酶工程 第五章 酶改性的基本理論酶的結(jié)構(gòu)及其與催化特性的關(guān)系

.,1,酶工程EnzymeEngineering,林范學fanxuelin,.,2,第二篇酶的改性,酶的改性（enzymeimproving）：通過各種方法使酶的催化特性得以改進的技術(shù)過程酶的改性的目的提高酶的催化效率增加酶的穩(wěn)定性降低或消除酶的抗原性提高酶的使用效率（反復(fù)或連續(xù)使用酶）擴大酶的使用范圍（研究酶在水溶液以外的條件下進行催化反應(yīng)的特性和條件）酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究,.,3,常用的方法:酶分子修飾（enzymemoleculemodification）酶分子定向進化（enzymemoleculedirectedevolution）酶固定化（enzymeimmobilization）酶非水相催化（enzymecatalysisinnon-aqueousphase）,.,4,第五章酶改性的基本理論酶的結(jié)構(gòu)及其與催化特性的關(guān)系,第一節(jié)酶的化學組成第二節(jié)酶的化學結(jié)構(gòu)第三節(jié)酶的空間結(jié)構(gòu)第四節(jié)酶的活性中心第五節(jié)酶的結(jié)構(gòu)與催化特性的關(guān)系,.,5,第一節(jié)酶的化學組成,.,6,一、蛋白類酶的基本組成單位氨基酸,氨基酸結(jié)構(gòu)肽鍵,.,7,.,8,.,9,二、核酸類酶的基本組成單位核苷酸,堿基+核糖+磷酸=核苷酸3,5-磷酸二酯鍵,.,10,5AMP,5GMP,5UMP,5CMP,.,11,三、酶的輔因子,單成分酶：僅有蛋白質(zhì)或核糖核酸組成的酶雙成分酶：除了蛋白質(zhì)或核糖核酸外，還有其他非生物大分子成分的酶。,全酶holoenzyme,無催化活性,有催化活性,決定專一性,傳遞電子、原子或某些化學基團,.,12,1.無機輔因子,金屬離子的作用：參與催化反應(yīng)、穩(wěn)定酶的構(gòu)象。,.,13,無機輔助因子主要是指各種金屬離子，尤其是各種二價金屬離子。,（1）鎂離子鎂離子是多種酶的輔助因子，在酶的催化中起重要作用。例如，各種激酶、檸檬酸裂合酶、異檸檬酸脫氫酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、各種自我剪接的核酸類酶等都需要鎂離子作為輔助因子。,1.無機輔因子,.,14,（2）鋅離子鋅離子是各種金屬蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶等的輔助因子，也是銅鋅-超氧化物歧化酶（Cu，Zn-SOD）、碳酸酐酶、羧肽酶、醇脫氫酶、膠原酶等的輔助因子。,（3）鐵離子鐵離子與卟啉環(huán)結(jié)合成鐵卟啉，是過氧化物酶、過氧化氫酶、色氨酸雙加氧酶、細胞色素B等的輔助因子。鐵離子也是鐵-超氧化物歧化酶（Fe-SOD）、固氮酶、黃嘌呤氧化酶、琥珀酸脫氫酶、脯氨酸羧化酶的輔助因子。,.,15,（4）銅離子銅離子是銅鋅-超氧化物歧化酶、抗壞血酸氧化酶、細胞色素氧化酶、賴氨酸氧化酶、酪氨酸酶等的輔助因子。,（5）錳離子錳離子是錳-超氧化物歧化酶（MnSOD）、丙酮酸羧化酶、精氨酸酶等的輔助因子。,（6）鈣離子鈣離子是-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的輔助因子。,.,16,2.有機輔因子,是指雙成分酶中相對分子量較小的有機化合物。它們在酶催化過程中起著傳遞電子、原子或基團的作用。(1)傳遞電子體：如卟啉鐵、鐵硫簇；(2)傳遞氫（遞氫體）：如FMN/FAD、NAD+/NADP+、CoQ、硫辛酸；(3)傳遞?；w：如CoA、TPP、硫辛酸；(4)傳遞一碳基團：如四氫葉酸；(5)傳遞磷酸基：如ATP，GTP；(6)其它作用：轉(zhuǎn)氨基，如磷酸吡哆醛（VB6）；傳遞CO2，如生物素。,.,17,(1)煙酰胺核苷酸(NAD+，NADP+)B族維生素許多脫氫酶的輔因子：乳酸脫氫酶、醇脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶NAD+：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，輔酶I一般與呼吸鏈相連，與分解反應(yīng)偶聯(lián)：（醇脫氫酶催化伯醇脫氫生成醛）RCH2CH2OH+NAD+=RCH2CHO+NADH+H+NADP+：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，輔酶。一般與合成反應(yīng)相偶聯(lián)。,.,18,(2)黃素核苷酸(FMN和FAD)維生素B2(核黃素)的衍生物各種黃素酶(氨基酸氧化酶、琥珀酸脫氫酶等)的輔助因子FMN：黃素單核苷酸FAD：黃素腺嘌呤二核苷酸FMN和FAD的主要作用是傳遞氫。,.,19,(3)鐵卟啉鐵卟啉是一些氧化酶（如過氧化氫酶、過氧化物酶等）的輔助因子。它通過共價鍵與酶蛋白牢固結(jié)合。(4)硫辛酸硫辛酸全稱為6,8-二硫辛酸。它在氧化還原酶的催化作用中，通過氧化型和還原型的互相轉(zhuǎn)變而起傳遞氫的作用。(5)核苷三磷酸(NTP)腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、鳥苷三磷酸(CTP)、胞苷三磷酸(CTP)、尿苷三磷酸(UTP)等。它們是磷酸轉(zhuǎn)移酶的輔助因子。,.,20,(6)鳥苷鳥苷是含型IVS的自我剪接酶(R-酶)的輔助因子。(7)輔酶Q輔酶Q是一系列苯醌衍生物一些氧化還原酶的輔助因子。(8)谷胱甘肽(GSH)L-GluL-IleL-Gly三肽,.,21,(9)輔酶A（CoA）輔酶A是各種?；傅妮o酶，由一分子腺苷二磷酸、一分子泛酸和一分子巰基乙胺組成。(10)生物素生物素是維生素B的一種，又稱維生素H生物素是羧化酶的輔助因子，在酶催化反應(yīng)中，起CO2的滲入作用。,.,22,(11)硫胺素焦磷酸(TPP)即維生素B1，是酮酸脫羧酶的輔助因子。(12)磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺即維生素B6，是各種轉(zhuǎn)氨酶的輔助因子。在酶催化氨基酸和酮酸的轉(zhuǎn)氨過程中，維生素B6通過磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺的互相轉(zhuǎn)變，起到氨基轉(zhuǎn)移作用,.,23,第二節(jié)酶的化學結(jié)構(gòu),一、酶蛋白的化學結(jié)構(gòu)即一級結(jié)構(gòu)，是指蛋白質(zhì)中的氨基酸按照特定的排列順序通過肽鍵連接起來的多肽鏈結(jié)構(gòu)。氨基酸的種類和數(shù)目氨基酸的排列次序二硫鍵的數(shù)目和位置肽鏈的數(shù)目等。每種蛋白質(zhì)都由唯一而確定的遺傳信息決定氨基酸序列一級結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu),.,24,氨基酸：20種,AA的結(jié)構(gòu)特點-AA；除Gly外都具有光學性(有D-和L-型兩種光學異構(gòu)體)。,結(jié)構(gòu)通式:,.,25,-氨基酸,賴氨酸,.,26,L-型和D-型,丙氨酸,levorotatorydextrotatory,.,27,肽：一個氨基酸的-羧基和另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而成的化合物。肽鍵（peptidebond）：一個氨基酸的-COOH和相鄰的另一個氨基酸-NH2脫水所形成的共價鍵。,.,28,.,29,肽單位：,CN，半雙鍵性（partialdouble-bondcharacter），不能旋轉(zhuǎn)CC、NC，真正單鍵（puresinglebond），可以旋轉(zhuǎn),.,30,二硫鍵：2個Cys的巰基脫氫聯(lián)結(jié)而成,肽鏈內(nèi)二硫鍵,肽鏈間二硫鍵,.,31,牛胰核糖核酸酶一級結(jié)構(gòu),.,32,胰凝乳蛋白酶chymotrypsin,.,33,.,34,酶蛋白化學結(jié)構(gòu)的測定,（1）酶蛋白的分離純化（純度97）沉淀、離心、電泳、層析等等（2）氨基酸種類和數(shù)目的確定蛋白質(zhì)水解后用層析技術(shù)等分離鑒定。氨基酸自動分析儀,.,35,（3）肽鏈數(shù)目的確定通過末端分析等方法測定肽鏈的數(shù)目通過還原法打開二硫鍵在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，防止重新被氧化。（4）氨基酸順序測定酶蛋白不完全水解各種小肽末端分析綜合分析,.,36,末端分析,二硝基氟苯（FDNB）法（N-末端分析）,.,37,肼解法（C-末端分析）,.,38,二、酶RNA的化學結(jié)構(gòu),酶RNA的化學結(jié)構(gòu)主要包括組成RNA的核苷酸種類、數(shù)目和排列順序。4種核苷酸：AMP，GMP，CMP，UMP3-5磷酸二酯鍵連接,.,39,酶RNA化學結(jié)構(gòu)的測定核酸自動測序儀,.,40,高通量測序（High-throughputsequencing）又稱“下一代”測序技術(shù)（“Next-generation”sequencingtechnology），以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。大規(guī)模平行簽名測序（MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS)聚合酶克?。≒olonySequencing）454焦磷酸測序（454pyrosequencing）Illumina(Solexa)sequencingABISOLiDsequencing離子半導體測序（Ionsemiconductorsequencing）DNA納米球測序（DNAnanoballsequencing）等。,.,41,.,42,傳統(tǒng)方法:(1)酶RNA的分離純化，得到較純的RNA樣品(2)將RNA水解成各種核苷酸，確定核苷酸的種類和數(shù)量(3)用特異性酶切法或雙脫氧終止法進行RNA序列測定,.,43,第三節(jié)酶的空間結(jié)構(gòu),酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)：二、三、四級結(jié)構(gòu)酶RNA的空間結(jié)構(gòu)：二、三級結(jié)構(gòu),.,44,一、酶蛋白的空間結(jié)構(gòu),包括二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)單位：螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角、卷曲等結(jié)構(gòu),.,45,1、酶蛋白的副鍵,（1）氫鍵:肽鍵中羰基的氧原子等與亞氨基、羥基、氨基等基團中氫原子聯(lián)結(jié)成的副價鍵（2）鹽鍵：蛋白質(zhì)分子中氨基與羧基形成，結(jié)合力較強,.,46,（3）酯鍵：蛋白質(zhì)分子中羧基與氨基酸上的羥基脫水而縮合而成（4）二硫鍵：由蛋白質(zhì)分子上兩個半胱氨酸殘基上巰基通過氧化脫氫而成，對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性起重要作用,R1SSR2,.,47,（5）疏水鍵：蛋白質(zhì)分子中疏水性較強的側(cè)鏈基團聚集而成，對穩(wěn)定蛋白有一定作用；,.,48,（6）范德華力：借助靜電引力而形成，鍵能較?。?）金屬鍵：通過金屬離子與蛋白質(zhì)中基團聯(lián)結(jié)而成，維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)型有一定作用，在四級結(jié)構(gòu)中聯(lián)結(jié)亞基。,CopperchaperoneproteinPcoC,銅伴侶蛋白,.,49,2、酶蛋白的二級結(jié)構(gòu),主要指多肽鍵主鏈原子的局部空間排列，一般不考慮側(cè)鏈的構(gòu)象。包括：-螺旋結(jié)構(gòu)-片層結(jié)構(gòu)-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)無規(guī)卷曲,.,50,（1）-螺旋結(jié)構(gòu),-螺旋結(jié)構(gòu)是由蛋白質(zhì)的肽鏈環(huán)繞中心軸有規(guī)則一圈一圈盤旋而成。右手螺旋（-helix）,螺距為0.54nm,含3.6個AA殘基兩個AA之間的距離為0.15nm；AA殘基側(cè)鏈伸向外側(cè)，相鄰的螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵；主要靠氫鍵維持,.,51,-螺旋有左旋和右旋兩種，右旋比左旋更加穩(wěn)定，因此也更常見。,.,52,（2）-片層結(jié)構(gòu)(pleatedsheet),又稱-折疊，是兩條或多條肽鏈充分伸展成鋸齒狀的折疊結(jié)構(gòu)，通過側(cè)向聚集，形成與肽鏈長軸方向平行的折扇狀構(gòu)象。,肽鏈幾乎完全伸展，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)維持結(jié)構(gòu)；肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象，R基團處于折疊平面的兩側(cè)。,.,53,平行式,反平行式,.,54,（3）-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（turn）,又稱轉(zhuǎn)彎或發(fā)卡結(jié)構(gòu)，是在球蛋白中發(fā)現(xiàn)。,球狀蛋白的多肽鏈經(jīng)常出現(xiàn)180的回折，這個回折角就是轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)；它由四個AA殘基組成;回折處的第一個AA殘基的-C=O和第四個AA殘基的N-H之間形成氫鍵，形成一個不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)。-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)中常出現(xiàn)的AA有Gly、Pro、Asp、Asn、Trp等,.,55,.,56,（4）無規(guī)卷曲（nonregularcoil）,又稱自由回轉(zhuǎn)（randomcoil)，是肽鏈的主鏈不規(guī)則、多向性地隨機盤曲所形成構(gòu)象。,.,57,在同一種蛋白質(zhì)中，無規(guī)卷曲出現(xiàn)的部位和結(jié)構(gòu)完全相同（有規(guī)律）不同蛋白質(zhì)中或同一蛋白中不同肽段中，無規(guī)卷曲形式多樣（無規(guī)律）通常酶的活性中心常處在這一構(gòu)象區(qū)域里。,.,58,3、超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域,超二級結(jié)構(gòu)(supersecondarystructure，Motif)：是指若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象單元彼此相互作用，形成有規(guī)則的，在空間上能辨認的二級結(jié)構(gòu)組合體。，。,.,59,超二級結(jié)構(gòu),-花式,-loop-花式,-loop-花式,.,60,結(jié)構(gòu)域（domain）：是在超二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進一步卷曲折疊成緊密的近似球狀的結(jié)構(gòu)，在空間上彼此分隔，各自具有部分生物功能的結(jié)構(gòu)。,.,61,由4個組成的/桶結(jié)構(gòu)域,/桶結(jié)構(gòu)域：丙酮酸激酶,小的蛋白質(zhì)分子只有一個結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu)大的蛋白質(zhì)分子有數(shù)個結(jié)構(gòu)域,.,62,丙酮酸激酶,己糖激酶,前清蛋白,肌紅蛋白,免疫球蛋白,.,63,4、三級結(jié)構(gòu)（TertiaryStructure）,在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，肽鏈不同區(qū)段的側(cè)鏈基團相互作用，進一步盤繞、折疊形成的的空間結(jié)構(gòu)。不考慮亞基和分子間的互相關(guān)系作用力主要有：氫鍵、疏水鍵、離子鍵、范德華力和二硫鍵等。,.,64,多肽鏈,疏水鍵,氫鍵,二硫鍵,離子鍵,CH2OH,CH2OH,范德華力,維持三級結(jié)構(gòu)的作用力,.,65,蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的特征,（1）三級結(jié)構(gòu)是具有二級結(jié)構(gòu)的肽鏈盤繞折疊形成的三維球狀結(jié)構(gòu)。（2）分子中的非極性基團集中在分子內(nèi)部，形成酶分子的骨架，稱為疏水核；而極性基團相對集中于酶分子表面，形成親水區(qū)。（3）酶分子表面往往有一個內(nèi)陷的凹槽，又稱為裂隙，酶分子的活性中心就在其中。由一個具有三級結(jié)構(gòu)的酶蛋白組成的酶分子稱為單體酶（monomericenzyme）。一般由一條肽鏈組成，也可由多條肽鏈組成。,.,66,.,67,人類他克莫司結(jié)合蛋白三級結(jié)構(gòu),CrystalstructureofHomo.sapiensFKBP12tertiarystructure,人類他克莫司結(jié)合蛋白三級結(jié)構(gòu),.,68,胰凝乳蛋白酶,241個AA3條肽鏈,.,69,5、四級結(jié)構(gòu)（QuaternaryStructure）,由兩條或兩條以上具有三級結(jié)構(gòu)的肽鏈聚合而成的特定構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子叫蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)；其中具有獨立三級結(jié)構(gòu)的一條肽鏈叫亞基（subunit)，無生物功能；由幾個亞基聚集而成的蛋白質(zhì)常常稱為寡聚蛋白。四級結(jié)構(gòu)指寡聚蛋白中亞基的種類、數(shù)目、各亞基的空間排布及其相互作用等。,.,70,寡聚蛋白中亞基數(shù)目相差很大過氧化氫酶4個亞基大腸桿菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶12個亞基四級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性主要靠亞基之間的疏水鍵維持,.,71,由2種亞基（、）各2個締合而成，亞基呈球形亞基兩兩相同，分別為1、2、1、2每個亞基都含有一個血紅素輔基,血紅蛋白hemoglobin,.,72,氨基酸序列大不相同，但結(jié)構(gòu)（三級）相似，功能也相似（載氧）結(jié)構(gòu)決定功能。,.,73,.,74,.,75,二、酶RNA的空間結(jié)構(gòu),1、酶RNA的二級結(jié)構(gòu)指單鏈酶RNA分子的自身回折、鏈內(nèi)互補堿基配對形成的局部雙螺旋區(qū)及非配對順序形成的突環(huán)之間的空間排布。雙螺旋由RNA中互補堿基配對而成，至少含46個對堿基，占堿基數(shù)量的40%-70%。互補堿基對通常是G-C，A-U，G-U,.,76,突環(huán)：由不互補配對的堿基組成發(fā)夾環(huán)（hairpinloop）膨脹環(huán)（expansionloop）內(nèi)環(huán)（internalloop）多分枝環(huán)（multibranchingloop）,hairpinloop,expansionloop,internalloop,multibranchingloop,.,77,H：hairpinloopI：internalloopB：bulgeloop(expansionloop)M:multibranchingloop,.,78,(1)錘頭結(jié)構(gòu)（hammerheadstructure）,11個保守堿基3個雙螺旋區(qū),Cleavagesite,.,79,(2)發(fā)卡結(jié)構(gòu)（hairpinstructure）,50個左右核苷酸4個雙螺旋5個突環(huán)兩個結(jié)構(gòu)域（螺旋-突環(huán)-螺旋）,.,80,(3)多分枝環(huán)結(jié)構(gòu)(multibranchingloop),ThesequenceandsecondarystructureoftheVS(Varkudsatellite)ribozyme.,底物,剪切位點,A730loop,animportantcomponentoftheactivesiteoftheribozyme.,活性中心,.,81,.,82,2、酶RNA的三級結(jié)構(gòu),酶RNA的三級結(jié)構(gòu)是在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進一步盤繞折疊而成的三維結(jié)構(gòu)。分成多個結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域又由多個螺旋和突環(huán)盤繞折疊而成。,.,83,StructureoftheTetrahymenaRibozyme.(A)Thesecondarystructureofthecrystallizedribozyme.(B)RIBBONSdiagramofthecrystalstructureoftheribozymeBmolecule,.,84,TetrahymenaGroupIintronsecondaryandtertiarystructures,.,85,第四節(jié)酶的活性中心,酶分子具有催化活性的特殊部位稱為酶的活性部位（activesite)或活性中心（activecenter）。,.,86,一、酶活性中心上的氨基酸殘基,酶的分子中存在著許多功能基團，例如，-NH2、-COOH、-SH、-OH等，但并不是這些基團都與酶活性有關(guān)。構(gòu)成酶活性中心的只有少數(shù)幾個氨基酸殘基。,.,87,.,88,.,89,胰凝乳蛋白酶chymotrypsin,.,90,Asp102,His57,Ser195,Asp194,Gly193,Ile16,+NH3,CatalyticTriad,TheNH+3ofIle-16andtheCOO-ofAsp-194formanionpairwhenchymotrypsinogenisactivated.,.,91,2酶分子中的氨基酸殘基,(1)接觸殘基(contactresidues):這類殘基直接與底物接觸，參與底物的化學轉(zhuǎn)變。這類殘基的側(cè)鏈中起與底物結(jié)合作用的基團稱為結(jié)合基團；起催化作用的基團稱為催化基團。有時結(jié)合基團也參與催化作用，很難絕對區(qū)分。(2)輔助殘基(auxiliaryresidues)：這類殘基不與底物直接接觸，而是在使酶與底物結(jié)合及協(xié)助接觸殘基發(fā)揮作用方面起一定作用。接觸殘基和輔助殘基構(gòu)成酶的活性中心。(3)結(jié)構(gòu)殘基(structureresidues)：這類殘基在維持酶分子的完整空間結(jié)構(gòu)并使之形成特定的空間構(gòu)象方面起重要作用。與酶活性密切相關(guān)，但不在酶活性中心范圍之內(nèi)，屬于酶活性中心外的必需范圍。接觸殘基、輔助殘基和結(jié)構(gòu)殘基三類殘基統(tǒng)稱為酶的必需基團，若被其它氨基酸殘基取代，則往往造成酶失活。(4)非貢獻殘基(non-contributingresidues):除了上述三類酶的必需基團外，酶分子上其余的氨基酸殘基都可稱為非貢獻殘基或非必需基團。,.,92,酶分子中的氨基酸殘基（1960年，Koshland）,（1）接觸殘基（contactingresidues）直接與底物相接觸，并參與底物的化學轉(zhuǎn)變。與底物結(jié)合的基團稱為結(jié)合基團；起催化作用的基團稱為催化基團。（2）輔助殘基（auxiliaryresidues）不直接參與催化作用，在酶與底物結(jié)合的過程中起作用。接觸殘基和輔助殘基構(gòu)成酶的活性中心。（3）結(jié)構(gòu)殘基（structureresidues）又稱為貢獻殘基（contributingresidues），維持酶蛋白分子的完整極其規(guī)則的空間構(gòu)象（4）非貢獻殘基（non-contributingresidues），對酶的結(jié)構(gòu)和功能無明顯作用,.,93,底物,活性中心以外的必需基團,結(jié)合基團,催化基團,活性中心,.,94,.,95,R酶活性中心,酶RNA的某一段核苷酸序列。L-19IVS活性中心由第2227位的六個核苷酸序列：5GGAGGG3只要將其中的堿基置換一個，就可以使其底物專一性發(fā)生改變,.,96,I類內(nèi)含子的酶學特性四膜蟲L-19IVS的體外催化活性,Interveningsequencelacking19nucleotide缺少19個核苷酸的居間序列1986年女科學家Grabowski,P.J.發(fā)現(xiàn)L-19可以催化5聚胞苷（5XpC）聚合為多聚胞苷。,.,97,L-19IVS催化RNA寡核苷酸鏈延長,.,98,.,99,二、接觸殘基附近肽鏈的一級結(jié)構(gòu),有些酶的催化機制非常相似，在分類中列為一小類。相同的接觸殘基催化基團在接觸殘基附近的肽鏈一級結(jié)構(gòu)也幾乎完全相同酶活性中心在種系進化上存在嚴格的保守性,.,100,一些絲氨酸蛋白酶活性中心絲氨酸附近的肽鏈組成,.,101,一些半胱氨酸蛋白酶活性中心的半胱氨酸殘基附近的氨基酸順序,.,102,第五節(jié)酶的結(jié)構(gòu)與催化特性的關(guān)系,一、酶的一級結(jié)構(gòu)與催化特性的關(guān)系酶的一級結(jié)構(gòu)是酶的基本化學結(jié)構(gòu)，決定了酶的空間結(jié)構(gòu)、生物學活性酶的一級結(jié)構(gòu)的改變包括酶分子主鏈的斷裂和連接，酶分子組成氨基酸的改變，都可能對酶的催化特性產(chǎn)生影響,.,103,1、主鏈斷裂的位置遠離活性中心，切去部分非貢獻殘基，一級結(jié)構(gòu)的變化對酶活性幾乎沒有影響牛核糖核酸酶RNase（124aa）C末端3aaM1RNA（377nt）3end122nt,.,104,2、主鏈斷裂的位置靠近活性中心，切去部分接觸殘基、輔助殘基，引起酶活性喪失牛核糖核酸酶RNase（124aa）C末端4aaM1RNA（377nt）5end70nt,.,105,3、對酶的前體或酶原，酶主鏈特定位置斷裂，顯示出酶的催化活性(1)胰蛋白酶原（無活性）胰蛋白酶（有活性）,.,106,(2)胰凝乳蛋白酶原,.,107,2.胰凝乳蛋白酶原的激活p.50,245aa5對二硫鍵斷裂：Arg15與Ile16、Leu13與Ser14、Tyr146與Thr147、Asn148與Ala149切除2個二肽：Ser14-Arg15、Thr147-Asp148,.,108,(2)胰凝乳蛋白酶原活化,245aa5對二硫鍵斷裂：Arg15與Ile16、Leu13與Ser14、Tyr146與Thr147、Asn148與Ala149切除2個二肽：Ser14-Arg15、Thr147-Asp148,113164258122136146149168182191201221245,11315,164258122136146149168182191201221245,113,164258122136146,149168182191201221245,Trypsin,-Chymotrypsin(active),-Chymotrypsinrypsin,Twodipeptides,Achain,Bchain,Cchain,-Chymotrypsinrypsin,Chymotrypsinogen(inactive),His57,Asp102,Ser195,.,109,5,5,5,3,3,3,Upstreamexon,Downstreamexon,Intron,G,OH,G,OH,+,G,414,399,394,5,3,5,3,L19RNA,Splicedexons,四膜蟲RNA的自我剪接,(3)L-19IVS形成,多功能酶：水解RNA、轉(zhuǎn)核苷酸作用、轉(zhuǎn)磷酸基作用,.,110,二、酶的二、三級結(jié)構(gòu)與催化功能的關(guān)系,完整的二、三級結(jié)構(gòu)對維持酶的活性中心的空間構(gòu)象至關(guān)重要。酶的二、三級結(jié)構(gòu)破壞將使酶的催化活性喪失。,例如:牛胰核糖核酸酶RNaseA124aa,活性中心：His12和His119切開N端120aa(S)肽C端104aa(S)蛋白無活性混合1：1，恢復(fù)活性,.,111,.,112,核糖核酸酶變性與復(fù)性作用,Nativeribonuclease,Denativereducedribonuclease,Nativeribonuclease,變性,復(fù)性,.,113,三、酶的四級結(jié)構(gòu)與催化功能的關(guān)系1有些四級結(jié)構(gòu)酶僅僅具有催化作用（沒有調(diào)節(jié)部位）多催化部位寡聚酶多酶復(fù)合體2別構(gòu)酶：具有催化和調(diào)節(jié)兩種作用。別構(gòu)酶四級結(jié)構(gòu)受到破壞時，有些催化亞基仍然可以保持酶的催化活性，但失去其調(diào)節(jié)功能，因為分開的調(diào)節(jié)亞基不再具有調(diào)節(jié)功能，只有四級結(jié)構(gòu)完整時，調(diào)節(jié)亞基才能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。,.,114,三、酶的四級結(jié)構(gòu)與催化功能的關(guān)系,酶的四級結(jié)構(gòu)是由多個亞基聯(lián)結(jié)而成的催化作用調(diào)節(jié)作用四級結(jié)構(gòu)破壞，功能和特性發(fā)生變化,.,115