天然藥物化學(xué)成分提取分離方法PPT課件

-,1,天然藥物化學(xué)成分提取分離方法,-,2,化學(xué)成分提取分離方法,天然藥物化學(xué)研究常從有效成分或生理活性成分的提取、分離工作開始。在進(jìn)行提取之前，應(yīng)了解所用材料的基源（如動(dòng)、植物的學(xué)名）、產(chǎn)地、藥用部位、采集時(shí)間與方法等。目的物為已知成分或已知化學(xué)結(jié)構(gòu)類型，如從甘草中提取甘草酸、麻黃中提取麻黃堿，或從植物中提取某類成分如總生物堿或總酸性成分時(shí)，工作比較簡(jiǎn)單。一般宜先查閱有關(guān)資料，搜集比較該種或該類成分的各種提取方案，尤其是工業(yè)生產(chǎn)方法，在根據(jù)具體條件加以選用。從中草藥或天然藥物中尋找未知有效成分或有效部位時(shí)，情況就比較復(fù)雜。只能根據(jù)預(yù)先確定的目標(biāo)，在適當(dāng)?shù)幕钚詼y(cè)試體系指導(dǎo)下，進(jìn)行提取、分離并以相應(yīng)的動(dòng)物模型篩選、臨床驗(yàn)證、反復(fù)實(shí)踐，才能達(dá)到目的。,-,3,一、有效成分的提取,溶劑提取法水蒸氣蒸餾法升華法,-,4,溶劑提取法,溶劑提取法系選擇適當(dāng)溶劑將中草藥中的化學(xué)成分從藥材中提取出來。天然藥物中的化學(xué)成分在溶劑中的溶解度直接與溶劑性質(zhì)有關(guān)。溶劑可分為水、親水性有機(jī)溶劑和親脂性有機(jī)溶劑。一些常見溶劑的脂性的強(qiáng)弱順序如下：石油醚苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水天然藥物化學(xué)成分可通過結(jié)構(gòu)估計(jì)它們的極性。,-,5,溶劑提取法,甙類的分子中結(jié)合有糖分子，羥基數(shù)目多，能表現(xiàn)強(qiáng)親水性，而甙元?jiǎng)t屬于親脂性化合物，而生物堿鹽，能夠離子化，加大了極性，就變成了親水性化合物。鞣質(zhì)是多羥基衍生物，列為親水性化合物。油脂、揮發(fā)油、蠟、脂溶性色素都是強(qiáng)親脂性成分。萜類、甾體等脂環(huán)類及芳香類化合物因?yàn)闃O性較小，易溶于氯仿、乙醚等親脂性溶劑中；糖苷、氨基酸等成分極性較大，易溶于水及含水醇中；酸性、堿性及兩性化合物，因?yàn)榇嬖跔顟B(tài)（分子或離子形式）隨溶液而異，故溶解度將隨pH而改變。,-,6,溶劑提取法,只要中草藥成分的親水性和親脂性與溶劑的此項(xiàng)性質(zhì)相當(dāng)，就會(huì)在其中有較大的溶解度，即所謂“相似相溶”的規(guī)律。這是選擇適當(dāng)溶劑自中草藥中提取所需要成分的依據(jù)之一。,-,7,水蒸氣蒸餾法,水蒸氣蒸餾法只適用于具有揮發(fā)性、能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞，與水不發(fā)生反應(yīng)，且難溶或不溶于水的成分的提取。天然藥物中的揮發(fā)油、某些小分子生物堿如麻黃堿、煙堿、檳榔堿以及某些小分子的酚性物質(zhì)如牡丹酚等的提取可采用水蒸氣蒸餾法。,-,8,升華法,某些固體物質(zhì)如水楊酸、苯甲酸、樟腦等受熱在低于其熔點(diǎn)的溫度下，不經(jīng)過熔化就可直接轉(zhuǎn)化為蒸氣，蒸氣遇冷后又凝結(jié)成固體稱為升華。天然藥物中有一些成分具有升華性質(zhì)，能利用升華法直接中藥材中提取出來。但天然藥物成分一般可升華的很少。,-,9,二、有效成分的分離與精制,-,10,化學(xué)成分分離精制常用方法原理,根據(jù)物質(zhì)溶解度差別進(jìn)行分離根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進(jìn)行分離根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離根據(jù)物質(zhì)分子大小差異進(jìn)行分離,-,11,根據(jù)物質(zhì)溶解度差別進(jìn)行分離,1、利用溫度不同引起溶解度的改變2、改變混合溶劑的極性3、調(diào)節(jié)溶液的pH值，改變分子的存在狀態(tài)4、沉淀法5、鹽析法,-,12,1、利用溫度不同引起溶解度的改變,鑒定中草藥化學(xué)成分，研究其化學(xué)結(jié)構(gòu)，必須首先將中草藥成分制備成單體純品。中草藥化學(xué)成分在常溫下多半是固體的物質(zhì)，常具有結(jié)晶性的通性，可以根據(jù)溶解度的不同用結(jié)晶法來達(dá)到分離精制的目的。中草藥化學(xué)成分，一旦獲得結(jié)晶，就能有效地進(jìn)一步精制成為單體純品。純化合物的結(jié)晶有一定的熔點(diǎn)和結(jié)晶學(xué)的特征，有利于鑒定。因此，求得結(jié)晶并制備成單體純品，就成為鑒定中草藥成分、研究其分子結(jié)構(gòu)重要的一步。,-,13,1、利用溫度不同引起溶解度的改變,結(jié)晶法是選用合適的溶劑，將混合物加熱溶解，形成有效成分的飽和溶液，趁熱過濾除去不溶的雜質(zhì)，濾液低溫放置或蒸去部分溶劑后再低溫放置，使有效成分大部分析出結(jié)晶，由于初析出的結(jié)晶總會(huì)帶一些雜質(zhì)，因此需要通過反復(fù)結(jié)晶即所謂重結(jié)晶的方法，才能得到高純度的晶體。,-,14,雜質(zhì)的除去,結(jié)晶法所用的樣品必須是已經(jīng)用其它方法提得比較純的時(shí)候才能采用此法精制。結(jié)晶乃同類分子自相排列，如果雜質(zhì)過多，則阻礙分子的排列。如果粗提取部分的純度很差則很難得到結(jié)晶。,-,15,雜質(zhì)的除去,用溶劑溶出雜質(zhì)，或只溶出所需要的成分。用少量活性炭等進(jìn)行脫色處理，以除去有色雜質(zhì)。通過氧化鋁、硅膠柱色譜處理（注意所需要的成分也可能被吸附而損失）。制備其晶態(tài)的衍生物（如游離生物堿可制備各種生物堿鹽類，羥基化合物可轉(zhuǎn)變成乙?；铮蓟衔锟芍苽涑杀诫暄苌锝Y(jié)晶）。,-,16,溶劑的選擇,適宜的溶劑是在冷時(shí)對(duì)所需要的成分溶解度較小，而熱時(shí)溶解度較大。溶劑的沸點(diǎn)亦不宜太高。一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等。有些化合物在一般溶劑中不易形成結(jié)晶，而在某些溶劑中則易于形成結(jié)晶。例如葛根素、逆沒食子酸（ellagicacid）在冰醋酸中易形成結(jié)晶，大黃素）在吡啶中易于結(jié)晶，萱草毒素在DMF中易得到結(jié)晶，而穿心蓮亞硫酸氫鈉加成物在丙酮一水中較易得到結(jié)晶。又如蝙蝠葛堿通常為無定形粉未，但能和氯仿或乙醚形成為加成物結(jié)晶。,-,17,結(jié)晶溶液的制備,制備結(jié)晶的溶液為過飽和的溶液。一般是應(yīng)用適量的溶劑在加溫的情況下，將化合物溶解再放置冷處。如果在室溫中可以析出結(jié)晶，就不一定放置于冰箱中，以免伴隨結(jié)晶析出更多的雜質(zhì)。無定形的粉未狀物質(zhì)，遠(yuǎn)較晶體物質(zhì)的溶解度大，易于形成過飽和溶液。一般經(jīng)過精制的化合物，在蒸去溶劑抽松為無定形粉未，加入少量溶劑，往往立即可以溶解，稍稍放置即能析出結(jié)晶。例如長(zhǎng)春花總?cè)鯄A部分抽松后加入1.5倍量的甲醇溶解，放置后很快析出長(zhǎng)春堿結(jié)晶。又如蝙蝠葛堿在乙醚中很難溶解，但當(dāng)其鹽的水溶液用氨液堿化，并立即用乙醚萃取，所得的乙醚溶液，放置后即可析出蝙蝠葛堿的乙醚加成物結(jié)晶。,-,18,結(jié)晶溶液的制備,制備結(jié)晶溶液，除用單一溶劑外，也常采用混合溶劑。一般是先將化合物溶于易溶的溶劑中，再在室溫下滴加適量的難溶的溶劑，直至溶液微呈渾濁，并將此溶液微微加溫，使溶液完全澄清后放置。一細(xì)辛醚重結(jié)晶時(shí)，可先溶于乙醇，再滴加適量水，即可析出很好的結(jié)晶?；⒄戎刑崛∷苄缘幕⒄冗皶r(shí)，在已精制飽和的水溶液上添加一層乙醚放置，既有利于溶出其共存的脂溶性雜質(zhì)，又可降低水的極性，促使虎杖甙的結(jié)晶化。,-,19,(4)結(jié)晶純度的判定,結(jié)晶的純度可由化合物的晶形、色澤、熔點(diǎn)和熔距、薄層色譜或紙色譜等作初步鑒定。一個(gè)單體純化合物一般都有一定的熔點(diǎn)和較小的熔距，同時(shí)在薄層色譜或紙色譜中經(jīng)數(shù)種不同展開劑系統(tǒng)檢定，也為一個(gè)斑點(diǎn)者，一般可以認(rèn)為是一個(gè)單體化合物。,-,20,結(jié)晶純度的判定,注意，有的化合物在一般層析條件下，雖然只呈現(xiàn)一個(gè)斑點(diǎn)，但并不一定是單體成分。例如鹿含草中主成分為高熊果甙、異高熊果甙極難用一般方法分離，經(jīng)反復(fù)結(jié)晶后，在紙層及聚酞胺薄層上都只有一個(gè)斑點(diǎn)，易誤認(rèn)為單一成分，但測(cè)其熔點(diǎn)在115125，熔距很長(zhǎng)。經(jīng)制備其甲醚后，再經(jīng)紙層層析檢定，可以出現(xiàn)兩個(gè)斑點(diǎn)，異高熊果甙的比移值大于高熊果甙。HPLC是近年來可以用作判斷有效成分純度的一種重要手段。此外，GC、UV光譜等，均有助于檢識(shí)結(jié)晶樣品的純度。,-,21,單晶的結(jié)構(gòu)測(cè)定,單晶X射線衍射單晶X射線分析是提供晶態(tài)下分子三維結(jié)構(gòu)，確定分子的立體結(jié)構(gòu)（構(gòu)型、構(gòu)象等）的最有效方法。,-,22,2、改變混合溶劑的極性,在溶液中加入另一種溶劑以改變混合溶劑的極性，使一部分物質(zhì)沉淀析出，從而實(shí)現(xiàn)分離。在藥材濃縮水提取液中加入數(shù)倍量高濃度乙醇，以沉淀除去多糖、蛋白質(zhì)等水溶性雜質(zhì)（水/醇法）；在濃縮乙醇提取液中加入數(shù)倍兩量水稀釋，放置以沉淀除去樹脂、葉綠素等水不溶性雜質(zhì)（醇/水法）；在乙醇濃縮液中加數(shù)倍兩乙醚（醇/醚法）或丙酮（醇/丙酮法），可使皂苷沉淀析出，而脂溶性的樹脂等類雜質(zhì)則留在母液中。,-,23,3、加酸堿調(diào)節(jié)溶液的pH值,對(duì)酸性、堿性或兩性有機(jī)化合物來說，?？赏ㄟ^加入酸、堿以調(diào)節(jié)溶液的pH值，改變分子的存在狀態(tài)（游離型或解離型），從而改變?nèi)芙舛榷鴮?shí)現(xiàn)分離。內(nèi)酯類化合物不溶于水，但遇堿開環(huán)生成羧酸鹽溶于水，再加酸酸化，又重新形成內(nèi)酯環(huán)從溶液中析出，從而與其它雜質(zhì)分離（堿/酸法）；生物堿一般不溶于水，遇酸生成生物堿鹽而溶于水，再加堿堿化，又重新生成游離生物堿（酸/堿法）。這些化合物可以利用與水不相混溶的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取分離?？梢苑譃閺?qiáng)酸性、弱酸性和酚性三種，它們分別溶于碳酸氫鈉、碳酸鈉和氫氧化鈉，借此可進(jìn)行分離。,-,24,4、沉淀法,在中草藥提取液中加入某些試劑使產(chǎn)生沉淀，以獲得有效成分或除去雜質(zhì)的方法。鉛鹽沉淀法試劑沉淀法,-,25,鉛鹽沉淀法,鉛鹽沉淀法為分離某些中草藥成分的經(jīng)典方法之一。醋酸鉛及堿式醋酸鉛，能與多種化學(xué)成分生成難溶的鉛鹽或絡(luò)鹽沉淀，故可利用這種性質(zhì)使有效成分與雜質(zhì)分離。中性醋酸鉛可與酸性物質(zhì)或某些酚性物質(zhì)結(jié)合成不溶性鉛鹽。因此，常用以沉淀有機(jī)酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂、酸性皂甙、部分黃酮等。與堿式醋酸鉛產(chǎn)生不溶性鉛鹽或絡(luò)合物的范圍更廣。,-,26,試劑沉淀法,在生物堿鹽的溶液中，加入某些生物堿沉淀試劑（見生物堿性質(zhì)下），則生物堿生成不溶性復(fù)鹽而析出。水溶性生物堿難以用萃取法提取分出，常加入雷氏銨鹽使生成生物堿雷氏鹽沉淀析出用明膠、蛋白溶液沉淀鞣質(zhì)；膽甾醇也常用以沉淀洋地黃皂甙等。,-,27,5、鹽析法,鹽析法是在中草藥的水提液中、加入無機(jī)鹽至一定濃度，或達(dá)到飽和狀態(tài)，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而與水溶性大的雜質(zhì)分離。鹽析用的無機(jī)鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。三七的水提取液中加硫酸鎂至飽和狀態(tài)，三七皂甙乙即可沉淀析出，自黃藤中提取掌葉防己堿，自三顆針中提取小檗堿在生產(chǎn)上都是用氯化鈉或硫酸銨鹽析制備。有些成分如原白頭翁素、麻黃堿、苦參堿等水溶性較大，在提取時(shí)，亦往往先在水提取液中加入一定量的食鹽，再用有機(jī)溶劑萃取。,-,28,根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進(jìn)行分離,分配系數(shù)（K）兩種相互不能任意混溶的溶劑（如氯仿與水）如置分液漏斗中充分振搖，放置后即可分成兩相。此時(shí)如果其中含有溶質(zhì)，則溶質(zhì)在兩相溶劑中的分配比（K）在一定溫度及壓力下為一常數(shù)，可以下式表示：K=CU/CLK：分配系數(shù)；CU：溶質(zhì)在上相溶劑中的濃度；CL：溶質(zhì)在下相溶劑中的濃度。,-,29,根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進(jìn)行分離,1、液-液萃取法2、逆流連續(xù)萃取法3、逆流分配法（CounterCurrentDistribution，CCD）4、液滴逆流色譜法（DCCC）5、高速逆流色譜法（HSCCC）6、氣液分配色譜（GC或GLC）7、液-液分配色譜（LC或LLC）,-,30,1、液-液萃取法,利用混合物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離的方法。萃取時(shí)如果各成分的分配系數(shù)相差越大，分離效率越高。水提取液中的有效成分是親脂性的物質(zhì)，一般多用親脂性有機(jī)溶劑，如苯、氯仿或乙醚進(jìn)行兩相萃?。挥行С煞质瞧谟H水性的物質(zhì)，需用弱親脂性的溶劑，例如乙酸乙酯、丁醇等。提取黃酮類成分多用乙酸乙脂和水的兩相萃取。提取親水性強(qiáng)的皂甙則多選用正丁醇、異戊醇和水作兩相萃取。,-,31,液-液萃取法操作注意事項(xiàng),先用小試管猛烈振搖約1分鐘，觀察萃取后二液層分層現(xiàn)象。如果容易產(chǎn)生乳化，大量提取時(shí)要避免猛烈振搖，可延長(zhǎng)萃取時(shí)間。如碰到乳化現(xiàn)象，可將乳化層分出，再用新溶劑萃?。换?qū)⑷榛瘜映闉V，或?qū)⑷榛瘜由陨约訜?；或較長(zhǎng)時(shí)間放置并不時(shí)旋轉(zhuǎn)，令其自然分層。乳化現(xiàn)象較嚴(yán)重時(shí)，可以采用二相溶劑逆流連續(xù)萃取裝置。水提取液的濃度最好在比重1.11.2之間，過稀則溶劑用量太大，影響操作。,-,32,2、高速逆流色譜(High-speedCountercurrentChromatography，HSCCC),大多數(shù)色譜法都需要有固相載體某種形式的選擇性吸附作用。在應(yīng)用固相載體色譜分離中，往往會(huì)存在不同程度的不可逆吸附，造成被分離樣品的損失，尤其在分離微量樣品時(shí)受到限制。高速逆流色譜，是近十年迅速發(fā)展起來的新型液液分配色譜技術(shù)。與其它液相色譜分離方法相比它不使用固相載體作固定相，被分離物質(zhì)在互不相溶兩相分配分離，克服了固相載體帶來的樣品吸附、損失、污染、峰形拖尾等缺點(diǎn)。且花費(fèi)溶劑少，分辨率高，可進(jìn)行純品制備。利用HSCCC，中草藥粗提物的分離純化制備可同步完成，被分離物可定量回收。,-,33,HSCCC的工作原理,兩種互不相溶的溶劑在聚四氟乙烯管內(nèi)作高速行星運(yùn)轉(zhuǎn)，其中一相溶劑作固定相，用恒流泵輸送載有樣品的另一相溶劑穿過固定相，兩相溶劑在螺旋管中實(shí)現(xiàn)高效的接觸、混合、分配和傳遞。由于樣品中各組分在兩相中的分配能力不同，導(dǎo)致在聚四氟乙烯管中移動(dòng)的速度也不同，從而使樣品中各組分得到分離。,-,34,HSCCC的特點(diǎn),1、應(yīng)用范圍廣，適應(yīng)性好由于溶劑系統(tǒng)的組成與配比可以是無限多，因而HSCCC適用于任何極性范圍的品的分離，特別適用于分離極性大的組分以及一些生物大分子。2、操作簡(jiǎn)便，容易掌握對(duì)樣品的預(yù)處理要求低，一般的粗提物即可進(jìn)行HSCCC的制備分離或分析。,-,35,HSCCC的特點(diǎn),3、回收率高固定相為液體，無需固體作載體，克服氣、液相色譜使用固相載體帶來的樣品吸附、損失、污染、峰形拖尾等缺點(diǎn)。4、重現(xiàn)性好分離過程穩(wěn)定、峰的保留相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2，,-,36,HSCCC的特點(diǎn),5、分離效率高，分離量較大與一般色譜的分離方式不同，能實(shí)現(xiàn)梯度操作和反相操作、亦能進(jìn)行重復(fù)進(jìn)樣，特別適用于制備性分離，產(chǎn)品純度高，制備量大，溶劑消耗少。較大的制備型HSCCC，柱容積可達(dá)530ml，一次最多進(jìn)樣可達(dá)20g粗品；較小的分析型的HSCCC柱容積為8mL，進(jìn)樣量為幾十微克，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)4000rmin.因此，被廣泛地應(yīng)用于植物化學(xué)成分的分離制備研究。,-,37,HSCCC的特點(diǎn),根據(jù)以上特點(diǎn)，HSCCC適合于中藥成分的分離和分析。目前高速逆流色譜儀已成功地開發(fā)出分析型和制備型兩大系列。制備或半制備HSCCC的特點(diǎn)是高流速、高濃度，不但適用于非極性化合物的分離，也適用于極性化合物的分離。在制備分離方面，可用于中藥粗提物中各組分的分離，也可進(jìn)一步精制，甚至直接從從粗提物步純化到純品，來制備中藥化學(xué)成分標(biāo)準(zhǔn)品。,-,38,HSCCC的應(yīng)用,HSCCC的分離效率與氣相色譜和高效液相色譜等技術(shù)相比較，前者不適宜用它完成組成復(fù)雜的混合物的全譜分離分析。而其對(duì)于樣品的預(yù)處理?xiàng)l件較放松及回收率高，制備量大，特別適用于特定部位和特定組分的分離純化與制備。,-,39,HSCCC的應(yīng)用,制備中藥化學(xué)對(duì)照品中草藥化學(xué)對(duì)照品應(yīng)具有高度均勻性，量值準(zhǔn)確性和良好穩(wěn)定性，其純度要求很高。制備型HPLC曾是國(guó)外常用的主要手段。但是其設(shè)備和載體填料價(jià)格很高對(duì)樣品前期處理要求嚴(yán)格，存在不可逆吸附，溶劑用量大的缺點(diǎn)。因此致力于HSCCC分離、統(tǒng)化、制備中草藥有效成分對(duì)照品的研究和產(chǎn)業(yè)化，具有現(xiàn)實(shí)意義。從銀杏葉中制備異鼠李素、山奈酚、槲皮索、白果內(nèi)酯和橙皮甙；從大黃制備大黃羥基蒽醌甙元；從洋地黃葉中制備洋地黃毒甙；從虎杖中分離提純白藜蘆醇和白藜蘆醇甙等。,-,40,3、高效液相色譜(HPLC),HPLC是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上引入氣相色譜的塔板理論，并采用了高壓輸液泵、高效固定相和高靈敏度的檢測(cè)器，具有分析速度快、分離效率高和操作自動(dòng)化特點(diǎn)的一種色譜技術(shù)。HPLC特別適合高沸點(diǎn)、大分子和熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析。中藥的成分非常復(fù)雜，以往常用的薄層色譜等方法因其精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、重現(xiàn)性差而不能滿足中藥現(xiàn)代化發(fā)展的需要。高效液相色譜正是以其穩(wěn)定、可靠、高效的特點(diǎn)成為中藥研究的最重要的分析方法。常用于中藥質(zhì)量的控制、天然藥物化學(xué)成分的分離及分析測(cè)定等。,-,41,3、高效液相色譜(HPLC),檢測(cè)器是液相色譜的三大關(guān)鍵部件（高壓輸液泵、高效色譜柱和檢測(cè)器）之一。其發(fā)展在某種意義上決定著HPLC技術(shù)的進(jìn)步。理想的檢測(cè)器應(yīng)具有以下特點(diǎn)：靈敏度高；對(duì)溫度變化和流量波動(dòng)不敏感；死體積小，不使峰額外地?cái)U(kuò)展；對(duì)溶劑無響應(yīng)，能用于梯度洗脫操作線性范圍寬；對(duì)所有樣品都有響應(yīng)；對(duì)樣品無破壞性。,-,42,3、高效液相色譜(HPLC),檢測(cè)器的種類繁多，至今還沒有一種檢測(cè)器可以同時(shí)滿足以上幾點(diǎn)要求。有紫外可見分光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器、測(cè)定大分子絕對(duì)分子量的多角度激光光散射儀。另外還有蒸發(fā)光檢測(cè)器、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器、手性檢測(cè)器(旋光檢測(cè)器、圓二色檢測(cè)器)、分子量檢測(cè)器、放射性檢測(cè)器、熱學(xué)性質(zhì)檢測(cè)器、光電導(dǎo)檢測(cè)器、磁旋光檢測(cè)器等。,-,43,常用的HPLC檢測(cè)器,紫外-可見分光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器二極管陣列檢測(cè)器蒸發(fā)光檢測(cè)器,-,44,紫外檢測(cè)器（UVD）,優(yōu)點(diǎn)UVD結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，使用方便，售價(jià)便宜、高靈敏度和穩(wěn)定性。局限性UVD檢測(cè)的物質(zhì)必須具有吸收紫外光的生色團(tuán)，而相應(yīng)的流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下則應(yīng)當(dāng)是無紫外吸收的。這一特性大大限制了其能檢測(cè)的物質(zhì)范圍和一些良好溶劑的使用。許多成分沒有紫外吸收或?yàn)樽贤饽┒宋眨袝r(shí)可用低波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，但梯度洗脫時(shí)出現(xiàn)基線漂移，溶劑峰干擾，溶劑選擇受其截止波長(zhǎng)限制。,-,45,示差折光檢測(cè)器(RID),RID是一種通用的檢測(cè)器，它基于色譜柱流出物光折射率的變化來連續(xù)測(cè)定樣品濃度。特點(diǎn)穩(wěn)定、易于操作，樣品不被破壞和具有較好的靈敏度。缺點(diǎn)對(duì)工作環(huán)境要求很苛刻，要求恒溫、恒流速，且無法采用梯度洗脫其檢測(cè)靈敏度也不夠高。,-,46,光電二極管陣列檢測(cè)器(DAD),原理光源經(jīng)光學(xué)反射鏡通過流動(dòng)池，再經(jīng)分光系統(tǒng)、狹縫照射到一組光電二極管上，由數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)實(shí)時(shí)記錄下組分的光譜吸收，得到三維的立體譜圖。用一組光電二極管同時(shí)檢測(cè)透過樣品的所有波長(zhǎng)紫外光，而不是某一個(gè)或幾個(gè)波長(zhǎng)，和普通的紫外可見分光檢測(cè)器不同的是進(jìn)入流動(dòng)池的光不再是單色光。它具有以下優(yōu)點(diǎn)：可得任意波長(zhǎng)的色譜圖，極為方便；可得任意時(shí)間的光譜圖，相當(dāng)于與紫外聯(lián)用；提供組分的定性信息。,-,47,蒸發(fā)光檢測(cè)器（ELSD）,ESLD是質(zhì)量型、高靈敏度的通用液相色譜檢測(cè)器。它檢測(cè)的三個(gè)主要過程：霧化色譜柱流出物經(jīng)過針頭式的細(xì)導(dǎo)管進(jìn)入霧化器，與氣體混合噴成均勻一致的霧滴；蒸發(fā)霧滴經(jīng)過加熱的漂移管，流動(dòng)相被蒸發(fā)，溶質(zhì)形成極細(xì)的顆粒；檢測(cè)溶質(zhì)顆粒氣體在檢測(cè)池發(fā)生散射作用，經(jīng)光電倍增管成電信號(hào)輸出。,-,48,ESLD的優(yōu)點(diǎn),適用范圍廣原則上對(duì)所有的化合物都能測(cè)定，不論化合物是否存在生色團(tuán)或電活性基團(tuán)。適用于梯度洗脫流動(dòng)相在樣品檢測(cè)前揮去；高靈敏度與示差檢測(cè)器(RI)及低波長(zhǎng)紫外檢測(cè)相比。由于它的這些優(yōu)點(diǎn)，它有可能像氣相色譜中的氫火焰檢測(cè)器(FID)那樣成為液相色譜的高靈敏度通用檢測(cè)器。,-,49,ESLD的應(yīng)用,沒有紫外吸收或?yàn)樽贤饽┒巳跷盏臉悠稥LSD的響應(yīng)與被測(cè)物的質(zhì)量成正比，而不依賴于被測(cè)物的光學(xué)特性及官能團(tuán)。理論上可用于揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何組分的檢測(cè)。在天然藥物化學(xué)成分中常見的有糖類、皂甙類（皂甙無紫外吸收或僅為末端吸收，使得皂甙測(cè)定在應(yīng)用HPLC-UV法及選擇流動(dòng)相優(yōu)化分離時(shí)均存在一定的困難。ELSD檢測(cè)則較好地解決了這個(gè)問題。從目前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道來看，ELSD的應(yīng)用亦以分析這類成分及甾類等最多。流動(dòng)相有紫外吸收干擾或梯度洗脫時(shí)基線漂移影響測(cè)定的情況用ELSD檢測(cè)，流動(dòng)相在漂移管便氣化蒸發(fā)，不影響樣品檢測(cè)。,-,50,高效液相色譜的應(yīng)用,中藥化學(xué)成分分析成分分離制備(1)特別適用于極性較大的成分(如皂苷類)分離；(2)先以分析色譜摸索分離條件；(3)樣品一定要用流動(dòng)相溶解，再以濾膜過濾。,-,51,根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離,在天然有機(jī)化合物分離及精制工作中，吸附現(xiàn)象利用得十分廣泛。其中又以固-液吸附用得最多，其分：物理吸附(表面吸附，physicaladsorption)：以硅膠、氧化鋁及活性炭為吸附劑化學(xué)吸附（chemicaladsorption）半化學(xué)吸附（semichemicaladsorption）：聚酰胺層析,-,52,1、物理吸附,液-固物理吸附色譜是運(yùn)用較多的一種方法，特別適用于很多中等分子量的樣品（分子量小于1，000的低揮發(fā)性樣品）的分離，尤其是脂溶性成分。一般不適用于高分子量樣品如蛋白質(zhì)、多糖或離子型親水性化合物等的分離。吸附層析的分離效果，決定于吸附劑、溶劑和被分離化合物的性質(zhì)這三個(gè)因素。,-,53,吸附劑,硅膠氧化鋁活性炭,-,54,硅膠,層析用硅膠為一多孔性物質(zhì)，分子中具有硅氧烷的交鏈結(jié)構(gòu)，同時(shí)在顆粒表面又有很多硅醇基。硅膠吸附作用的強(qiáng)弱與硅醇基的含量多少有關(guān)。硅醇基能夠通過氫鍵的形成而吸附水分，因此硅膠的吸附力隨吸著的水分增加而降低。硅膠是一種酸性吸附劑，適用于中性或酸性成分的層析。同時(shí)硅膠又是一種弱酸性陽(yáng)離子交換劑，其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子，當(dāng)遇到較強(qiáng)的堿性化合物，則可因離子交換反應(yīng)而吸附堿性化合物。,-,55,氧化鋁,氧化鋁帶有堿性，對(duì)于分離一些堿性中草藥成分，如生物堿類的分離頗為理想。但是氧化鋁不宜用于醛、酮、酸、內(nèi)酯等類型的化合物分離。因?yàn)閴A性氧化鋁可與上述成分發(fā)生次級(jí)反應(yīng)，如異構(gòu)化、氧化、消除反應(yīng)等。用稀硝酸或稀鹽酸處理氧化鋁，不僅可中和氧化鋁中含有的堿性雜質(zhì)，并可使氧化鋁顆粒表面帶有NO3-或Cl-的陰離子，從而具有離于交換劑的性質(zhì)，適合于酸性成分的層析，這種氧化鋁稱為酸性氧化鋁。,-,56,活性炭,是一種非極性吸附劑?；钚蕴恐饕糜诜蛛x水溶性成分，如氨基酸、糖類及某些甙。活性炭為吸附作用，在水溶液中最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力最弱，而有機(jī)溶劑則較強(qiáng)。例如以醇-水進(jìn)行洗脫時(shí)，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加?；钚蕴繉?duì)芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，對(duì)大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開，單糖與多糖分開，氨基酸與多肽分開。,-,57,吸附劑的特點(diǎn),硅膠和氧化鋁為極性吸附劑，有以下特點(diǎn)：對(duì)極性物質(zhì)具有較強(qiáng)的親和能力。故同為溶質(zhì)，極性強(qiáng)者將被優(yōu)先吸附。溶劑極性越弱，則吸附劑對(duì)溶質(zhì)將表現(xiàn)出越強(qiáng)的吸附能力。溶劑極性增強(qiáng)，則吸附劑對(duì)溶質(zhì)的吸附能力即隨之減弱。溶質(zhì)即使被硅膠、氧化鋁吸附，但一旦加入極性較強(qiáng)的溶劑時(shí)，又可被后者置換洗脫下來。,-,58,吸附劑的特點(diǎn),活性炭因?yàn)槭欠菢O性吸附劑，故與硅膠、氧化鋁相反，對(duì)非極性物質(zhì)具有較強(qiáng)的親和能力，在水中對(duì)該類物質(zhì)表現(xiàn)出強(qiáng)的吸附能力。溶劑極性降低，則活性炭對(duì)該類物質(zhì)的吸附能力也隨之降低。故從活性炭上洗脫被吸附物質(zhì)時(shí)，洗脫溶劑的洗脫能力將隨溶劑極性的減弱而增強(qiáng)。,-,59,溶劑,洗脫劑的選擇，須根據(jù)被分離物質(zhì)與所選用的吸附劑性質(zhì)這兩者結(jié)合起來加以考慮。在用極性吸附劑進(jìn)行層析時(shí)，當(dāng)被分離物質(zhì)為弱極性物質(zhì)，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑；被分離物質(zhì)為強(qiáng)極性成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對(duì)某一極性物質(zhì)用吸附性較弱的吸附劑（如以硅藻土或滑石粉代替硅膠），則洗脫劑的極性亦須相應(yīng)降低。,-,60,被分離物質(zhì)的性質(zhì),被分離的物質(zhì)與吸附劑，洗脫劑共同構(gòu)成吸附層析中的三個(gè)要素，彼此緊密相連。在指定的吸附劑與洗脫劑的條件下，各個(gè)成分的分離情況，直接與被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有關(guān)。對(duì)極性吸附劑而言，成分的極性大，吸附性強(qiáng)。,-,61,化合物的極性及其強(qiáng)弱判斷,官能團(tuán)的極性強(qiáng)弱化合物的極性則由分子中所含官能團(tuán)的種類、數(shù)目及排列方式等綜合因素所決定。,-,62,官能團(tuán)的極性強(qiáng)弱,-,63,化合物的極性,化合物的極性則由分子中所含官能團(tuán)的種類、數(shù)目及排列方式等綜合因素所決定。極性基團(tuán)的數(shù)目愈多，化合物的極性越大，被吸附的性能就會(huì)更大些，在同系物中碳原子數(shù)目少些，被吸附也會(huì)強(qiáng)些。總之，只要兩個(gè)成分在結(jié)構(gòu)上存在差別，就有可能分離，關(guān)鍵在于條件的選擇。,-,64,化合物的極性,被分離物質(zhì)極性很小為不含氧的萜烯，或雖含氧但非極性基團(tuán)，則需選用吸附性較強(qiáng)的吸附劑，并用弱極性溶劑如石油醚或苯進(jìn)行洗脫。但多數(shù)中藥成分的極性較大，則需要選擇吸附性能較弱的吸附劑（一般級(jí)）。采用的洗脫劑極性應(yīng)由小到大梯度遞增，或可應(yīng)用薄層層析以判斷被分離物在某種溶劑系統(tǒng)中的分離情況。此外，能否獲得滿意的分離，還與選擇的溶劑梯度有很大關(guān)系。多組分的混合物，象植物油脂系由烷烴、烯烴、甾醇酯類、甘油三酸醋和脂肪酸等組份。當(dāng)以硅膠為吸附劑時(shí)，使油脂被吸附后選用一系列混合溶劑進(jìn)行洗脫，油脂中各單一成分即可按其極性大小的不同依次被洗脫。,-,65,2、吸附簿層色譜,薄層層析是一種簡(jiǎn)便、快速、微量的層析方法。一般將吸附劑撒布到平面如玻璃片上，形成一薄層進(jìn)行層析時(shí)，即稱薄層層析。針對(duì)某些性質(zhì)特殊的化合物的分離與檢出，有時(shí)需采用一些特殊薄層。,-,66,特殊薄層,熒光薄層絡(luò)合薄層酸堿薄層和PH緩沖薄層,-,67,熒光薄層,有些化合物本身無色，在紫外燈下也不顯熒光，又無適當(dāng)?shù)娘@色劑時(shí)，則可在吸附劑中加入熒光物質(zhì)制成熒光薄層進(jìn)行層析。展層后置于紫外光下照射，薄層板本身顯熒光，而樣品斑點(diǎn)處不顯熒光，即可檢出樣品的層析位置。常用的熒光物質(zhì)多為無機(jī)物。其一是在254nm紫外光激發(fā)下顯出熒光的，如錳激化的硅酸鋅。另一種為在365nm紫外光激發(fā)下發(fā)出熒光的，如銀激化的硫化鋅、硫化鎬。,-,68,絡(luò)合薄層,常用的有硝酸銀薄層，用來分離碳原子數(shù)相等而其中C一C雙鍵數(shù)目不等的一系列化合物，如不飽和醇、酸等。其主要機(jī)理是由于C-C鍵能與硝酸銀形成絡(luò)合物，而飽和的C-C鍵則不與硝酸銀絡(luò)合。因此在硝酸銀薄層上，化合物可由于飽和程度不同而獲得分離。層析時(shí)飽和化合物由于吸附最弱而Rf最高，含一個(gè)雙鍵的較含兩個(gè)雙鍵的Rf值高，含一個(gè)三鍵的較含一個(gè)雙鍵的Rf值高。在一個(gè)雙鍵化合物中，順式的與硝酸銀絡(luò)合較反式的易于進(jìn)行。因此，還可用來分離順反異構(gòu)體。,-,69,酸堿薄層和pH緩沖薄層,為了改變吸附劑原來的酸堿性，可在鋪制薄層時(shí)采用稀酸或稀堿以代替水調(diào)制薄層。例如硅膠帶微酸性，有時(shí)對(duì)堿性物質(zhì)如生物堿的分離不好，如不能展層或拖尾，則可在鋪薄層時(shí)，用稀堿溶液0.105NNa0H溶液制成堿性硅膠薄層。例如豬屎豆堿在以硅膠為吸附劑時(shí)，以氯仿-丙酮-甲醇（821）為展開劑Rf0.1，采用堿性硅膠薄層用上述相同展開劑，Rf值增至0.4左右。說明豬屎豆堿為-堿性生物堿。,-,70,薄層層析法應(yīng)用,化學(xué)成分的預(yù)試化學(xué)成分的鑒定探索柱層分離的條件,-,71,化學(xué)成分的預(yù)試,用薄層層析法進(jìn)行中草藥化學(xué)成分預(yù)試，可依據(jù)各類成分性質(zhì)及熟知的條件，有針對(duì)性地進(jìn)行。由于在薄層上展層后，可將一些雜質(zhì)分離，選擇性高，可使預(yù)試結(jié)果更為可靠。,-,72,化學(xué)成分的鑒定,以薄層層析法進(jìn)中草藥化學(xué)成分鑒定，最好要有標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行共薄層層析。如用數(shù)種溶劑展層后，標(biāo)準(zhǔn)品和鑒定品的Rf值、斑點(diǎn)形狀顏色都完全相同，則可作初步結(jié)論是同一化合物。但一般需進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)或紅外光譜等一種儀器分析方法加以核對(duì)。,-,73,探索柱層分離的條件,在進(jìn)行柱層分離時(shí)，首先考慮選用何種吸附劑與洗脫劑。在洗脫過程中各個(gè)成分將按何種順序被洗脫，每一洗脫液中是否為單一成分或混合體，均可由薄層的分離得到判斷與檢驗(yàn)。通過薄層的預(yù)分離，還可以了解多組分樣品的組成與相對(duì)含量。如在薄層上摸索到比較滿意的分離條件，即可將此條件用于干柱層析。,-,74,3、制備薄層色譜（PTLC）,一種是流動(dòng)相靠毛細(xì)管作用力流經(jīng)固定相（傳統(tǒng)的制備型薄層薄層色譜），另一些方法是流動(dòng)相靠外力強(qiáng)制流動(dòng)，如離心薄層色譜和加壓薄層色譜。,-,75,3、制備薄層色譜（PTLC）,吸附劑硅膠是最常用的吸附劑。上樣量與吸附劑的厚度有關(guān)。上樣上樣是進(jìn)行PTLC分離的一個(gè)最關(guān)鍵的步驟。上樣前先用樣品溶于少量溶劑，低揮發(fā)性溶劑可引起點(diǎn)樣帶變寬，因此最好選用揮發(fā)性溶劑（如己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等）。樣品濃度應(yīng)在5%-10%左右。點(diǎn)樣帶應(yīng)盡可能狹窄，以獲得更好的分離效果。點(diǎn)樣可用手工進(jìn)行或自動(dòng)點(diǎn)樣儀。展開劑的選擇及展開在進(jìn)行PTLC之前應(yīng)用分析型TLC預(yù)試驗(yàn)來確定展開劑。被分離物質(zhì)的回收,-,76,3、吸附柱色譜（柱層析）,吸附劑的用量一般為樣品量的3060倍。樣品極性較小、難以分離者，吸附劑用量可適當(dāng)提高到樣品量的100200倍。據(jù)此可選擇適當(dāng)規(guī)格的色譜管，實(shí)驗(yàn)室中常用色譜管的規(guī)格如下所示，其高度與直徑比（h/d）約為（151）（20：1）。柱色譜用的硅膠及氧化鋁通常以100200目或200300目為宜，或甚至直接采用薄層色譜用規(guī)格，其分離效果可以大大提高。,-,77,4、吸附柱色譜,洗脫劑的選擇，以TLC摸索洗脫條件裝柱，濕法裝柱（以起始洗脫劑拌勻裝柱）或干法裝柱,-,78,4、吸附柱色譜,（3）樣品的預(yù)處理能直接溶于洗脫劑的樣品用適量洗脫劑溶解樣品，盡可能少，以利樣品在吸附劑柱上形成狹窄的原始譜帶。不能溶解于洗脫劑的樣品，則將用能使之溶解的溶劑溶解后，再用少量吸附劑拌勻，并減壓抽干溶劑或在60下加熱揮盡溶劑，置真空干燥器中減壓干燥或直接減壓抽干、研粉后再小心鋪在吸附劑柱上。,-,79,4、吸附柱色譜,（4）洗脫用溶劑的極性宜逐步增加，跳躍不能太大。實(shí)踐中多用混合溶劑，并通過巧妙調(diào)節(jié)比例以改變極性，達(dá)到梯度洗脫分離物質(zhì)的目的。一般混合溶劑中強(qiáng)極性溶劑的影響比較突出，故不可隨意將極性差別很大的兩種溶劑組合在一起使用。實(shí)驗(yàn)室中最常應(yīng)用的混合溶劑組合如下：,-,80,吸附柱色譜常用混合洗脫溶劑,-,81,4、吸附柱色譜,（5）為避免發(fā)生化學(xué)吸附，酸性物質(zhì)宜用硅膠、堿性物質(zhì)則宜用氧化鋁進(jìn)行分離。硅膠、氧化鋁用適當(dāng)方法處理成中性時(shí)，情況會(huì)有所緩解。通常在分離酸性（或堿性）物質(zhì)時(shí)，洗脫溶劑中分別加入適量醋酸（或氨、吡啶、二乙胺），常可收到防止拖尾、促進(jìn)分離的效果。,-,82,5、聚酰胺吸附色譜法,聚酰胺（poliamide）吸附屬于氫鍵吸附，是一種用途十分廣泛的分離方法，極性物質(zhì)與非極性物質(zhì)均可適用，但特別適合分離酚類、醌類、黃酮類化合物。,-,83,（1）聚酰胺的吸附原理,系通過分子中的酰胺羰基與酚類、黃酮類化合物的酚羥基，或酰胺鍵上的游離胺基與醌類、脂肪羧酸上的羰基形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附。至于吸附強(qiáng)弱則取決于各種化合物與之形成氫鍵的能力。,-,84,聚酰胺的吸附原理,在含水溶劑中大致有以下規(guī)律：形成氫鍵的基團(tuán)數(shù)目越多，則吸附能力越強(qiáng)。成鍵位置對(duì)吸附力也有影響。易形成分子內(nèi)氫鍵者，其在聚酰胺上的吸附即相應(yīng)減弱。分子中芳香化程度高者，則吸附性增強(qiáng)；反之，則減弱。,-,85,聚酰胺的吸附原理,吸附因?yàn)槭窃谌芤褐羞M(jìn)行，故溶劑也會(huì)參加吸附劑表面的爭(zhēng)奪，或通過改變聚酰胺對(duì)溶質(zhì)的氫鍵結(jié)合能力而影響吸附過程。聚酰胺與酚類或醌類等化合物形成氫鍵締合的能力在水中最強(qiáng)，在含水醇中則隨醇濃度的增高而相應(yīng)減弱，在高濃度醇或其它有機(jī)溶劑中則幾乎不締合。故在聚酰胺柱色譜分離時(shí)，通常用水裝柱，樣品也盡可能作成水溶液上柱以利聚酰胺對(duì)溶質(zhì)的充分吸附，隨后用不同濃度的含水醇洗脫，并不斷提高醇的濃度，逐步增強(qiáng)從柱上洗脫物質(zhì)的能力。,-,86,聚酰胺的吸附原理,甲酰胺、二甲基甲酰胺及尿素水溶液因分子中均有酰胺基，作為第三者可以同時(shí)與聚酰胺及酚類等化合物形成氫鍵締合，故有很強(qiáng)的洗脫能力。此外，水溶液中加入堿或酸均可破壞聚酰胺與溶質(zhì)之間的氫鍵締合，也有較強(qiáng)的洗脫能力，可用于聚酰胺的精制及再生處理。常用的聚酰胺再生劑有10%醋酸、3%氨水及5%氫氧化鈉水溶液等。,-,87,聚酰胺的吸附原理,各種溶劑在聚酰胺柱上的洗脫能力由弱至強(qiáng)，可大致排列成下列順序：水甲醇丙酮?dú)溲趸c水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液,-,88,聚酰胺色譜的應(yīng)用,聚酰胺對(duì)一般酚類、黃酮類化合物的吸附是可逆的（鞣質(zhì)除外），分離效果好，加以吸附容量又大，故聚酰胺色譜特別適合于該類化合物的制備分離。對(duì)生物堿、萜類、甾體、糖類、氨基酸等其它極性與非極性化合物的分離也有廣泛的用途。因?yàn)閷?duì)鞣質(zhì)的吸附特強(qiáng)，近乎不可逆，故用于植物粗提取物的脫鞣質(zhì)處理特別適宜。聚酰胺色譜也有薄層色譜和柱色譜兩種方式。,-,89,6、大孔吸附樹脂,大孔吸附樹脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)人工合成的聚合物吸附劑，具有較好的吸附性能。它的吸附作用是通過表面吸附、表面電性或形成氫鍵。大孔樹脂吸附分離技術(shù)是采用特殊的吸附劑，選擇地吸附其中的有效成分，去除無效成分的一種提取精制的新工藝。,-,90,大孔吸附樹脂的性質(zhì),大孔吸附樹脂多為白色的球狀顆粒粒度多為2060目，通常分為非極性和極性兩大類，根據(jù)極性大小還可分為弱極性、中等極性和強(qiáng)極性。常用的為苯乙烯型和丙烯腈型，在樹脂合成時(shí)根據(jù)需要引入極性基團(tuán)則成為極性樹脂從而增強(qiáng)吸附能力。大孔吸附樹脂的理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑。對(duì)有機(jī)物的選擇性較好，不受無機(jī)鹽類及強(qiáng)離子低分子化合物存在的影響。,-,91,大孔吸附樹脂的分離原理,吸附性范德華引力或生成氫鍵的結(jié)果。篩選原理本身多孔性結(jié)構(gòu)所決定。由于吸附和篩選原理，有機(jī)化合物根據(jù)吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附脂上經(jīng)一定的溶劑洗脫而分開。,-,92,大孔吸附樹脂的分離原理,有機(jī)物與無機(jī)物的分離一般的吸附樹脂對(duì)溶液中的無機(jī)離子沒有任何吸附能力，在吸附混合物時(shí)，有機(jī)物被樹脂吸附，無機(jī)離子則隨水流出，因而很容易將二者分離。在中藥成分的提取中，此特征可使提取物中的重金屬和灼燒灰分降至要求的范圍內(nèi)。,-,93,大孔吸附樹脂的分離原理,解離物與非解離物的分離吸附樹脂對(duì)有機(jī)解離物與非解離物的吸附能力有很大差異。因此，可將二者分離。如有機(jī)酸在高pH值成鹽，很難被吸附，因此在堿性條件下可把有機(jī)酸分離出來。生物堿在酸性介質(zhì)中可以成鹽，因而能通過調(diào)節(jié)pH值進(jìn)行分離。,-,94,大孔吸附樹脂的分離原理,一般有機(jī)物與強(qiáng)水溶性物質(zhì)的分離一般有機(jī)物，包括大多數(shù)中藥有效成分，是指有一定的水溶性，但溶解度不大的物質(zhì)，這些物質(zhì)容易被樹脂吸附。強(qiáng)水溶性物質(zhì)如低級(jí)醇類、低級(jí)胺類、糖及多糖、多數(shù)氨基酸、肽類、蛋白質(zhì)等，難被普通吸附樹脂吸附。用普通樹脂可很容易地將此兩類物質(zhì)分離。,-,95,（3）大孔吸附樹脂分離條件的確立,1、樹脂的選擇首先，要根據(jù)被分離化合物的分子體積的大小通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定適當(dāng)孔徑的樹脂。其次，要根據(jù)分子中是否含有酚羥基、羧基或堿性氮原子來確定樹脂的型號(hào)和分離條件。,-,96,大孔吸附樹脂分離條件的確立,2、洗脫液的選擇對(duì)非極性大孔吸附樹脂，洗脫劑極性越小，洗脫能力越強(qiáng)。對(duì)中等極性大孔樹脂和極性較大的化合物來說，則用極性較大的洗脫劑為佳。根據(jù)吸附力強(qiáng)弱選用不同的洗脫劑及濃度。為達(dá)到滿意的效果，可通過幾種洗脫劑濃度的比較來確定最佳洗脫濃度。實(shí)際工作中甲醇、乙醇、丙酮應(yīng)用較多。,-,97,大孔吸附樹脂在中藥生產(chǎn)中應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn),1、縮小劑量，提高制劑的內(nèi)在質(zhì)量大孔吸附樹脂處理可減少提取物中的雜質(zhì)，提高效成分的含量，使制劑劑量減小，有利于制成現(xiàn)代劑型的中藥制劑，并便于質(zhì)量控制。,-,98,大孔吸附樹脂在中藥生產(chǎn)中應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn),2、減小產(chǎn)品的吸濕性傳統(tǒng)的提取方法所提的中成藥大部分具有較強(qiáng)的吸潮性，是中藥生產(chǎn)及儲(chǔ)藏中長(zhǎng)期存在的問題。而經(jīng)大孔吸附樹脂處理可有效去除吸潮成分，增強(qiáng)產(chǎn)品的穩(wěn)定性。3、有效去除重金屬既保證了患者的用藥安全，同時(shí)也解決了中藥重金屬超標(biāo)的難題，為中藥進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)創(chuàng)造了條件。,-,99,大孔吸附樹脂在中藥生產(chǎn)中的應(yīng)用,活性成分的提取分離如皂甙（人參總皂甙、蒺藜總皂昔）、黃酮（葛根總黃酮、山楂總黃酮、淫羊藿總黃酮）、內(nèi)酯、生物堿等化合物；,-,100,大孔吸附樹脂在中藥生產(chǎn)中的應(yīng)用,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定除去干擾成分，如金向群等在用薄層掃描法測(cè)定益壽永真口服液中人參皂甙Rg1的含量時(shí)，用YPRII型大孔吸附樹脂對(duì)樣品進(jìn)行處理，70乙醇的洗脫液即為含人參皂甙Rg1的流分，由于去除了人參皂甙Rg1的色譜位置的干擾成分，可進(jìn)行薄層掃描來確定人參皂苛Rg1的含量，為復(fù)方中的人參皂甙Rg1的含量測(cè)定提供了一個(gè)簡(jiǎn)便可行的方法。,-,101,大孔吸附樹脂的處理,市售大孔吸附樹脂一般含有未聚合的單體、致孔劑（多為長(zhǎng)碳鏈的脂肪醇類）、分散劑和防腐劑等雜質(zhì)，使用前必須經(jīng)過處理。處理方法是：采用乙醇濕法裝柱，隨用乙醇在柱上作流動(dòng)清洗，并不時(shí)檢查流出的乙醇，直至流出的乙醇液與水混合不呈現(xiàn)白色乳濁現(xiàn)象即可，然后用大量蒸餾水洗去乙醇。,-,102,大孔吸附樹脂柱色譜,樣品一般用水溶液上柱。洗脫時(shí)根據(jù)吸附作用強(qiáng)弱不同選用不同濃度的甲醇、乙醇等含水溶劑，直至純的甲醇、乙醇，乃至丙酮、乙酸乙酯等。對(duì)非極性大孔吸附樹脂，洗脫溶劑極性越小，洗脫能力越強(qiáng)。對(duì)于中等極性的大孔吸附樹脂和極性較大的化合物來說，則以用極性較大的溶劑為宜。,-,103,根據(jù)物質(zhì)分子大小差異進(jìn)行分離,天然有機(jī)化合物分子大小各異，中藥的化學(xué)成分非常復(fù)雜，通常含有無機(jī)鹽、生物堿、氨基酸和有機(jī)酸、酚類、酮類、皂昔、甾族和萜類化合物以及蛋白質(zhì)、多糖、粘液質(zhì)、鞣質(zhì)、淀粉、纖維素、無機(jī)鹽等。相對(duì)分子質(zhì)量的分布很寬，從幾十到幾百萬道爾頓。故可據(jù)此進(jìn)行分離。表1列出了部分中藥所含主要成分的相對(duì)分子質(zhì)量范圍。,-,104,部分中藥主要成分的相對(duì)分子質(zhì)量,-,105,根據(jù)物質(zhì)分子大小差異進(jìn)行分離,一般來講，高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)主要是膠體和纖維素等非藥效成分或藥效較低的成分，藥物有效部位的相對(duì)分子質(zhì)量一般較小，僅有幾百到幾千道爾頓。,-,106,根據(jù)物質(zhì)分子大小差異進(jìn)行分離,1、凝膠過濾法2、透析法3、超濾法4、超速離心法,-,107,1、凝膠過濾法（gelfiltration）,也叫凝膠滲透色譜法（gelpermeationchromatography）、分子篩過濾（molecularsievefiltration）、排阻色譜(exclusionchromatography）。利用分子篩分離物質(zhì)的一種方法。,-,108,凝膠過濾法分離原理,葡聚糖凝膠在水中膨脹成球形顆粒，具有三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。由于凝膠網(wǎng)孔半徑的限制，大分子將不能滲入凝膠顆粒內(nèi)部（即被排阻在凝膠粒子外部），故在顆粒間隙移動(dòng)，并隨溶劑一起從柱底先行流出；小分子因可自由滲入并擴(kuò)散到凝膠顆粒內(nèi)部，故通過色譜柱阻阻力增大、流速邊緩，將較晚流出。樣品混合物中各個(gè)成分因分子大小