細(xì)胞總蛋白提取及討論

細(xì)胞總蛋白提取細(xì)胞處理后，棄去培養(yǎng)液；用4預(yù)冷PBS洗1遍，吸水紙吸取殘留的PBS；加入冰上預(yù)冷的蛋白裂解液100l 【配方：RIPA裂解液 1ml + PMSF工作液(10mM) 10l + 正礬酸鈉(2mM) 10l】，使之均勻平鋪于細(xì)胞面，反復(fù)吹打，冰上靜置30min；用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮于培養(yǎng)皿一側(cè)(顯微鏡下觀察確認(rèn))，收集至預(yù)冷1.5ml EP管中，超聲破碎細(xì)胞1min，靜置5min，使細(xì)胞充分裂解；4，12000r離心15min；取上清液至另一1.5ml EP管，置于冰上分裝2l用于BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，其余處理后保存?zhèn)溆没蛑苯由蠘?。?xì)胞總蛋白的提取及裂解液一懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù)107重懸于0.5mlPBS(0.01M)中，加入飽和濃度一抗(1/10)或（10ug/ml）415-30min后，短暫離心4000 轉(zhuǎn)3分，用PBS 0.4-0.5ml重懸(室溫),加入飽和濃度二抗（1/100）或 (20ug/ml),迅速置于37水浴中2-5分后（迅速加入終止液0.5ml（冷pbs中含有400uM Na3VO4,5mM EDTA,10mM NaF）,離心4000 轉(zhuǎn)3分，棄上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml(裂解濃度108/ml？)吸管輕輕混勻，冰點(diǎn)緩慢震搖孵育30分鐘后加入10ul濃度為10mg/ml的PMSF儲(chǔ)存液，冰點(diǎn)孵育30分鐘。4度離心15000g 20min。上清液即為全部細(xì)胞溶解成分。二裂解緩沖液：50mM Tris-HCl pH7.6 或20mM Hepes pH7.4150-300mM NaCl1(w/w)NP-40 (0.5%Triton-X100)5mM EDTA（現(xiàn)加1ml加10ul）臨用前加入蛋白酶抑制劑：Na3VO4釩酸鈉 1mM (75mM13.3ul/ml)（用0.2mol/L儲(chǔ)存液配制）PMSF苯甲酰氟 1mM (10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml)或10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor （加10-20ul）Aprotinin 抑肽酶 10ug/ml（10ul/ml）(Leupeptin 亮肽素 10ug/ml 未加) Western blotting三給你介紹一個(gè)裂解液：50mM Tris-HCl （PH8.0）緩沖液，含：NaCl 150mM疊氮鈉 0.02%SDS 0.1%NP-40 1%PMSF 100ug/ml（使用前臨時(shí)加入）(10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml)盡量用少的裂解液裂解細(xì)胞，取上清電泳，最好用6xSDS 上樣buffer。四我的樣品蛋白是這樣制備的：將與腺病毒轉(zhuǎn)染液共培養(yǎng)小時(shí)的細(xì)胞消化下來(lái)離心收集細(xì)胞向離心管里加入微升PBS 緩沖液，隨后再加入微升2Lamilybuffer （由tris堿和SDS 組成）裂解細(xì)胞將細(xì)胞裂解液放入沸水中加熱五分鐘，放冷后離心測(cè)定蛋白濃度，加樣電泳我所說(shuō)的前沿有蛋白是指膠的底端，不是指加樣孔下面有蛋白膠的濃度應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題。五碧云天公司技術(shù)支持Western 及IP 細(xì)胞裂解液的主要成分為20mM Tris(pH 7.5)，150mM NaCl，1%Triton X-100，以及焦磷酸鈉, -glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin等多種抑制劑?？梢杂行б种频鞍椎慕到猓⒕S持原有的蛋白間相互作用。(-20保存，一年有效。)如果是貼壁細(xì)胞，按照6孔板每孔加入100微升裂解液的比例（即細(xì)胞培養(yǎng)液量的1/20）加入裂解液。六軍科院技術(shù)支持裂解液（50mmol/L Tris?HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1TritonX100，100ug/mlPMSF）：1mol/L Tris?HCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438gTritonX100 0.5ml蒸餾水至 50ml混勻后， 4保存。使用時(shí)，加入PMSF 至終濃度為100ug/ml（0.87ml 裂解液加入1.74mg/ml PMSF50l）。七操作方法：蛋白樣品制備：（1） 單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?、倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。2、每瓶細(xì)胞加 3ml 4 度預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS 棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。3、按 1ml 裂解液加10 ul PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）4、每瓶細(xì)胞加400 ul 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)。5、裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml 離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）6、于 4度下12000rpm 離心5min。（提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷）7、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5min 的離心管中放于20 度保存。 討論版我以前做蛋白大量表達(dá)超聲破碎時(shí)，總體積為200ml，功率300瓦，超3秒，停3秒，60次為一個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)之間停5min，共作了3個(gè)循環(huán)，效果很好。不知你的“原來(lái)的80倍”是多少，如果和我的差不多，是要延長(zhǎng)總時(shí)間，但要注意樣品要放在冰上，中間停一會(huì)，防止產(chǎn)生的熱量太多，使蛋白變性。我的方案是：1細(xì)胞先用無(wú)菌PBS洗二次；2吹下細(xì)胞后，4度12000rpm/min離心10min，再用無(wú)菌PBS懸浮，重復(fù)離心一次；3常規(guī)超聲波處理。注意事項(xiàng)：1全部處理過(guò)程一定要在冰上進(jìn)行；2超聲波時(shí)，一定不要有泡沫產(chǎn)生；3在冰上超聲波處理。由于上次求助無(wú)人回應(yīng)，一氣之下遍找資料，匯總出菌體/細(xì)胞裂解的常用方法和配方，希望能對(duì)其它求助兄弟有所幫助。菌體/細(xì)胞裂解法匯總一、反復(fù)凍融法：1、將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。/c?word=%B4%F3%B3%A6%3B%B8%CB%BE%FA%2C%C1%D1%BD%E2&url=http%3A/www%2Ebioon%2Ecom/experiment/mb/mb1/80878%2Ehtml&b=0&a=3&user=baidu2、至少3次以上凍溶。/bbs/actions/archive/post/_0.html3、IFCC推薦法：收集細(xì)胞懸液，4低溫離心（3000rpm，5min），棄上清，加入一定量PBS（200ul），輕輕吹打混勻，-200C 冷凍30 min，370C 解凍，如此反復(fù)3次，可形成細(xì)胞裂解液。/bbs/actions/archive/post/_0.html4、用液氮凍融三四次就可以了，細(xì)胞凍住后，取出放37度水浴，溶解后震蕩，再凍/dispbbs.asp?BoardID=89&ID=&replyID=&skin=1二、超聲波處理法1、要設(shè)定好超聲時(shí)間和間隙時(shí)間，一般超聲時(shí)間不超過(guò)5秒，間隙時(shí)間最好大于超聲時(shí)間，這些都有利于保護(hù)酶的活性。我的實(shí)驗(yàn)超聲時(shí)間5秒、間隙時(shí)間10秒、工作次數(shù)20次。/bbs/actions/archive/post/_0.html2、每個(gè)樣本超聲時(shí)間5秒,每個(gè)間隔5秒,粉碎5次。/bbs/actions/archive/post/_0.html3、100ml菌液離心，用8ml緩沖液懸浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超聲處理。750W 40功率。5秒超聲，9秒間隔。超聲至少90min。/bbs/actions/archive/post/_0.html4、綜合凍融和超聲的方法：1500g離心，棄除上清。冰上，用小體積PBS重懸細(xì)胞。將重懸液集中，1500g離心濃縮，棄除上清。液氮驟冷。用約5倍體積的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，并攪拌?？蛇x擇：4下超聲破碎細(xì)胞。加入終濃度為0.25M的KCl，15mM的DTT。4下g60min離心裂解液。取出上清。過(guò)柱子。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Alternate Protocol三、滲透法：冰冷的20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA處理，冰浴放置10min。精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南四、裂解液處理法：1、細(xì)胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚藍(lán)，10%甘油。SDS是陰離子型表面活性劑、極易促溶、強(qiáng)變性作用。/bbs/actions/archive/post/_0.html2、在loading buffer加SDS，100度5分鐘，是變性方法。SDS與蛋白等量結(jié)合，可以通過(guò)條帶位移判斷蛋白大小，考染不會(huì)影響結(jié)果。/bbs/post/view?bid=65&id=&sty=3&keywords=SDS+%C1%D1%BD%E23、如果是做小量菌液，跑PAGE膠看其表達(dá)情況的話，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分鐘即可，需注意的是上樣前要離心12000rpm至少5分鐘，然后上樣時(shí)，槍頭別吸最底下的。/bbs/actions/archive/post/_0.html4、20毫升細(xì)胞裂解液配方:40 L 0.5M EDTA (PH8.0)，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96 ml 蒸餾水。/bbs/actions/archive/post/_1.html5、我始終未明白樓主如果想收集全蛋白，而不考慮包涵體的話，為何要用超聲呢？直接水煮不就可以了嗎？/bbs/actions/archive/post/_0.html6、將1ml菌離心棄上清，留大概50ul，再加50ul 2上樣緩沖液，煮10min，取20ul上樣，就可以了。/bbs/post/view?bid=65&id=&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#7、檢測(cè)蛋白誘導(dǎo)：從培養(yǎng)的不同時(shí)期各取出1ml，12000g1min離心。將沉淀重懸于100ul 1SDS上樣緩沖液（50mM Tris-Cl（pH6.8），100mM DTT，2SDS，0.1溴酚藍(lán)，10甘油）中，100加熱3min，然后12000g1min離心。上樣15ul，6SDS-PAGE電泳。分子克隆P8268、5-10秒離心，棄除上清，用50ul蒸餾水重懸沉淀。加入1ul PMSF，再加入50ul熱的2SDS上樣緩沖液（100加熱）。迅速混勻后100加熱3-5min。將樣品冰上放置（或-20放置），然后再溶解，煮沸1min。離心30秒。上樣5ul進(jìn)行SDS-PAGE電泳。2SDS上樣緩沖液：250mM Tris-Cl，6.2（w/v）DTT，8SDS，0.002（w/v）溴酚藍(lán)，40甘油。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。9、裂解液：50mMTris-HCl(pH8.59.0)，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5%TritonX-100，1mg/ml溶菌酶。/c?word=%B4%F3%B3%A6%3B%B8%CB%BE%FA%2C%C1%D1%BD%E2&url=http%3A/www%2Ebioon%2Ecom/experiment/mb/mb1/80878%2Ehtml&b=0&a=3&user=baidu10、我們用NP40（NP40：NONIDET p-40 乙基苯基聚乙二醇，是一種非離子表面活性劑。）加DTT和蛋白酶抑制劑裂解細(xì)胞，冰上放3060min，然后13000rpm離心15min，取上清定量。/dispbbs.asp?BoardID=89&ID=&replyID=&skin=111、裂解液配方是：50mmol/L Tirs-HCI (PH 8.0)，150mmol/L NaCI，0. 02% 疊氮鈉，100g/ml PMSF，1g/ml Aprotinin，1% Triton X-100 ( or NP-40)。/bbs/actions/archive/post/_0.html12、對(duì)于組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)的細(xì)胞，最有效的裂解方法是用去污劑（表面活性劑）進(jìn)行處理，溶解細(xì)胞膜并溶解蛋白質(zhì)。50mmol/L Tirs-HCl(PH 8.0)、150mmol/L NaCl、0. 02% 疊氮鈉、100g/ml PMSF、1g/ml Aprotinin、1% Triton X-100 ( or NP-40) ，這種裂解液可能是最常用的裂解緩沖液。/bbs/actions/archive/post/_0.html13、細(xì)胞裂解液的主要目的：（1）利用去污劑破壞脂質(zhì)雙分子層，破裂細(xì)胞；（2）溶解蛋白；（3）蛋白變性使其穩(wěn)定；（4）抑制蛋白酶活性。推薦RIPA buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.4（緩沖體系），150 mM NaCl（等滲體系），1 mM PMSF （強(qiáng)大的蛋白酶抑制劑），1 mM EDTA（變性劑和穩(wěn)定劑），5 g/ml Aprotinin（蛋白酶抑制劑），5 g/ml Leupeptin（蛋白酶抑制劑），1% Triton x-100（破壞細(xì)胞），1% Sodium deoxycholate（中度變性劑和蛋白溶解劑），0.1% SDS（強(qiáng)變性劑和蛋白溶解劑）。/bbs/actions/archive/post/_0.html14、裂解buffer：50mM HEPES pH7.0，1mM 甘油，1mM DTT（還原劑），7M 尿素，2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解），1mM EDTA(金屬鏊合劑），1mM PMSF，1mg/ml leupeptin，1mg/ml aprotinin，1mg/ml pepstatin(蛋白酶抑制劑），50mM NaF(ph7.0)（anti hemoaggulating），1mM Na3VO4(ph7.0)（inhibitor of phosphatases），2mM benzamidine（inhibitor of trypsin）。/bbs/actions/archive/post/_0.html15、可選擇：取0.5ml誘導(dǎo)的細(xì)胞并離心2min。棄除上清，用100ul 1SDS上樣