血涂片制備和染色（課堂PPT）

,血液一般檢驗(yàn)主講人:李學(xué)民,1,復(fù)習(xí)血液標(biāo)本采集和抗凝劑選擇,血標(biāo)本：全血：血細(xì)胞+血漿;臨床血液學(xué)檢查，血細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類和形態(tài)學(xué)檢查血漿：全血除去血細(xì)胞；血漿病理性和生理性化學(xué)成分的測定，內(nèi)分泌激素、凝血因子（鈣除外）、血栓和止血檢查血清：離體后血液自然凝固后析出的液體成分（除纖維蛋白原等凝血因子）；臨床化學(xué)和臨床免疫學(xué)檢查，可見血漿與血清的主要區(qū)別是，血清中不含纖維蛋白原。,2,一、采血方法,靜脈采血法部位：主要是肘靜脈。還可以在：手背、內(nèi)踝、股靜脈，幼兒可采用頸外靜脈采血注意事項(xiàng):抽血時(shí)只能外抽不能內(nèi)推，以免形成空氣栓塞,3,4,部位：WHO推薦中指或無名指尖內(nèi)側(cè)為宜，耳垂采血受溫度影響大；半歲以下拇指或足部，特殊人員視情況而定。采血步驟及注意事項(xiàng)：應(yīng)嚴(yán)格實(shí)行一人一針制；穿刺的深度的適當(dāng)，切忌用力擠壓，以免混入組織液，影響檢驗(yàn)結(jié)果。用消毒干棉球擦去第一滴血，以后流出的血液可以使用。,皮膚采血法（毛細(xì)血管采血法）,5,二、抗凝劑選擇,抗凝：用物理或化學(xué)方法除去或抑制血液中的某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固抗凝劑：能夠阻止血液凝固的物質(zhì)，稱抗凝劑,6,乙二胺四乙酸（EDTA）鹽,抗凝原理：螯合鈣離子使用方法：15g/L濃度EDTA和血液1：10適用范圍：血細(xì)胞形態(tài)、血小板計(jì)數(shù)。但影響血小板聚集和白細(xì)胞吞噬功能所以不適合做凝血象檢驗(yàn)及血小板功能試驗(yàn),7,草酸鹽（sodiumoxalate）,草酸鈉、草酸鉀、草酸銨原理：草酸鹽可與血中鈣離子生成草酸鈣沉淀，從而阻止血液凝固用范圍：凝血象檢查,8,肝素（heparin）,原理：低濃度時(shí)抑制因子a、和PF3之間的作用，加強(qiáng)抗凝血酶（AT-）滅活絲氨酸蛋白酶，從而阻止凝血酶形成,還能抑制凝血酶的自我催化及抑制因子的作用；高濃度時(shí)阻斷凝血酶和纖維蛋白的反應(yīng)適用方法：1g/L濃度的肝素鈉與血液1：10優(yōu)點(diǎn)：抗凝能力強(qiáng)、不影響血細(xì)胞體積、不易溶血、能耐高溫適用范圍：紅細(xì)胞檢驗(yàn)（紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白測定、紅細(xì)胞比積）和多種生化分析,9,枸櫞酸鹽（枸櫞酸三鈉）,原理：螯合鈣離子使用方法：配成109mmol/L的濃度和血液1：9106mmol/L的濃度和血液1：4適用范圍：止血學(xué)檢驗(yàn)、血沉、輸血保養(yǎng)液（毒性?。?10,3.血液標(biāo)本檢驗(yàn)后的處理,血源性污染是醫(yī)源性污染的主要來源之一，檢驗(yàn)后的血液標(biāo)本處理不當(dāng)，其危害極大。對于檢驗(yàn)完畢的血液標(biāo)本首先要進(jìn)行高壓滅菌，然后再進(jìn)行無害化處理。帶有血液的檢驗(yàn)器材要用消毒液浸泡。采血用的注射器要進(jìn)行毀形、消毒并進(jìn)行無害化處理。,11,四：血液涂片制備,血涂片的顯微檢查是血液細(xì)胞學(xué)檢查的基本方法，臨床上應(yīng)用極為廣泛，特別是對于各種血液病的診斷具有重要的價(jià)值，近年來血細(xì)胞分析儀的廣泛應(yīng)用，血涂片的觀察也可作為判斷儀器結(jié)果的簡易方法。血涂片的用途：血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)、網(wǎng)織紅、寄生蟲檢驗(yàn)。,12,1：玻片的清潔,將載玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20分鐘，再用熱水將肥皂、血膜洗去，自來水反復(fù)沖洗，必要時(shí)用95%的乙醇浸泡1小時(shí)，擦干備用。新玻片常有游離堿質(zhì)，用重鉻酸鉀洗液或稀鹽酸（濃鹽酸稀釋10倍）浸泡24小時(shí)，再徹底洗滌。使用玻片時(shí)，要手持玻片邊緣，以保持玻片干燥、清潔、中性、無油膩。,13,2、血液涂片制備,將推玻片向1的方向稍抽回，當(dāng)血液充滿推玻片的寬度后，以一定均勻的速度向2的方向滑動(dòng)。,14,圖1-3血涂片制備示意圖（上：側(cè)面觀，下：正面觀）,15,血涂片質(zhì)量評(píng)價(jià),均勻、厚薄、頭體尾、邊緣、兩側(cè)注意：血滴大，速度快、角度大-血膜厚一張良好血涂片的標(biāo)準(zhǔn)是：厚薄適宜、頭體尾分明、細(xì)胞分布均勻、邊緣整齊、兩側(cè)及兩頭留有空隙，血膜長度約4厘米。,16,17,18,五、血液細(xì)胞染色,染料：生物學(xué)染色劑，將生物組織細(xì)胞和病原體染色，在顯微鏡下觀察結(jié)構(gòu)。發(fā)色基團(tuán)和助色基團(tuán)使生物學(xué)染色劑產(chǎn)生顏色和被染組織親合。,19,堿性染料：為陽離子染料，能接受質(zhì)子，染細(xì)胞核的染料。如亞甲藍(lán)、天青。酸性染料：為陰離子染料，能釋放質(zhì)子。主要有熒烷-氧雜蒽染料和偶氮染料兩類，能結(jié)合細(xì)胞的堿性成分并染色，如血紅蛋白、嗜酸性顆粒成分等。復(fù)合染料：同時(shí)具有陰、陽離子型的染料如瑞氏染料,20,細(xì)胞染色原理：,一般以它們的物理現(xiàn)象和/或化學(xué)現(xiàn)象為依據(jù)。物理作用：毛細(xì)管現(xiàn)象、滲透、吸收、吸附作用等化學(xué)作用：1.染料的化學(xué)成分：助色基團(tuán)的存在，堿性染料在溶媒中為陽離子型，易與組織和細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電荷的酸性物質(zhì)結(jié)合；而酸性染料在溶媒中為陰離子型，與帶正電荷的堿性物質(zhì)結(jié)合。2.蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)：蛋白質(zhì)中的氨基酸含有不同數(shù)量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同時(shí)還有其它活性基團(tuán)。在游離狀態(tài)時(shí)，-NH2獲得一個(gè)H+變成帶正電的-NH3+，而-COOH失去一個(gè)H+變成帶負(fù)電的-COO-。分別與不同染料結(jié)合。3.周圍環(huán)境的酸堿度：如環(huán)境pHpI（pI為等電點(diǎn)），則蛋白質(zhì)帶正電，結(jié)合酸性染料；反之，pHpI，則結(jié)合堿性染料。,21,（一）瑞氏染色法,瑞氏染料由酸性染料伊紅（eosin,E-）和堿性染料亞甲藍(lán)(methyleneblue,M+)組成復(fù)合染料。亞甲藍(lán)為氯鹽，即氯化美藍(lán)，有色部分為陽離子。美藍(lán)容易氧化天青。伊紅通常為鈉鹽。將伊紅和美藍(lán)溶解在甲醇中，即瑞氏染料。M+CL+NaE-ME+NaCL美藍(lán)伊紅伊紅化美藍(lán)（瑞氏染料）,22,染色原理,細(xì)胞的染色既有物理的吸附作用，又有化學(xué)的親和作用，各種細(xì)胞成分化學(xué)性質(zhì)不同，對各種染料的親和力也不一樣。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各種不同的色彩，例如血紅蛋白，嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)果，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；細(xì)胞核蛋白和淋巴細(xì)胞胞漿為酸性，與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合，染紫藍(lán)色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合，染淡紫色，稱為中性物質(zhì)。,23,圖1-4瑞氏染色原理示意圖,24,PH對細(xì)胞染色有影響,細(xì)胞各種成分均為蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)系兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液PH而定，在偏酸性環(huán)境中正電荷增多，易與伊紅結(jié)合，染色偏紅；在偏堿性環(huán)境中負(fù)電荷增多，易與美藍(lán)或天青結(jié)合，染色偏藍(lán)。因此細(xì)胞染色對氫離子濃度十分敏感，染色用玻片必須清潔，無酸堿污染。配制瑞氏染液必須用優(yōu)質(zhì)甲醇，稀釋染色必須用緩沖液，沖洗用水應(yīng)近中性，否則可導(dǎo)致各種細(xì)胞染色反應(yīng)異常，以致識(shí)別困難，甚至造成錯(cuò)誤。,25,試劑,Wright染液：瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0ml甲醇的作用：1、溶解瑞氏染料。2、有強(qiáng)大的脫水力，可將細(xì)胞固定為一定形態(tài)，固定血膜。3、使蛋白質(zhì)沉淀為顆粒狀、網(wǎng)狀等結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞與染料接觸表面積，提高對染料的物理吸附作用，增強(qiáng)染色效果。磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.4-6.8）：磷酸二氫鉀（無水）0.3g，磷酸氫二鈉（無水）0.2g,蒸餾水加到1000ml。配好后用磷酸鹽溶液校正pH，塞緊瓶口備用。,26,瑞氏染色方法,1.用蠟筆在血膜兩頭劃線，平放于染色架上。2.加瑞氏染液覆蓋血膜，固定1min。3.滴加等量或稍多的緩沖液，混勻，染色5-10分鐘。4.用清水沖洗，待干后鏡檢。,27,【質(zhì)量控制】,血膜要干透后才能染色，否則染色時(shí)易脫落.染色時(shí)間與染液濃度、室溫及細(xì)胞多少有關(guān)，一般染液淡、染色時(shí)間長些效果好。染液不能過少，以防蒸發(fā)沉淀。沖洗時(shí)不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖，防止染料沉著。沖洗時(shí)間也不能長。染色過淡，可復(fù)染。染色過深可用水沖洗或浸泡，還可用甲醇脫色.,28,29,【染色結(jié)果評(píng)價(jià)】,正常情況：血膜外觀呈淡琥珀色。在顯微鏡下紅細(xì)胞染成粉紅色，在厚薄均勻處略有碟狀感。白細(xì)胞胞質(zhì)中的顆粒能顯示出各種細(xì)胞的特有色彩，細(xì)胞核染紫紅色，核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚。染色環(huán)境偏酸：則紅細(xì)胞和嗜酸性顆粒偏紅，白細(xì)胞核呈淺藍(lán)色或不著色，染色過酸pH3.5時(shí)，則呈現(xiàn)一片紅色，白細(xì)胞中除嗜酸性顆粒外均不著色。染色環(huán)境偏堿：則所有細(xì)胞呈灰藍(lán)色，微偏堿者紅細(xì)胞暗紅、白細(xì)胞顆粒深暗。嗜酸性顆粒可染成暗褐色甚至黑紫色或藍(lán)色。中性顆粒也偏粗染成紫黑色，血膜過厚的地方呈綠色。,30,（二）姬姆薩染色法,原理吉姆薩染液由天青，伊紅組成。染色原理和結(jié)果與瑞特染色法基本相同。但本法對細(xì)胞核和寄生蟲著色較好，結(jié)構(gòu)顯示更清晰，而胞質(zhì)和中性顆粒則著色較差。,31,吉姆薩染料1.0g甘油66.0ml甲醇（AR）66.0ml染色方法1.甲醇固定干燥血膜3-5min2.將血膜在染液中浸染10-30min3.流水沖洗,待干后鏡檢,試劑,32,（三）瑞氏-吉姆薩染色,【原理】將瑞特染料和吉姆薩染料按一定比例混合后對細(xì)胞進(jìn)行染色，其染色原理同瑞特和吉姆薩染色法，但染色效果更佳，因?yàn)槠渚C合了瑞士和吉姆薩染色法的優(yōu)點(diǎn)。,33,【瑞氏-吉姆薩染色試劑】,瑞特染料1.0g吉姆薩染料0.3g甲醇加至500ml先將瑞特染料和吉姆薩染料充分研磨混勻，甲醇溶解倒入容器中，未溶解完的繼續(xù)加入甲醇研磨，重復(fù)多次，最后把染液加至500ml。,34,瑞氏-吉姆薩染色方法,血片滴加染液5滴蓋滿血膜，2min后加入pH6.4-6.8磷酸鹽緩沖液（同瑞氏染液）緩沖液10滴，10min后用流水沖洗干凈，待干后鏡檢。,35,【方法學(xué)評(píng)價(jià)】,瑞氏染液和吉姆薩染液對細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)有各自的顯色特征，前者對細(xì)胞質(zhì)和顆粒著色較好，后者對細(xì)胞核結(jié)構(gòu)顯示清晰。因此將二者結(jié)合，能取長補(bǔ)短、集中優(yōu)勢，用該混合染液對血細(xì)胞進(jìn)行染色，其細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)顆粒均著色鮮艷，對比鮮明。瑞氏-吉姆薩混合染色法是臨床上廣泛使用的方法。,36,六、血細(xì)胞顯微鏡計(jì)數(shù)法,37,六、血細(xì)胞顯微鏡計(jì)數(shù)法,（一）原理用一定的稀釋液將標(biāo)本作定量稀釋，混勻充入計(jì)數(shù)池中，在顯微鏡下計(jì)數(shù)一定容積中的血細(xì)胞數(shù)，經(jīng)換算求得每升血液中的血細(xì)胞總數(shù)。,38,血細(xì)胞計(jì)數(shù),人工顯微鏡計(jì)數(shù)法,自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀法,直接計(jì)數(shù)法,間接計(jì)數(shù)法,半自動(dòng)（二、三分群）,全自動(dòng)（五分群）,39,顯微鏡細(xì)胞計(jì)數(shù)法,【測定方法及評(píng)價(jià)】將樣本做適當(dāng)稀釋（或濃縮），充入細(xì)胞計(jì)數(shù)池，在顯微鏡下計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)板中一定體積內(nèi)細(xì)胞數(shù)，經(jīng)換算得每升標(biāo)本的細(xì)胞數(shù)。如：血液RBC、WBC、PLT、嗜酸細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞直接計(jì)數(shù)，體液細(xì)胞計(jì)數(shù)（尿中細(xì)胞管型、精液中精子計(jì)數(shù)、腦脊液及漿膜腔積液細(xì)胞計(jì)數(shù)）等。該法計(jì)數(shù)誤差較大，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，已不能適應(yīng)大批量標(biāo)本的測定，將逐漸被血細(xì)胞分析儀所取代。,40,【試劑】各種不同的專用稀釋液或染色稀釋液?！酒鞑摹浚?）顯微鏡（2）微量吸管：Hb吸管：10、20l兩刻度毛細(xì)玻璃吸管：10、20l兩刻度一人一管，定期用水銀稱重法進(jìn)行校正誤差應(yīng)1%（3）計(jì)數(shù)板：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，常用改良Neubauer計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)板的構(gòu)造：（4）血蓋片規(guī)格24mm20mm0.6mm，要求：表面平整（不平整性0.002mm），高倍鏡檢查無裂痕，且本身有一定的重量。,41,血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造,24200.6mm,42,1855年發(fā)明計(jì)數(shù)紅細(xì)胞的計(jì)數(shù)板血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法是最可靠和最經(jīng)典計(jì)數(shù)技術(shù)改良Neubauer計(jì)數(shù)板,43,計(jì)數(shù)池劃線,1mm,1mm,44,計(jì)數(shù)池,45,計(jì)數(shù)池劃線,美國國家標(biāo)準(zhǔn)局（NBS）1941年規(guī)定：計(jì)數(shù)池大方格每邊長度的誤差應(yīng)在1%內(nèi)（10.01mm）;血蓋片與計(jì)數(shù)池間縫隙深度應(yīng)在2%以內(nèi)(0.10.002mm)。,46,【操作】（以血WBC計(jì)數(shù)為例）,WBC稀釋液0.38ml+血20l混勻后30s后灌