DNA的測序方法、原理及其應用ppt課件

DNA的測序方法、原理及其應用,1,一、DNA序列測定概述及其發(fā)展,即核酸DNA分子一級結(jié)構(gòu)的測定，是現(xiàn)代分子生物學一項重要的技術。其基本原理是DNA的復制反應體系中需要存在DNA聚合酶、DNA模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成雙鏈后，DNA聚合酶在引物的引導下在模板鏈上沿35的方向移動，dNTP按照堿基配對原則，逐個連接在引物的3-OH末端。,2,1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰島素51個氨基酸的序列測定，這在當時來說是一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和Maxam-Gilbert等人又建立了核酸序列測定的方法，Sanger雙脫氧末端終止法和Maxam-Gilbert化學裂解法將核酸序列測定技術推進到“直讀”階段，使核酸序列測定變得遠比蛋白質(zhì)氨基酸序列測定容易，這樣人們可以通過核酸序列和遺傳密碼推導出蛋白質(zhì)氨基酸的序列。,3,二、測序的常用方法,DNA序列測定常用方法有如下3種：,4,1）雙脫氧鏈終止法測序(thechainterminationmethod)基本原理：通過合成與單鏈DNA互補的多核苷酸鏈，由于合成的互補鏈可在不同位置隨機終止反應，產(chǎn)生只差一個核苷酸的DNA分子，從而來讀取待測DNA分子的順序。,5,用于終止反應的雙脫氧核苷酸：將2，3雙脫氧核苷酸（ddNTP）參入到新合成的DNA鏈中，由于參入的ddNTP缺乏3羥基，因此不能與下一位核苷酸反應形成磷酸二酯鍵，DNA合成反應將中止。,6,脫氧核苷酸的連接,7,X,8,9,2）Maxam-Gilbert化學降解法測序基本原理：用放射性核素標記待測DNA一側(cè)末端將標記DNA分為G、A+G、C+T、C4個反應體系用不同的化學試劑處理不同反應體系，隨機斷裂DNA片段某種堿基中的任何一個，產(chǎn)生一組一端為放射線標記的末端，另一端為不同大小的DNA片段的混合物電泳分離，放射自顯影得到互相錯落的梯形圖譜，即可讀出DNA序列,10,11,表-特異斷裂4種脫氧核苷酸的方法,12,在4種反應體系中，化學試劑特異地斷裂DNA的機制是：G反應-硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后斷開了C8-C9間的化學鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。G+A反應-（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。T+C反應-肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。C反應-在NaCl存在時，只有C才能與肼發(fā)生反應，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。,13,堿基特異性修飾及裂解,14,15,3）DNA自動化測序,特點原理同末端終止法標記物為熒光染料激光掃描自動測序結(jié)果清晰、準確、分辨率高測序速度快200bp/h,16,17,18,19,20,21,三、3種方法的比較,化學法沒有末端終止法應用廣泛，但有一個明顯的優(yōu)點，即所測序列來自原DNA分子而不是酶促合成反應所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化學法可以對合成的寡核苷酸進行測序，可以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，不能通過化學保護及修飾干擾實驗來研究DNA二級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。,22,Maxam-Gilbert法只需簡單化學試劑。所測序列來自原DNA分子而不是酶促合成反應所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化學法可以對合成的寡核苷酸進行測序，可以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況。但所能測定的長度要比Sanger法短一些，它對放射性標記末端250個核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果最佳。Sanger法雖需要單鏈模板和特異寡核苷酸，并需獲得大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段的高質(zhì)量酶制劑，而隨著M13噬菌體和噬菌粒載體的發(fā)展，也由于現(xiàn)成的合成引物容易獲得及測序反應日期完善，雙脫氧鏈終止法如今遠比Maxam-Gilbert法應用得廣泛。由于Sanger法既簡便又快速，目前大多數(shù)測序策略都是為Sanger法而設計的。,23,DNA自動測序與手工測序的不同點,1）標記物不同：手工測序采用放射性核素標記，而自動測序采用4種熒光染料分別標記ddNTP或標記引物2)加樣方式不同：手工測序，一個樣品的4個測序反應物分別在不同泳道進行，而自動測序可在一個泳道內(nèi)電泳3)檢測手段不同：手工測序采用放射自顯影，從4種寡聚核苷酸的梯子形圖譜中讀出DNA序列，而自動測序則采用激光掃描器同步掃描，計算機進行閱讀和編輯,24,四、DNA序列測定的應用,1)測序PCR克隆測序驗證突變體檢測新基因測序全基因組測序系統(tǒng)發(fā)育及物種鑒定2)片段分離個體識別：親緣鑒定SNP關聯(lián)分析疾病診斷等,25,26,一、在線分析的核心網(wǎng)站http:/bip.weizmann.ac.il/tools/#primaryhttp:/www.ebi.ac.uk/embl/http:/www.ddbj.nig.ac.jp/二、本地分析的重要軟件VectorNTISuite6.0及以上的版本：綜合分析、載體分析。DNAStar：綜合分析PrimerPremier5.0：引物設計Oligo7：寡核苷酸分析，引物計算GCG：蛋白質(zhì)、核酸序列,2、核苷酸序列的生物信息分析,26,西南大學生