蛋白檢測ELISA 教育學習

蛋白質檢測-ELISA,1,優(yōu)質課件,1.ELISA的原理2.ELISA的類型3.試劑準備：免疫吸附劑結合物酶底物的準備4.對照設定5.標本的采取和保存6.結果判斷,酶聯免疫吸附ELISA（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISAIA）?；A:抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記，加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，由此進行定性或定量分析。,1.ELISA的原理,酶聯免疫吸附劑測定基本原理是：使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。,1.1抗原抗體反應,1.1.1可逆性,抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應式為：Ag+AbAgAb,抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數K表示：K=AgAbAgAb,AgAb的解離程度與K值有關。高親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合，兩者結合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結構和活性。,1.1.2特異性,抗原抗體的結合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結合位點之間?；瘜W結構和空間構型互補關系，具有高度的特異性。測定某一特定的物質，而不需先分離待檢物。,1.1.3最適比例,1.1.4敏感性,化學比色法的敏感度為mg/ml水平酶反應測定法的敏感度約為5-10g/ml免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿標記的免疫敏感度可提高數千倍，達ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可達0.1ng/ml。,1.4免疫測定在病蟲害檢測中的應用由于各種抗原成份（如病毒的外殼蛋白、細菌的細胞壁蛋白組分和鞭毛等），包括小分子的半抗原（包括植物激素、化學農藥等），均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標本中相應的抗原，因此免疫測定的應用范圍極廣。,2ELISA的類型,ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即免疫吸附劑（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為結合物（conjugate）；（3）酶反應的底物?？稍O計出各種不同類型的檢測方法。,2.2.1雙抗體夾心法測抗原,此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原，只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。,操作步驟如下：（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。（2）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。（3）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。（4）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。,2.2.2間接法測抗體,傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。,操作步驟1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。,2.2.3競爭法測抗體或抗原,當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。,2.2.3競爭法測抗原,小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。,3.ELISA的試劑(A、B、C三部分),ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對照品和陽性對照品，參考標準品；（5）結合物及標本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應終止液,ELISA的試劑準備A,固相載體聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。,3.1.2包被的方式,將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。,不易吸附的非蛋白質抗原可用間接包被的抗原經固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。脂類物質無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質自然干固在固相表面。優(yōu)點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳。抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。,包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯物與固相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面。,3.1.4包被用抗體,IgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯結發(fā)生在Fc段上，抗體結合點暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液.須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性。,3.1.5包被的條件,pH9.6碳酸鹽緩沖液pH7.2的磷酸鹽緩沖液pH7-8的Tris-HCL緩沖液。加入包被液后，在4-8冰箱中放置過夜，37中保溫2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。,3.1.6封閉,封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉，可以高濃度使用（5%）。,3.4洗滌液在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。,ELISA的試劑準備B,3.2結合物,即酶標記的抗體（或抗原）是ELISA中關鍵的試劑1酶的催化活性2抗體（或抗原）的免疫活性3不含或少含有游離的抗體（或抗原）4結合物尚要有良好的穩(wěn)定性。,3.2.1結合物用的抗原和抗體,制備結合物時所用純度較高的IgG，以免在與酶聯結時其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗結果本底淺淡。在ELISA中用酶標抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。,3.2.2酶,純度高，催化反應的轉化率高，專一性強，性質穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標本中不存在相同的酶。酶結合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產物易于測定等。在ELISA中，HRP（辣根過氧化物酶），AP（堿性磷酸酶），葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。,3.2.3結合物的制備,酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯法和過碘酸鹽氧化法。,（1）戊二醛交聯法：戊二醛是一種雙功能團試劑，可使酶與蛋白質的氨基通過它而聯結。有效（結合率達60%-70%）和重復性好。交聯反應是隨機的，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯，影響效果。（2）過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基形成chiff氏堿而結合。簡便有效.,3.2.4結合物的保存,酶和抗體均為生物活性物質，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉）。,試劑準備C酶的底物,3.3酶的底物,3.3.1HRP的底物,OPD氧化后的產物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物最常用的底物。,E,TMB經HRP作用后共產物顯藍色。TMB性質較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液。酶反應終止后，TMB產物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。,AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯作為底物。產物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。,3.5酶反應終止液常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。,4對照設定,陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結果的對照。陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質。加入的量應與試劑的敏感度相稱；在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可以估計標本物質的量。,參考標準品,定量測定應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中.,顯色,顯色是酶催化無色的底物生成有色產物的溫育反應。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。,比色,拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀中。以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。結果以光密度（oplicaldensity，OD），現按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為A492nm或OD492nm。,酶標比色儀,酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指測讀ELISA光度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數一般可精確到0.001，準確性為1%，重復性達0.5%。操作時室溫宜在15-30，使用前先預熱儀器15-30分鐘，測讀結果更穩(wěn)定。測讀A值時，要選用產物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀。各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書。,5結果判斷,5.1定性測定,定性測定的結果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。根據滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。在間