第三節(jié)免疫檢測技術(shù)的基本原理 教育學(xué)習(xí)

第三節(jié)免疫檢測技術(shù)的基本原理,抗原、抗體反應(yīng)的原理，利用已知的抗原檢測未知的抗體或利用已知的抗體檢測未知的抗原.將免疫反應(yīng)與現(xiàn)代測試技術(shù)結(jié)合超微量的檢測,1,優(yōu)質(zhì)課件,2,優(yōu)質(zhì)課件,免疫學(xué)檢測技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),高度的靈敏性高度的特異性,3,優(yōu)質(zhì)課件,免疫分析技術(shù)的應(yīng)用,常用的診斷技術(shù)血凝試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)?zāi)z體金免疫技術(shù)放射免疫分析技術(shù),4,優(yōu)質(zhì)課件,凝集試驗(yàn),概念：顆粒性抗原(細(xì)菌、紅細(xì)胞等)與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應(yīng)。1.直接凝集反應(yīng)抗原與抗體直接混合作用，出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果。玻片直接凝集法：定性試驗(yàn)試管直接凝集法：半定量試驗(yàn),5,優(yōu)質(zhì)課件,試管法半定量試驗(yàn),6,優(yōu)質(zhì)課件,2.間接凝集法,先將可溶性抗原或抗體吸附在顆粒載體上(如RBC,乳膠顆粒)，再與相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)，出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果。臨床常用的有間接血凝試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)等。,待檢樣品,抗原吸附血球或乳膠顆粒,反應(yīng)凝集物,7,優(yōu)質(zhì)課件,3.間接凝集抑制試驗(yàn),先將待檢抗原與已知的抗體反應(yīng)，再加入用已知抗原吸附的載體顆粒，不出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果。,例：乳膠凝集抑制試驗(yàn)檢測HCG(妊娠診斷),步驟1：將已知抗體與待檢標(biāo)本混勻,步驟2：加入抗原吸附的乳膠顆粒混勻,抗原吸附乳膠顆粒,結(jié)果判斷：,不凝集為陽性結(jié)果,已知抗體,待檢標(biāo)本,8,優(yōu)質(zhì)課件,凝集反應(yīng),9,優(yōu)質(zhì)課件,2.沉淀反應(yīng),概念：可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物稱沉淀反應(yīng)。,類型：單向免疫擴(kuò)散,免疫比濁法,雙向免疫擴(kuò)散,對流免疫電泳,10,優(yōu)質(zhì)課件,單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),11,優(yōu)質(zhì)課件,雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),12,優(yōu)質(zhì)課件,對流免疫電泳,13,優(yōu)質(zhì)課件,測吸光度計(jì)算抗原或抗體的含量,抗體,抗原,免疫復(fù)合物的濃度與透射光的衰減呈正相關(guān),免疫比濁法原理,14,優(yōu)質(zhì)課件,3.中和反應(yīng)如抗“O”試驗(yàn),4.免疫標(biāo)記技術(shù),概念：用熒光素、酶、同位素等標(biāo)記抗體或抗原用以測定相應(yīng)抗原或抗體的技術(shù)稱為免疫標(biāo)記技術(shù)。常用方法有免疫熒光技術(shù)、酶免疫技術(shù)、放射免疫檢測技術(shù)等。特點(diǎn)：敏感、特異、快速，能定性、定量、定位。,15,優(yōu)質(zhì)課件,免疫標(biāo)記技術(shù),酶免疫標(biāo)記技術(shù)熒光免疫分析技術(shù)放射免疫分析技術(shù)免疫金標(biāo)記技術(shù),16,優(yōu)質(zhì)課件,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA),17,優(yōu)質(zhì)課件,酶及其底物酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應(yīng).,18,優(yōu)質(zhì)課件,19,優(yōu)質(zhì)課件,2、標(biāo)記方法戊二醛交聯(lián)法過碘酸鹽氧化法,20,優(yōu)質(zhì)課件,戊二醛交聯(lián)法(一步法）,抗體-NH2+COH-（CH2）3-COH+NH2-酶,抗體-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶,抗體-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-抗體,酶-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶,21,優(yōu)質(zhì)課件,戊二醛交聯(lián)法（二步法）,COH-（CH2）3-COH+NH2-酶,抗體-NH2+CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶,抗體-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶,22,優(yōu)質(zhì)課件,過碘酸鹽氧化法,NaIO4,O,O,OH,+NH2抗體,O,O,O,N,N,抗體,抗體,H2O,N,抗體,NaBH4,Schiff堿,酶-五炭糖環(huán),23,優(yōu)質(zhì)課件,標(biāo)記免疫物的分離與鑒定,1、分離目的：去除游離酶方法：鹽析、柱層析2、鑒定抗體活性酶活性標(biāo)記物純度,24,優(yōu)質(zhì)課件,ELISA的種類和變化,（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法（四）雙位點(diǎn)一步法（五）捕獲法測IgM抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA,25,優(yōu)質(zhì)課件,26,優(yōu)質(zhì)課件,（一）雙抗體夾心法,此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,27,優(yōu)質(zhì)課件,獲得待分析物的未標(biāo)定抗體,將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體,洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì),加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn),洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白,加受檢標(biāo)本（抗原）形成固相抗體抗原復(fù)合物,洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì),加酶標(biāo)抗體生成抗體待測抗原酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物,徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體,加底物進(jìn)行酶催化反應(yīng),根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測定,28,優(yōu)質(zhì)課件,間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。,（二）間接法,29,優(yōu)質(zhì)課件,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA-間接法),30,優(yōu)質(zhì)課件,包被固相載體:用已知抗原包被固相載體,加待檢標(biāo)本:使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì),加酶標(biāo)抗抗體:與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體,加底物顯色,根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測定,31,優(yōu)質(zhì)課件,（三）競爭法,此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。,32,優(yōu)質(zhì)課件,用已知特異性抗體包被固相載體,測定管加待測抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合,對照管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合,分別洗滌除去未結(jié)合的成分,加底物顯色,分別測定兩管的吸光度值，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比，計(jì)算標(biāo)本中待測抗原含量,33,優(yōu)質(zhì)課件,對照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。,34,優(yōu)質(zhì)課件,飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素，簡曲霉毒素）飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏菌）,甲胺磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析,ELISA在飼料安全檢測中的應(yīng)用,ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測,35,優(yōu)質(zhì)課件,河豚毒素,植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素,苯并芘,主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor）、西維因（Carbaryl）、多菌靈及克菌丹（Captan）等。,農(nóng)藥的檢測：,36,優(yōu)質(zhì)課件,食源性病原菌檢測試劑盒,大腸桿菌檢測沙門氏菌檢測單增李斯特菌金黃色葡萄球菌,37,優(yōu)質(zhì)課件,轉(zhuǎn)基因成份的檢測：如轉(zhuǎn)基因玉米中中的cry9e蛋白轉(zhuǎn)基因大豆中的CP4EPSPS蛋白質(zhì)肉制品的摻假檢測：以辣根過氧化物酶標(biāo)記不同動物肌肉和血清球蛋A抗血清檢查牛肉、馬肉、豬肉、羊肉和駝肉檢測14種畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和馬肉等，在摻假率為1%時即可檢出,食品其他檢測：,38,優(yōu)質(zhì)課件,熒光抗體技術(shù)的原理與方法,用熒光素標(biāo)記抗原或抗體，再與標(biāo)本中抗體或抗原反應(yīng)，然后在熒光顯微鏡下觀察，形成的IC可散發(fā)出熒光，對標(biāo)本中的抗原或抗體進(jìn)行測定和定位。常用的熒光素異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)等。常用的方法直接熒光法間接熒光法,39,優(yōu)質(zhì)課件,免疫熒光技術(shù),40,優(yōu)質(zhì)課件,免疫熒光技術(shù)直接法,41,優(yōu)質(zhì)課件,免疫熒光技術(shù)間接法,42,優(yōu)質(zhì)課件,免疫熒光技術(shù),43,優(yōu)質(zhì)課件,熒光顯微鏡,44,優(yōu)質(zhì)課件,熒光顯微鏡使用原理,激發(fā)濾片（BG）,吸收濾片（OG）,標(biāo)本,FITC吸收光峰值：490-495nmFITC發(fā)射光峰值：520-530nmBG：325-500OG：410-650,45,優(yōu)質(zhì)課件,免疫金標(biāo)記技術(shù),免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測。這一反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色（immunogoldsilverstaining，IGSS）。,46,優(yōu)質(zhì)課件,一、膠體金制備,膠體金（colloidalgold）的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子，形成金顆粒懸液，也稱金溶膠（goldsolution）。,47,優(yōu)質(zhì)課件,膠體金的制備及特性,*還原100ml0.01%HAuCl4所需量,48,優(yōu)質(zhì)課件,膠體金（ColloidalGold）1560nm,優(yōu)質(zhì),劣質(zhì),49,優(yōu)質(zhì)課件,膠體金結(jié)合物（Conjugate）,50,優(yōu)質(zhì)課件,一、免疫滲濾測定(IFA),51,優(yōu)質(zhì)課件,斑點(diǎn)滲漏法,其原理與層析法相類同，中心圓點(diǎn)為一株單抗，邊上小點(diǎn)為抗鼠二抗。先將待測樣品滴在其中，若有抗原即被結(jié)合在中心圓點(diǎn)，洗去未結(jié)合抗原，再滴加金標(biāo)另一株單抗，若有抗原則形成金-Ab-Ag薄膜的紅色斑點(diǎn)，而邊上是金-Ab-Ab2薄膜的質(zhì)控點(diǎn)，是為金標(biāo)二步法。,52,優(yōu)質(zhì)課件,IFA雙抗體夾心法測抗原,53,優(yōu)質(zhì)課件,IFA結(jié)果判斷,54,優(yōu)質(zhì)課件,二、免疫層析測定（ICA）,55,優(yōu)質(zhì)課件,層析法,將金標(biāo)的一株單抗吸附于下端的玻璃纖維紙上，浸入尿液，此金標(biāo)單抗即被溶解，并隨尿液上行，若尿中有相應(yīng)抗原，既形成Ag-Ab-金復(fù)合物，當(dāng)上行至中段醋酸纖維薄膜，即與下端的另一株單抗結(jié)合并被固定下來，顯示陽性結(jié)果。其上方還有一條抗鼠二抗，待紅色金標(biāo)單抗上行此處即被固定下來，作為金標(biāo)單抗質(zhì)控的提示。此種方法稱金標(biāo)一步法。,56,優(yōu)質(zhì)課件,兔抗鼠IgG,鼠抗HCG單抗,金標(biāo)鼠抗HCG單抗,尿液浸濕標(biāo)志線,手持端,斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（一）,57,優(yōu)質(zhì)課件,斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（二）,尿樣,陽性,弱陽性,陰性,無效,質(zhì)控線,測試線,58,優(yōu)質(zhì)課件,ICA雙抗體夾心法測抗原,59,優(yōu)質(zhì)課件,ICA-競爭法測抗原,免疫層析試驗(yàn)競爭法測小分子抗原原理圖,60,優(yōu)質(zhì)課件,ICA竟?fàn)幏ńY(jié)果觀察,陰性,陽性,無效,61,優(yōu)質(zhì)課件,ICA間接法測抗體,62,優(yōu)質(zhì)課件,ICA結(jié)果觀察,陽性,陰性,無效,63,優(yōu)質(zhì)課件,IFA與ICA的比較,64,優(yōu)質(zhì)課件,IFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA橫流（LATERALFLOW）,65,優(yōu)質(zhì)課件,1、羅立新,繆瓏,潘力,等.快速檢測產(chǎn)單核李斯特菌免疫膠體金層析法的研究J.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,16(2):154-156.2、賴衛(wèi)華,熊勇華,陳高明,等.應(yīng)用膠體金試紙條快速檢測赭曲霉毒素A的研究J.食品科學(xué),2005,26(5):204-207.,66,優(yōu)質(zhì)課件,3、諶志強(qiáng),段惠莉,王新為,等.大腸埃希菌O157:H7的膠體金免疫滲濾法檢測J.中國公共衛(wèi)生,2005,21(4):705-706.4、謝昭聰,宋志強(qiáng),呂敬章,等.應(yīng)用膠體金免疫層析法檢測水產(chǎn)品中霍亂弧菌的研究J.中國國境衛(wèi)生檢疫雜志,2005,28(3):163-165.,67,優(yōu)質(zhì)課件,5、王中民,李君文,王新為,等.免疫金滲濾試驗(yàn)檢測食品中沙門氏菌的研究J.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2001,29(4):45-47.6、劉永德,汪毅,陳禹雷,免疫金探針快速檢測禽流感病毒研究J.上海交通大學(xué)學(xué)報:農(nóng)業(yè)科學(xué)版,2005,23(3):321-324.,68,優(yōu)質(zhì)課件,斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn),A,D,C,B,陰性（未懷孕）,陽性（懷孕）,加尿樣,除去濾器,加膠體金標(biāo)記抗體,加洗滌液,結(jié)果判定,69,優(yōu)質(zhì)課件,免疫印跡法圖解,SDS裂解病毒,聚丙酰胺凝膠電泳,-,+,95684512KD,電轉(zhuǎn)印至NC膜上,置待測血清中，漂洗；加酶標(biāo)抗抗體，漂洗；,加底物顯色,1204124KD,70,優(yōu)質(zhì)課件,第四節(jié)放射性核素標(biāo)記技術(shù),一、常用標(biāo)記方法二、標(biāo)記免疫物的分離與純化,71,優(yōu)質(zhì)課件,R：放射性核素示蹤高靈敏不直接探測待測物，而探測待測物上的標(biāo)記信號(標(biāo)記物的放大效應(yīng))I：免疫學(xué)反應(yīng)高特異廢除以往沿用的無機(jī)或有機(jī)試劑，代之以抗體為結(jié)合劑,72,優(yōu)質(zhì)課件,常用標(biāo)記方法,1、常用放射性核素2、125I的標(biāo)記方法直接法（氯胺T法）間接法（連接法）,73,優(yōu)質(zhì)課件,直接法（氯胺T法）,Na125I4。C,125I,氯胺T,74,優(yōu)質(zhì)課件,間接法（連接法）,+Na125I,氯胺T,125I,NSHPP,75,優(yōu)質(zhì)課件,間接法（連接法）,CH2,OH,H-C-C-N-蛋白質(zhì),HOH,+NH2-蛋白質(zhì),125I,125I,76,優(yōu)質(zhì)課件,標(biāo)記免疫物的分離與鑒定,1、分離目的：去除游離放射性核素方法：柱層析2、鑒定游離放射性核素含量免疫活性比放射性（mCi/mg）,77,優(yōu)質(zhì)課件,結(jié)合相,游離相,放射免疫分析法的原理與方法,78,優(yōu)質(zhì)課件,液閃儀,79,優(yōu)質(zhì)課件,計(jì)數(shù)器,80,優(yōu)質(zhì)課件,化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫技術(shù),直接化學(xué)發(fā)光酶促化學(xué)發(fā)光特點(diǎn)電化學(xué)發(fā)光特點(diǎn),81,優(yōu)質(zhì)課件,標(biāo)記免疫分析三方式與四環(huán)節(jié),三個方式A、直接法B、間接法C、夾心法四環(huán)節(jié)為：1、抗體生產(chǎn)2、標(biāo)記