于361培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。,3、結(jié)果觀察與記錄,培養(yǎng)基由草綠色變成藍(lán)色,為陽(yáng)性,記+;培養(yǎng)基無(wú)顏色變化,為陰性,記-,五、呼吸酶類(lèi)試驗(yàn),氧化酶試驗(yàn)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)氰化鉀試驗(yàn),（一）氧化酶試驗(yàn),1.原理:氧化酶使細(xì)胞色素C氧化后，氧化型細(xì)胞色素C再使鹽酸二甲基對(duì)苯二胺氧化，使生成玫瑰紅色到暗紫色的醌類(lèi)化合物,再和-萘酚結(jié)合,生成吲哚酚藍(lán),呈藍(lán)色反應(yīng)，為陽(yáng)性。,試劑,1%-萘酚-乙醇液1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺,2、試驗(yàn)方法,用滴管直接滴加1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試劑12滴在培養(yǎng)物上,再加入1%-萘酚-乙醇液12滴,在30秒內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。,3、結(jié)果觀察與記錄,在30秒內(nèi)呈藍(lán)色反應(yīng),為陽(yáng)性,記+不變色或?yàn)榧t色者,為陰性,記-,成藍(lán)色為+,不變色或?yàn)榧t色為-,（二）過(guò)氧化氫酶試驗(yàn),原理：某些細(xì)菌可分泌過(guò)氧化氫酶，加入過(guò)氧化氫后，可將過(guò)氧化氫分解生成水和氧氣，產(chǎn)生氣泡，即為陽(yáng)性反應(yīng)。,2、試驗(yàn)方法,挑取固體培養(yǎng)基上的新鮮菌落一環(huán)，置于潔凈玻片上（或試管），滴加3%過(guò)氧化氫液數(shù)滴，或在瓊脂斜面培養(yǎng)物上直接滴加過(guò)氧化氫液，立即觀察結(jié)果。,3、結(jié)果觀察與記錄,產(chǎn)生氣泡者，為陽(yáng)性，記+不產(chǎn)生氣泡者，為陰性，記-,（三）硝酸鹽還原試驗(yàn),1、原理：某些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，在酸性條件下，亞硝酸鹽可生成亞硝酸，亞硝酸與對(duì)氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再與-萘胺作用，生成紅色的化合物，呈紅色反應(yīng)，為陽(yáng)性反應(yīng)。,試劑,A、對(duì)氨基苯磺酸試劑B、-萘胺試劑,2、試驗(yàn)方法,取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，在硝酸鹽培養(yǎng)基上接種，在361培養(yǎng)14天，每天取2mL培養(yǎng)液,加入A、B試劑的等量混合物各二滴混勻，立即觀察結(jié)果。,3、結(jié)果觀察與記錄,呈現(xiàn)紅色，為陽(yáng)性，記+若無(wú)紅色出現(xiàn)，為陰性，記-,（四）氰化鉀試驗(yàn),1.原理：氰化鉀是細(xì)菌呼吸酶系統(tǒng)的抑制劑,可與呼吸酶作用使酶失去活性,抑制細(xì)菌的生長(zhǎng),但有的細(xì)菌在一定濃度的氰化鉀存在時(shí)仍能生長(zhǎng),以此鑒別細(xì)菌.,2、試驗(yàn)方法,取培養(yǎng)2024h的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌落1環(huán)，接種至對(duì)照培養(yǎng)基及氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，立即以橡膠塞塞緊，361培養(yǎng)2448h，觀察結(jié)果。,3、結(jié)果觀察與記錄,對(duì)照管有菌生長(zhǎng)，試驗(yàn)管有菌生長(zhǎng)為陽(yáng)性，記+。對(duì)照管有菌生長(zhǎng)，試驗(yàn)管無(wú)菌生長(zhǎng)為陰性。記-。,六、毒性酶類(lèi)試驗(yàn),溶血試驗(yàn)鏈激酶試驗(yàn)卵磷脂酶試驗(yàn)血漿凝固酶試驗(yàn),（一）溶血試驗(yàn),1、原理：某些細(xì)菌在代謝過(guò)程中能產(chǎn)生溶血素，可使人或動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生溶解，不同的細(xì)菌有不同的溶血反應(yīng)，借此可鑒別細(xì)菌。,2、試驗(yàn)方法,平板法試管法,平板法,將培養(yǎng)物接種于血平板培養(yǎng)基上，361培養(yǎng)2448h，觀察結(jié)果。,溶血試驗(yàn)的溶血類(lèi)型及現(xiàn)象,（1）（甲型）溶血:菌落周?chē)霈F(xiàn)較窄的半透明的草綠色溶血環(huán)。（2）（乙型）溶血:菌落周?chē)霈F(xiàn)較寬的透明溶血環(huán)。（3）（-丙型）溶血:菌落周?chē)鸁o(wú)溶血環(huán)。,甲型（-）溶血,乙型（-）溶血,丙型（-）溶血,試管法,將待檢菌培養(yǎng)液與等量的2%羊血球混合，在361培養(yǎng)1618h，觀察結(jié)果。如溶血，培養(yǎng)液可出現(xiàn)透明狀。,3、結(jié)果觀察與記錄,有溶血現(xiàn)象，為陽(yáng)性，記+；無(wú)溶血現(xiàn)象，為陰性，記-,（二）鏈激酶試驗(yàn),1、原理：A群鏈球菌群能產(chǎn)生鏈激酶，該酶能使血液中的纖維蛋白酶原變成纖維蛋白酶，而后溶解纖維蛋白，使血凝塊溶解,為陽(yáng)性反應(yīng)。此試驗(yàn)用于測(cè)定鏈球菌的致病性。陽(yáng)性反應(yīng)具有致病性。,2、試驗(yàn)方法,吸取草酸鉀血漿0.2mL(0.01g草酸鉀加5mL兔血漿混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清液)，加入0.8mL生理鹽水，混勻后，再加入待檢菌36下培養(yǎng)18-24h肉湯培養(yǎng)物0.5mL和0.25氯化鈣0.25mL，混勻，放37水浴中，2min觀察一次。,待血漿凝固后繼續(xù)觀察并記錄溶化時(shí)間。如2h內(nèi)不溶化，繼續(xù)放置24h后觀察。同時(shí)用肉浸液肉湯做陰性對(duì)照，用已知的鏈激酶陽(yáng)性的菌株做陽(yáng)性對(duì)照。,3、結(jié)果觀察與記錄,如凝塊全部溶化,為陽(yáng)性+，凝塊24h仍不溶化,為陰性-,（三）卵磷脂酶試驗(yàn),1、原理：某些微生物能產(chǎn)生卵磷脂酶，在鈣離子存在時(shí)，能迅速分解卵磷脂，生成不溶性甘油酯和水溶性磷酸膽堿，在卵黃瓊脂平板上菌落周?chē)纬刹煌该鞯娜闈岘h(huán)或混濁白環(huán)，或使血清、卵黃液變混濁，以此鑒別細(xì)菌。,2、試驗(yàn)方法,（1）卵黃平板法：A法：將待檢菌培養(yǎng)物劃線(xiàn)接種或點(diǎn)種于卵黃瓊脂平板上，361培養(yǎng)36h，觀察結(jié)果。,菌落,白色混濁環(huán)，,B法：先用卵黃磷脂酶抗血清將平板涂一半，置于36待干后，將待檢菌接種于未涂抗血清的一半卵黃瓊脂平板上，再轉(zhuǎn)劃已涂過(guò)抗血清的一半，361厭氧培養(yǎng)2448h，觀察結(jié)果。在未涂抗血清的一半平板上，菌落周?chē)纬奢^大的不透明乳白色混濁區(qū)，在涂抗血清的一半平板上，菌落周?chē)鸁o(wú)不透明混濁區(qū)，為陽(yáng)性。兩邊均無(wú)不透明區(qū)，為陰性。,菌落周?chē)鸁o(wú)混濁白環(huán),菌落周?chē)谢鞚岚篆h(huán),乳糖卵黃瓊脂平板,借以確定該菌可否產(chǎn)生卵磷脂酶。卵磷脂酶具抗原性，其活性可被相應(yīng)抗血清所抑制，,（2）卵黃鹽水法,將庖肉培養(yǎng)基培養(yǎng)物經(jīng)除菌過(guò)濾，收集濾液。在兩支滅菌試管內(nèi)，每管加入1%卵黃鹽水0.4mL,在一管中加入濾液0.2mL，另一管加入生理鹽水0.2mL作對(duì)照。在36水浴中，經(jīng)2h、4h、8h、24h觀察結(jié)果。管底發(fā)生混濁沉淀，對(duì)照管無(wú)沉淀者，為陽(yáng)性。,3、結(jié)果觀察與記錄,菌落周?chē)纬奢^大的不透明區(qū)，為陽(yáng)性。兩邊均無(wú)不透明區(qū)，為陰性。管底發(fā)生混濁沉淀，對(duì)照管無(wú)沉淀者，為陽(yáng)性?xún)晒軣o(wú)沉淀者，為陰性。,（四）血漿凝固酶試驗(yàn),1、原理：致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，附著在細(xì)菌的表面，形成凝塊；或作用于血漿凝固酶原，使它成為血漿凝固酶，從而使抗凝的血漿發(fā)生凝固現(xiàn)象,為陽(yáng)性。,2、試驗(yàn)方法,（1）玻片法：取清潔干燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一滴兔（人）血漿，挑取菌落分別與生理鹽水和血漿混合，5min內(nèi),如血漿內(nèi)出現(xiàn)團(tuán)塊或顆粒狀凝塊，而鹽水滴仍呈均勻混濁，則為陽(yáng)性;如兩者呈均勻混濁，無(wú)凝固則為陰性。,有凝塊,均勻混濁,血漿,生理鹽水,血漿凝固酶試驗(yàn),陽(yáng)性反應(yīng),陰性反應(yīng),不凝固,少量、零散凝固,明顯的塊狀凝固,巨大塊凝固,完全凝固，倒置不流動(dòng),金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實(shí)驗(yàn),3、試管法的結(jié)果觀察與記錄,空白對(duì)照管的血漿流動(dòng)自如，陽(yáng)性對(duì)照管血漿凝固，試驗(yàn)管血漿凝固者為陽(yáng)性；均無(wú)凝固則為陰性。,三糖鐵（TSI）試驗(yàn),1、三糖鐵試驗(yàn)的原理,如果細(xì)菌可利用乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，培養(yǎng)基全部變黃；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面最后為紅色，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類(lèi)不被氧化，仍保持黃色。如果細(xì)菌又能分解含硫化合物，產(chǎn)生硫化氫，培養(yǎng)基底部變黑。,制好的培養(yǎng)基,對(duì)照管,斜面紅色，底面黃色,培養(yǎng)基全黃色,斜面、底部黃色，并產(chǎn)生H2S,斜面紅色，底部黃色，產(chǎn)生H2S,底面黃色，并產(chǎn)生CO2,2、試驗(yàn)方法,以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置361培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。,下面照片所示2-3-4，可能是大腸桿菌、沙門(mén)氏菌還是志賀氏菌？,2志賀氏菌3沙門(mén)氏菌4大腸桿菌,第二節(jié)血清學(xué)試驗(yàn),血清學(xué)反應(yīng)：指相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，所出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀、凝集現(xiàn)象。,一、抗原與抗體,（一）抗原,1、抗原的概念抗原(Ag)：是指凡能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并能與應(yīng)答產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異反應(yīng)的物質(zhì)。,2、抗原的特性,免疫原性反應(yīng)原性,（二）抗體,1、抗體：是指機(jī)體內(nèi)的淋巴系統(tǒng)細(xì)胞在抗原物質(zhì)的激發(fā)下，所合成的一種具有特異性免疫功能的球蛋白(免疫球蛋白)。,2、抗體的理化性質(zhì),（1）抗體是球蛋白（2）免疫球蛋白,兔血清電泳分離圖,經(jīng)對(duì)不同免疫血清的電泳分析，超速離心分析和分子量測(cè)定等方法，發(fā)現(xiàn)大部分抗體活性存在于球蛋白內(nèi)，但有小部分抗體活性可存在于球蛋白內(nèi)。它們的離心常數(shù)分別為7S和平共處19S，分子量分別為16萬(wàn)和90萬(wàn)。因此它們分別被命名為7S球蛋白分子（16萬(wàn)）19S2巨球蛋白分子(2M,90萬(wàn))和2A球蛋白分子，所以從早期對(duì)抗體性質(zhì)的研究證明抗體不是由均質(zhì)性球蛋白組成，而是由異性球蛋白組成。,（三）抗原抗體反應(yīng),抗原抗體反應(yīng)：是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng),第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)的原理,抗原抗體反應(yīng):指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。物質(zhì)基礎(chǔ):抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補(bǔ)結(jié)合抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結(jié)合抗原抗體之間的結(jié)合力親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體,靜電引力（electrostaticforces）范德華引力:作用最?。╲anderWaalsinteractions）氫鍵:最具特異性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）,抗原抗體結(jié)合力示意圖,一、抗原抗體結(jié)合力,抗體結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合的強(qiáng)度,親合力(avidity),抗原抗體親合力示意圖,抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的抗原決定簇之間相適應(yīng)而存在著的引力，是抗原抗體間固有的結(jié)合力,親和力(affinity),抗原抗體親和力示意圖,二、抗原抗體的親和力和親合力,可見(jiàn)反應(yīng),抗原抗體復(fù)合物(疏水膠體),電解質(zhì),抗原(親水膠體),抗體(親水膠體),+,三、親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體,第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn),特異性可逆性比例性階段性,特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專(zhuān)一性,抗原抗體反應(yīng)特異性示意圖,分子基礎(chǔ):抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性,一、特異性,兩種不同的抗原分子具有部分相同或類(lèi)似結(jié)構(gòu)的抗原表位，可與彼此相應(yīng)的抗血清發(fā)生反應(yīng),交叉反應(yīng)（crossreactions）,抗原抗體交叉反應(yīng)示意圖,二、可逆性,可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性,影響因素：抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親合力親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響pH、離子強(qiáng)度,前帶(prezone)：抗體過(guò)量后帶(postzone)：抗原過(guò)量等價(jià)帶(equivalencezone)：抗原抗體比例合適,抗原抗體反應(yīng)比例性示意圖,比例性：抗原與抗體發(fā)生可見(jiàn)反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)