第五章-核酸PPT課件

.,1,第14章核酸的物理化學(xué)性質(zhì),核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作為高聚物決定其物理化學(xué)性質(zhì)：1、水解作用：糖苷鍵，磷酸二酯鍵2、酸堿性質(zhì)：磷酸基，堿基3、紫外吸收：堿基4、變性和復(fù)性：雙螺旋結(jié)構(gòu),.,2,一、核酸的水解,1、酸和堿水解（1）酸水解：糖苷鍵和磷酸酯鍵都可被酸水解。（2）堿水解：DNA和RNA對(duì)酸或堿的耐受程度有很大差別。RNA較DNA易水解。這種水解性能上的差別，與RNA核糖基上2-OH的鄰基參與作用有很大的關(guān)系。在RNA水解時(shí)，2-OH首先進(jìn)攻磷酸基，在斷開(kāi)磷酯鍵的同時(shí)形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的作用形成水解產(chǎn)物。,.,3,2、酶水解,（一）生物體內(nèi)存在多種核酸水解酶。這些酶可以催化水解多聚核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵。分類：（1）以DNA為底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA為底物的RNA水解酶（RNases）。（2）根據(jù)作用方式又分作兩類：核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（3-端或5-端）開(kāi)始，逐個(gè)水解切除核苷酸；核酸內(nèi)切酶的作用方式剛好和外切酶相反，它從多聚核苷酸鏈中間開(kāi)始，在某個(gè)位點(diǎn)切斷磷酸二酯鍵。,.,4,2、酶水解,（二）核糖核酸酶（內(nèi)切酶）（1）牛胰核糖核酸酶（RNaseI)：產(chǎn)物：3-P-核苷酸為末端（2）核糖核酸酶T1：產(chǎn)物：3-P-核苷酸為末端（3）核糖核酸酶T2：產(chǎn)物：3-P-腺苷酸為末端（三）脫氧核糖核酸酶（1）牛胰脫氧核糖核酸酶（DNaseI）：產(chǎn)物：5-P-脫氧核苷酸為末端（2）牛脾脫氧核糖核酸酶（DNase）：產(chǎn)物：3-P-脫氧核苷酸為末端（3）限制性內(nèi)切酶：已發(fā)現(xiàn)幾千種，在分子生物學(xué)有高應(yīng)用價(jià)值,.,5,二、核酸的酸堿性質(zhì),1、堿基的解離：雜環(huán)中的氮及各取代基具有結(jié)合和釋放質(zhì)子的能力。2、核苷的解離：糖的存在增強(qiáng)了堿基酸性解離；核糖中羥基解離的pK值通常在12以上，不予考慮。3、核苷酸解離：磷酸基具較強(qiáng)酸性堿性：來(lái)自于堿基，較弱酸性：來(lái)自于堿基和磷酸,.,6,與蛋白質(zhì)相似，核酸分子中既含有酸性基團(tuán)（磷酸基）也含有堿性基團(tuán)（氨基），因而核酸也具有兩性性質(zhì)。,核酸的兩性性質(zhì)及等電點(diǎn),.,7,三、核酸的紫外吸收,由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨(dú)特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組份定性和定量測(cè)定的依據(jù)。A260/A280,*怎樣判斷核酸樣品的純度？,.,8,四、核酸的變性、復(fù)性及雜交,（一）變性核酸的變性是指核酸雙螺旋區(qū)的多聚核苷酸鏈間的氫鍵斷裂，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過(guò)程。變性核酸將失去其部分或全部的生物活性。核酸的變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級(jí)結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。能夠引起核酸變性的因素很多。溫度升高、酸堿度改變、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的變性。,.,9,變性特征：紫外吸收增加，粘度降低，浮力密度升高，比旋下降等。RNA本身只有局部的雙螺旋區(qū)，所以變性行為所引起的性質(zhì)變化沒(méi)有DNA那樣明顯。變性后紫外吸收增加，稱為增色效應(yīng)。*增色效應(yīng)的機(jī)理？,.,10,融解溫度或熔點(diǎn)：加熱變性使DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)的溫度，用Tm表示。DNATm值影響因素：（1）DNA均一性：均一性影響Tm的范圍寬度（2）G-C含量：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44（3）介質(zhì)中離了強(qiáng)度，高離子強(qiáng)度Tm較大，離子強(qiáng)度大利于維持DNA結(jié)構(gòu)。,.,11,DNA變性,.,12,(二)核酸的復(fù)性,（1）變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開(kāi)的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)。（2）將熱變性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性，此過(guò)程稱為退火。（3）復(fù)性DNA紫外吸收減少，稱為減色效應(yīng)。其原因：雙螺旋結(jié)構(gòu)使堿基電子云發(fā)生重疊，減少了對(duì)紫外光的吸收。,.,13,DNA復(fù)性,.,14,(3)核酸的雜交,熱變性的DNA單鏈，在復(fù)性時(shí)并不一定與同源DNA互補(bǔ)鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，它也可以與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源DNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子（分子雜交）。DNA單鏈與互補(bǔ)的RNA鏈之間也可以發(fā)生雜交。核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。,.,15,核酸的雜交,.,16,幾種分子雜交,*1、Southern印跡法（Southernbloting）分析DNA的雜交方法，圖解見(jiàn)P510圖14-92、Northern印跡法（Northernbloting）分析RNA的雜交方法3、Western印跡法（Westernbloting）分析蛋白質(zhì)的雜交方法,.,17,習(xí)題,cAMP和cGMP假尿苷Southern印跡法核酸的變性核酸的復(fù)性退火增色效應(yīng)減色效應(yīng)Northern印跡法融解溫度外顯子代表：A一段可轉(zhuǎn)錄的DNA序列B一段轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列C一段基因序列D一段非編碼的DNA序列E一段編碼的DNA序列*在DNA雙螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)模型中，正確的表達(dá)是：A兩條鏈方向相同，都是右手螺旋B兩條鏈方向相同，都是左手螺旋C兩條鏈方向相反，都是右手螺旋D兩條鏈方向相反，都是左手螺旋E兩條鏈的堿基順序相同F(xiàn)兩條鏈的堿基順序互補(bǔ)可見(jiàn)于核酸分子的堿基是：A5-甲基胞嘧啶B2-硫尿嘧啶C5-氟尿嘧啶D四氧嘧啶E6-氮雜尿嘧啶,.,18,習(xí)題,核酸分子中的共價(jià)鍵包括：A嘌呤堿基第9位N與核糖第1位C之間連接的-糖苷鍵B磷酸與磷酸之間的磷酸酯鍵C磷酸與核糖第一位C之間連接的磷酸酯鍵D核糖與核糖之間連接的糖苷鍵*Watson和Crick提出DNA雙螺旋學(xué)說(shuō)的主要依據(jù)是A、DNA是細(xì)菌的轉(zhuǎn)化因子B、細(xì)胞的自我復(fù)制C、一切細(xì)胞都含有DNAD、DNA堿基組成的定量分析E、對(duì)DNA纖維和DNA晶體的X光衍射分析F、以上都不是主要依據(jù)含有稀有堿基比例較多的核酸是：、胞核DNA、線粒體DNA、RNA、RNA、RNA、hnRNA嘌呤核苷中嘌呤與戊糖的連接鍵是：AN9C1B.C8C1C.N1C1D.N7C1E.N1C1F.C5C1,.,19,習(xí)題,Tm值高的DNA分子中（C+G）%含量高。由于RNA不是雙鏈，因此所有的RNA分子中都沒(méi)有雙螺旋結(jié)構(gòu)。Tm值低的DNA分子中（A=T）%含量高。由于RNA不是雙鏈，因此所有的RNA分子中都沒(méi)有雙螺旋結(jié)構(gòu)。DNA堿基摩爾比規(guī)律僅適合于雙鏈，而不適合于單鏈。起始濃度高、含重復(fù)序列多的DNA片段復(fù)性速度快。核苷酸的等電點(diǎn)的大小取決于核糖上的羥基與磷酸基的解離。核苷酸的堿基和糖相連的糖苷鍵是C-O型。有一噬菌體的突變株其DNA長(zhǎng)度為15m，而野生型的DNA長(zhǎng)度為17m，問(wèn)該突變體的DNA中有多少個(gè)堿基缺失？,.,20,習(xí)題,以下是雙股DNA在含有1mmol/LEDTA的10mmol/L磷酸緩沖液中所得到的Tm數(shù)據(jù)：樣品（G+C）%Tm（）A70.078.5B52.571.2C37.565.0Z？73.3（1）在上述情況下，推導(dǎo)一個(gè)（G+C）%含量與Tm的關(guān)系的公式。計(jì)算樣品Z的（G+C）%含量？大腸桿菌內(nèi)RNA的總質(zhì)量是3.2*1010道爾