碩士研究生畢業(yè)論文三七藥材及提取物農(nóng)藥殘留測定分析.doc

XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 1 碩士研究生畢業(yè)論文 三七藥材及提取物三七藥材及提取物 農(nóng)藥殘留測定分析農(nóng)藥殘留測定分析 XXXX 年 XX 月 XX 日 XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 2 中文摘要中文摘要 三七是我國的名貴中藥，為了有效地監(jiān)測其農(nóng)藥殘留情況，控制其內(nèi)在質(zhì) 量，滿足國際市場的要求，本論文建立了三七藥材及其提取物和制劑的農(nóng)藥殘 留分析方法，并制定相應(yīng)的限度標(biāo)準(zhǔn)，同時為其他中藥建立通用的農(nóng)藥殘留分 析方法與嚴(yán)格完善的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)與方法借鑒，提高中藥品 質(zhì)，增強(qiáng)中藥在國際市場上的競爭力，使中藥早日全面進(jìn)入國際市場。 本論文結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)，運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了三七藥材、 三七藥材提取物三七三醇皂苷及三七通舒膠囊中四大類 20 種農(nóng)藥同時測定的定 性定量分析方法。首先對色譜柱、進(jìn)樣口溫度、特征離子、離子源溫度等進(jìn)行 優(yōu)選研究，確定了色譜、質(zhì)譜條件，然后再通過對樣品提取溶劑、提取方法和 凈化方法的實(shí)驗(yàn)研究，確定了三七藥材、三七三醇皂苷原料藥及三七通舒膠囊 的樣品前處理方法，之后對建立的方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，最后運(yùn)用建立的分析 方法分別對 15 個批次的三七藥材、15 個批次的三七三醇皂苷原料藥及 15 個批 次的三七通舒膠囊進(jìn)行 20 種農(nóng)藥殘留量的檢測。 結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)所建立的 20 種農(nóng)藥殘留測定的分析方法準(zhǔn)確靈敏、穩(wěn)定可 靠，重復(fù)性、專屬性和耐用性均很好，可控性強(qiáng)。15 批 PTS 和 15 批三七通舒 膠囊均未檢出 20 種農(nóng)藥，而三七藥材中農(nóng)藥殘留現(xiàn)象較為普遍，15 批藥材有 不同程度的農(nóng)藥殘留檢出。 關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：三七藥材；三七三醇皂苷；三七通舒膠囊；農(nóng)藥殘留；氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用；固相萃取。 XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 3 ABSTRACTABSTRACT Panax Notoginseng is a very valuable medicine in China.To monitor its pesticide residues effectively,control its inner quality,meet the requirements of international markets,this thesis established methods of analysis for pesticide residues in Panax Notoginseng,its extract and its herbal preparation,and made limit standards.At the same time,it provided scientific basis and mothods reference for the establishment of universal methods of analysis for pesticide residues and strict,complete limit standards in other Chinese materia medica,improved the quality of Chinese materia medica,enhanced the competitiveness of Chinese materia medica in the international markets and made Chinese materia medica fully enter international markets as soon as possile. This thesis incorporated the literatures at home and abroad, made use of gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS),to develop methods of qualitative and quantitative analysis simultaneously for 20 pesticide residues in Panax Notoginseng, its extract PTS and SanQiTongShu Capsules.First,we studied and optimized the chromatographic columns,injection temperature,characteristic ions,ion source temper- ature during the experiment,built the GC and MS condition.Then we studied the extra- ction solvents, extraction methods and purification methods of sample and built the pre-processing methods of Panax Notoginseng,PTS raw materials and SanQiTongShu Capsules.Then we studied method validation.Finally,we used the analytical methods built up to detect 20 pesticide residues in 15 batches of Panax Notoginseng, 15 batch- es of PTS and 15 batches of SanQiTongShu Capsules. The results showed that the analytical methods built up to determine 20 pesticide residues were accurate,stable and reliable,which had a high sensitivity,good repeatability,good specificity,good durability and good controllability.None of 20 pes- ticides were detected in 15 batches of PTS and 15 batches of SanQiTongShu Capsules .But the phenomenon of pesticide residues in Panax Notoginseng was common,and different levels of pesticide residues were detected in 15 batches of Panax Notogin- seng. Keywords:Keywords:Panax Notoginseng; Protopanaxatriol Saponin(PTS); SanQi TongShu Capsule;pesticide residues;gas chromatography-mass spectrometry;solid phase extrac- tion(SPE). XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 4 目目 錄錄 中文摘中文摘要要 .1 1 ABSTABSTR RACTACT .2 2 目目 錄錄 .3 3 縮略詞英縮略詞英漢漢對照對照 .5 5 1.1.引引言言 .6 6 1.1 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀 .6 1.2 項(xiàng)目研究的意義與創(chuàng)新點(diǎn) .7 2.2.正正文文 .8 8 2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料 .8 2.1.1 儀器與設(shè)備 .8 2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品 .8 2.1.3 試藥 .9 2.1.4 試劑 .10 2.2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果 .10 2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的制備 .10 2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液的制備 .10 2.2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 .11 2.2.1.3 內(nèi)標(biāo)儲備溶液的制備 .12 2.2.1.4 內(nèi)標(biāo)工作溶液的制備 .12 2.2.2 色譜、質(zhì)譜條件 .13 2.2.3 供試品溶液的制備 .13 2.2.3.1 三七藥材供試品溶液的制備 .13 2.2.3.2 三七三醇皂苷原料藥供試品溶液的制備 .14 2.2.3.3 三七通舒膠囊供試品溶液的制備 .14 2.2.4 實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化研究 .15 2.2.4.1 色譜條件的選擇 .15 2.2.4.2 質(zhì)譜條件的選擇 .15 2.2.4.3 樣品前處理方法的選擇 .17 2.2.5 方法學(xué)研究 .19 2.2.5.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) .19 XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 5 2.2.5.2 檢測限和定量限 .19 2.2.5.3 線性范圍考察 .21 2.2.5.4 回收率試驗(yàn) .26 2.2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) .29 2.2.5.6 精密度試驗(yàn) .30 2.2.5.7 專屬性試驗(yàn) .33 2.2.5.8 耐用性試驗(yàn) .35 2.2.6 農(nóng)藥殘留量測定 .36 2.2.6.1 定性測定 .36 2.2.6.2 定量測定 .36 2.2.6.3 樣品測定 .36 2.3 結(jié)論 .38 2.4 討論 .39 2.4.1 三七藥材、PTS 及三七通舒膠囊 20 種農(nóng)藥殘留量限量標(biāo)準(zhǔn)的制定 .39 2.4.2 基質(zhì)效應(yīng)的影響 .40 2.4.3 中藥農(nóng)殘殘留研究中存在的問題 .41 2.4.4 展望 .41 3.3.總總結(jié)結(jié) .4343 致致 謝謝 .4444 參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn) .4545 附附 圖圖 .4848 綜綜 述述 .4949 后置部分后置部分 .6161 XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 6 縮略詞英漢對照縮略詞英漢對照 縮略詞縮略詞英文名稱英文名稱中文名稱中文名稱 EIEIElectronElectron IonisationIonisation 電子電離電子電離 GCGCGasGas ChromatographyChromatography 氣相色譜氣相色譜 GPCGPCGelGel PermeationPermeation ChromatographyChromatography 凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜 LODLODLimitLimit OfOf DetectionDetection 檢測限檢測限 LOQLOQLimitLimit OfOf QuantitationQuantitation 定量限定量限 MRLMRLMaximumMaximum ResidueResidue LimitLimit 最大殘留限量最大殘留限量 MSMSMassMass SpectrometrySpectrometry 質(zhì)譜質(zhì)譜 NDNDNoNo DetectedDetected 未檢出未檢出 PTSPTSProtoparaxotriolProtoparaxotriol SaponinsSaponins 三七三醇皂苷三七三醇皂苷 RSDRSDRelativeRelative StandardStandard DeviationDeviation 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 SCANSCANSCANSCAN 全掃描全掃描 SIMSIMSelectedSelected IonIon MonitoringMonitoring 選擇離子監(jiān)測選擇離子監(jiān)測 SPESPESolidSolid PhasePhase ExtractionExtraction 固相萃取固相萃取 SPMESPMESolidSolid PhasePhase MicroextractionMicroextraction 固相微萃取固相微萃取 TICTICTotalTotal IonsIons ChromatographyChromatography 總離子流色譜總離子流色譜 XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 7 1 1引引 言言 上世紀(jì)八十年代以來，隨著人類健康意識的增強(qiáng)和回歸大自然的浪潮高漲， 人們越來越重視中藥中農(nóng)藥的殘留問題。資料顯示，我國的中藥材農(nóng)藥污染現(xiàn) 象較為普遍，我國出口的中藥在日韓、歐美等國市場上多次因農(nóng)藥殘留超標(biāo)等 原因被查扣返回1，極大地影響了中藥的聲譽(yù)，農(nóng)藥殘留問題已成為中藥走向 世界的“攔路虎” 。因此，中藥農(nóng)藥殘留問題是我國中藥研究領(lǐng)域亟待解決的關(guān) 鍵問題之一。 1.11.1 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀國內(nèi)外研究現(xiàn)狀 上世紀(jì)八十年代以來，由于現(xiàn)代分析技術(shù)和儀器的飛速發(fā)展，我國科學(xué)工 作者開始對中藥的農(nóng)藥殘留檢測進(jìn)行研究。但到目前為止，我國中藥農(nóng)藥殘留 分析研究中絕大多數(shù)仍然采用傳統(tǒng)氣相色譜法或液相色譜法配備不同的檢測器 進(jìn)行檢測，很少采用先進(jìn)的各種色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。而且研究多集中在單一中 藥品種中的某一類農(nóng)藥如有機(jī)氯類的分析方法研究，尚未出現(xiàn)中藥中農(nóng)藥殘留 全成分研究的報(bào)道。近年來，也出現(xiàn)了少量運(yùn)用固相萃取法（SPE） 、色譜-質(zhì)譜 聯(lián)用技術(shù)檢測中藥中農(nóng)藥殘留的報(bào)道2,3,4,5,6,7,8，但都是僅限于實(shí)驗(yàn)室研究，尚 未大范圍應(yīng)用。此外，我國的中藥農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)不僅數(shù)量少，覆蓋農(nóng)藥品 種少。 中國藥典2005 版一部9中對于農(nóng)藥殘留量的測定只規(guī)定了 9 種有機(jī)氯 類農(nóng)藥、12 種有機(jī)磷類農(nóng)藥和 3 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥三類農(nóng)藥的 3 種測定方法， 覆蓋農(nóng)藥品種少，而且分析方法均為單一的氣相色譜法，對中藥提取物和中藥 制劑中的農(nóng)藥殘留均未進(jìn)行限制。我國現(xiàn)在執(zhí)行的涉及中藥農(nóng)藥殘留限量的標(biāo) 準(zhǔn)有中國藥典2005 年版中規(guī)定的甘草、黃芪標(biāo)準(zhǔn)；香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)（第一 冊） ；國家藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) （WM/T2-2004） ；國家標(biāo)準(zhǔn)人 參（GB/T 155l7.1 及 GB/T l8335） ；國家標(biāo)準(zhǔn)甘草（GB/T l9618-2004） ；國家 標(biāo)準(zhǔn)枸杞（GB/T 18672-2002） ；國家標(biāo)準(zhǔn)三七（GB 19086-2003） ；北京市中 藥炮制規(guī)范中人參、枸杞飲片1。但以上標(biāo)準(zhǔn)都只檢測相關(guān)藥材中六六六、 滴滴涕等少數(shù)幾種有機(jī)氯類農(nóng)藥。 在國外，歐美、日韓等發(fā)達(dá)國家多采用先進(jìn)成熟的分析檢測技術(shù)進(jìn)行植物 XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 8 藥農(nóng)藥殘留監(jiān)測工作，如固相萃取法（SPE） 、固相微萃取技術(shù)(SPME)、氣相色 譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、超臨界流體色譜技術(shù)、毛細(xì)管 電泳技術(shù)等10,11,12,13,14,15，這些技術(shù)的應(yīng)用大大提高了農(nóng)藥殘留檢測的靈敏度、 定性、定量能力，擴(kuò)大了檢測農(nóng)藥的覆蓋范圍，目前國外已發(fā)展出可以同時檢 測上百種農(nóng)藥的多殘留分析系統(tǒng)，如美國 FDA 的多殘留檢測方法可檢測 360 多 種農(nóng)藥，德國 DFG 的方法可檢測 325 種農(nóng)藥，加拿大多殘留檢測方法可檢測 251 種農(nóng)藥（其中 GC-MS 檢測 239 種）16,17。歐盟除規(guī)定了有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留 量外，還規(guī)定了有機(jī)磷類農(nóng)藥和除蟲菊酯類農(nóng)藥的限量，對植物藥中農(nóng)藥殘留 的限量規(guī)定遠(yuǎn)嚴(yán)于中國。目前，歐盟已經(jīng)對 133 種農(nóng)藥設(shè)定了 17000 個限量， 并通過與美國藥典 、 日本藥典的協(xié)調(diào)，使各國藥典的檢查項(xiàng)和限量標(biāo)準(zhǔn) 達(dá)成一致，規(guī)定了植物藥中 34 種農(nóng)藥的最大殘留限量18。 而對于中藥提取物和中藥制劑的農(nóng)藥殘留分析研究，相關(guān)的報(bào)道非常少。 由于中藥提取物和中藥制劑在制備過程中，原料中藥材經(jīng)過提取、凈化、濃縮、 干燥、制劑成型等復(fù)雜的步驟后農(nóng)藥的殘留量變得很低，而且中成藥制劑、劑 型多樣，使得農(nóng)藥的提取、分離、凈化與富集難度增大，檢測更為復(fù)雜。迄今 為止，國內(nèi)外尚未統(tǒng)一制定出中成藥中農(nóng)藥殘留量的檢測方法和限量標(biāo)準(zhǔn)。 1.21.2 項(xiàng)目研究的意義與創(chuàng)新點(diǎn)項(xiàng)目研究的意義與創(chuàng)新點(diǎn) 查閱近 20 年來關(guān)于三七中農(nóng)藥殘留檢測研究的文獻(xiàn)，僅有 6 篇19,20,21,22,23,24， 且多數(shù)僅僅對三七藥材中的六六六、滴滴涕等少數(shù)幾種有機(jī)氯類農(nóng)藥進(jìn)行了測 定。本項(xiàng)目研究的目的在于建立三七藥材及其提取物和制劑的中藥農(nóng)藥多殘留 分析方法，并制定相應(yīng)的限度標(biāo)準(zhǔn)，使中藥三七滿足國際市場的要求，同時更 重要的是為中藥建立先進(jìn)通用的農(nóng)藥殘留分析方法與嚴(yán)格完善的農(nóng)藥殘留限量 標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)與方法借鑒，提高中藥品質(zhì)，樹立中藥在國際市場上的良好 聲譽(yù)，增強(qiáng)中藥在國際市場上的競爭力，使中藥早日全面進(jìn)入國際市場。 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于：首次運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對三七 藥材、藥材提取物及其制劑進(jìn)行檢測分析；首次運(yùn)用先進(jìn)成熟的固相萃取法 （SPE）對三七藥材、藥材提取物及其制劑樣品進(jìn)行前處理。 XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 9 2.2.正正 文文 2.12.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料實(shí)驗(yàn)儀器與材料 2.1.12.1.1 儀器與設(shè)備儀器與設(shè)備 Agilent 7890A 氣相色譜儀（安捷倫科技公司） ， Agilent 5975C 質(zhì)譜儀（安捷倫科技公司） ， Sartorius BP211D 十萬分之一分析天平（德國賽多利斯公司） ， METTLER AE240 萬分之一分析天平（瑞士梅特勒公司） ， Waters 固相萃取儀（美國沃特世公司） ， Caliper TurboVap LV 全自動氮吹儀（美國 Caliper Life Sciences 公司） ， IKA MS3 數(shù)碼渦旋振蕩儀（廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)公司） ， HY-2A 往復(fù)振蕩器（江蘇常州澳華儀器公司） ， Auto Science AS5150A 超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）, Gilson Pipetman P20、P100、P200、P1000 移液器（法國吉爾森公司） ， Agela ODS C18 固相萃取柱（天津艾杰爾博納公司） ， Agela Florisil 固相萃取柱（天津艾杰爾博納公司） ， Agela PestiCarb/NH2 固相萃取柱（天津艾杰爾博納公司） 。 2.1.22.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品 20 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的名稱、分子量、分類、含量及生產(chǎn)廠家見 表 1。 XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 10 表表 1 1 2020 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的名稱、分子量、分類、含量及廠家種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的名稱、分子量、分類、含量及廠家 編號中文名稱英文名稱分子量分類 含量 （%） 生產(chǎn)廠家 01 -六六六 Alpha-HCH290.82 有機(jī)氯類 97.5 德國 GmbH 公司 02 -六六六 Beta-HCH290.82 有機(jī)氯類 98.4 德國 GmbH 公司 03 -六六六 Gamma-HCH290.82 有機(jī)氯類 98.5 德國 GmbH 公司 04 五氯硝基苯 Quintozene295.33 有機(jī)氯類 97.0 德國 GmbH 公司 05 百菌清 Chlorothalonil265.91 有機(jī)氯類 97.5 德國 GmbH 公司 06 七氯 Heptachlor373.32 有機(jī)氯類 98.7 德國 GmbH 公司 07 甲基五氯 苯基硫醚 Methyl-pentachlorophenyl sulfide 296.43 有機(jī)氯類 99.0 德國 GmbH 公司 08 毒死蜱 Chlorpyrifos350.59 有機(jī)磷類 99.0 德國 GmbH 公司 09 艾氏劑 Aldrin364.91 有機(jī)氯類 98.5 德國 GmbH 公司 10 腐霉利 Procymidone284.14 殺真菌劑 99.5 德國 GmbH 公司 11 -氯丹 Gamma-Chlordane409.78 有機(jī)氯類 99.7 德國 GmbH 公司 12 順式氯丹 Cis-Chlordane409.78 有機(jī)氯類 99.0 德國 GmbH 公司 13 4，4-滴滴伊p，p-DDE 318.02 有機(jī)氯類 98.5 德國 GmbH 公司 14 4，4-滴滴滴p，p-DDD 320.04 有機(jī)氯類 98.0 德國 GmbH 公司 15 2，4-滴滴涕o，p-DDT 354.49 有機(jī)氯類 98.5 德國 GmbH 公司 16 4，4-滴滴涕p，p-DDT 354.49 有機(jī)氯類 98.5 德國 GmbH 公司 17 甲氰菊酯 Fenpropathrin349.43 擬除蟲菊酯類 99.5 德國 GmbH 公司 18 功夫菊酯 Lambda-cyhalothrin449.90 擬除蟲菊酯類 98.5 德國 GmbH 公司 19 -氯氰菊酯 Alpha-Cypermethrin416.33 擬除蟲菊酯類 99.5 德國 GmbH 公司 20 順式氰戊菊酯 Esfenvalerate419.90 擬除蟲菊酯類 98.0 德國 GmbH 公司 21 三硫磷（內(nèi)標(biāo)） Carbophenothion342.87 有機(jī)磷類 99.4 德國 GmbH 公司 2.1.32.1.3 試藥試藥 三七藥材 15 批及空白陰性藥材 1 批，三七藥材提取物三七三醇皂苷 XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 11 （PTS）原料藥 15 批及空白陰性 PTS 1 批、三七通舒膠囊 15 批及空白陰性三七 通舒膠囊 1 批，以上三種試藥均由成都華神集團(tuán)公司制藥廠提供。各供試品的 編號及批號見表 2。 表表 2 2 三種試藥三種試藥 4545 批供試品的編號及其批號批供試品的編號及其批號 編號三七藥材批號PTS 批號三七通舒膠囊批號 01060601071204080102 02061101071223080501 03070101080105080607 04070301080416080802 05070401080503080907 06071001080504081105 07071002080505090201 08071003080507090202 09071101080601090203 10071102080606090204 11071103081105090205 12071104081106090206 13071201081201090207 14071202081202090209 15080301081203090210 16 061201（空白）080101（空白）080601（空白） 2.1.42.1.4 試劑試劑 乙腈，正己烷，丙酮，乙酸乙酯，甲苯，無水硫酸鈉。除無水硫酸鈉為分 析純外，其余均為色譜純。高純氦氣（純度99.999%） （四川梅塞爾氣體公司） 。 2.22.2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果 2.2.12.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的制備 2.2.1.12.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液的制備 分別精密稱取一定量的 20 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，各置于 100ml 容量瓶中，加入乙 酸乙酯適量溶解，再加入乙酸乙酯定容至刻度，搖勻，即得 20 種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)品 XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 12 儲備溶液。20 種農(nóng)藥的稱樣量及單標(biāo)濃度見表 3。 表表 3 3 2020 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的稱樣量及單標(biāo)濃度種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的稱樣量及單標(biāo)濃度 農(nóng)藥名稱稱樣量（mg）單標(biāo)濃度（g/ml） -六六六 10.1198.57 -六六六 11.19110.11 -六六六 11.15109.83 五氯硝基苯 9.6793.80 百菌清 9.7695.16 七氯 12.55123.87 甲基五氯苯基硫醚 10.59104.84 毒死蜱 10.84107.32 艾氏劑 9.2090.62 腐霉利 11.18111.24 -氯丹 9.5294.91 順式氯丹 3.2131.78 4，4-滴滴伊 10.33101.75 4，4-滴滴滴 10.31101.04 2，4-滴滴涕 9.2591.11 4，4-滴滴涕 9.8597.02 甲氰菊酯 9.8397.81 功夫菊酯 10.92107.56 -氯氰菊酯 12.58125.17 順式氰戊菊酯 10.33101.23 2.2.1.22.2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密移取上述 20 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液各一定量置于置于同一 100ml 容量 瓶中，加入乙酸乙酯稀釋定容至刻度，搖勻即得。20 種農(nóng)藥的取液量及濃度見 表 4。 XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 13 表表 4 4 2020 種農(nóng)藥的取液量及混標(biāo)濃度種農(nóng)藥的取液量及混標(biāo)濃度 農(nóng)藥名稱取液量（ml）混標(biāo)濃度（g/ml） -六六六 1.00.99 -六六六 1.01.10 -六六六 1.01.10 五氯硝基苯 3.02.81 百菌清 1.00.95 七氯 2.02.48 甲基五氯苯基硫醚 1.51.57 毒死蜱 3.03.22 艾氏劑 3.02.72 腐霉利 3.03.34 -氯丹 1.51.42 順式氯丹 5.01.59 4，4-滴滴伊 1.01.02 4，4-滴滴滴 1.01.01 2，4-滴滴涕 2.01.82 4，4-滴滴涕 2.01.94 甲氰菊酯 4.03.91 功夫菊酯 4.04.30 -氯氰菊酯 5.06.26 順式氰戊菊酯 5.05.06 2.2.1.32.2.1.3 內(nèi)標(biāo)儲備溶液的制備內(nèi)標(biāo)儲備溶液的制備 精密稱取三硫磷標(biāo)準(zhǔn)品 15.51mg 置于 100ml 容量瓶中，加入乙酸乙酯適量 溶解，再加入乙酸乙酯定容至刻度，搖勻即得。 2.2.1.42.2.1.4 內(nèi)標(biāo)工作溶液的制備內(nèi)標(biāo)工作溶液的制備 XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 14 精密移取內(nèi)標(biāo)儲備液 5ml 置于 50ml 容量瓶中，加入乙酸乙酯定容至刻度， 搖勻即得。 2.2.22.2.2 色譜、質(zhì)譜條件色譜、質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜條件：色譜柱：HP-1MS 毛細(xì)管色譜柱（30m0.32mm1m） ；柱溫升 溫程：80（保持 1min） ，以 15/min 升至 180，再以 3/min 升至 205 （保持 10min） ，再以 5/min 升至 270（保持 3min） ，最后以 30/min 升至 280（保持 9min） ；載氣：高純氦氣，載氣速度：1.0ml/min（0-44min） ， 3.0ml/min（44-63min） ；進(jìn)樣方式：脈沖不分流，1.5min 后打開分流閥；進(jìn)樣 口溫度：260；進(jìn)樣量：2l。 質(zhì)譜條件：質(zhì)譜條件：離子源：電子電離（EI）源；電離能量：70eV；離子源溫度： 250；GC-MS 接口溫度：280；四級桿溫度：180；溶劑延遲：14min；掃 描模式：選擇離子監(jiān)測（SIM） ，1 個定量離子，2-3 個定性離子。所有離子按各 農(nóng)藥保留時間的先后順序，分時段分別檢測。 2.2.32.2.3 供試品溶液的制備供試品溶液的制備 2.2.3.12.2.3.1 三七藥材供試品溶液的制備三七藥材供試品溶液的制備 提取提取 取供試品粉末（過三號篩）約 2g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中， 加入乙腈 20ml，無水硫酸鈉 8g，振蕩 60min（250r/min） ，濾過，濾液備用；藥 渣加入乙腈 10ml，振蕩 10min（250r/min） ，濾過，濾液與前濾液合并，置氮吹 儀上 40吹至約 1ml，待凈化。 凈化凈化 將上述提取濃縮液置于 C18 固相萃取柱（1000mg/6ml，加樣前柱 上加無水硫酸鈉約 1cm 高，用乙腈 5ml 預(yù)淋洗）上，容器用乙腈洗滌 3 次，每 次 1ml，洗液置于同一 C18 柱上，再用乙腈 15ml 洗脫，收集洗脫液，置氮吹儀 上 40吹至約 1ml，加少量正己烷替換兩次至乙腈除盡，殘?jiān)诱和?1ml 使 溶解，置于弗羅里硅土（Florisil）固相萃取柱（1000mg/6ml，加樣前柱上加 無水硫酸鈉約 1cm 高，依次用正己烷-丙酮（9:1）10ml 和正己烷 10ml 預(yù)淋洗） 上，容器用正己烷-丙酮（9:1）洗滌 3 次，每次 1ml，洗液置于同一 Florisil 柱上，再用正己烷-丙酮（9:1）15ml 洗脫，收集洗脫液，置氮吹儀上 40吹至 約 1ml，加少量乙腈替換兩次至正己烷、丙酮除盡，殘?jiān)右译?1ml 使溶解， XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 15 置于石墨化碳/氨基（PestiCarb/NH2）串聯(lián)固相萃取柱（500mg+500mg/6ml，加 樣前柱上加無水硫酸鈉約 1cm 高，用乙腈-甲苯（3:1）5ml 預(yù)淋洗）上，容器 用乙腈-甲苯（3:1）洗滌 3 次，每次 1ml，洗液置同一 PestiCarb/NH2串聯(lián)柱上， 再用乙腈-甲苯（3:1）25ml 洗脫，置氮吹儀上 40吹至近干，加入內(nèi)標(biāo)工作溶 液 40l、乙酸乙酯 960l 使溶解，渦旋混勻，經(jīng) 0.2m 濾膜濾過，取續(xù)濾液， 即得。 2.2.3.22.2.3.2 三七三醇皂苷原料藥供試品溶液的制備三七三醇皂苷原料藥供試品溶液的制備 提取提取 取供試品粉末約 2g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入乙腈 20ml，無水硫酸鈉 8g，振蕩 60min（250r/min） ，濾過，濾液備用；藥渣加入乙 腈 10ml，振蕩 10min（250r/min） ，濾過，濾液與前濾液合并，置氮吹儀上 40 吹至約 1ml，待凈化。 凈化凈化 將上述提取濃縮液置于 C18 固相萃取柱（1000mg/6ml，加樣前柱 上加無水硫酸鈉約 1cm 高，用乙腈 5ml 預(yù)淋洗）上，容器用乙腈洗滌 3 次，每 次 1ml，洗液置于同一 C18 柱上，再用乙腈 15ml 洗脫，收集洗脫液，置氮吹儀 上 40吹至約 1ml，置于石墨化碳/氨基（PestiCarb/NH2）串聯(lián)固相萃取柱 （500mg+500mg/6ml，加樣前柱上加無水硫酸鈉約 1cm 高，用乙腈-甲苯 （3:1）5ml 預(yù)淋洗）上，容器用乙腈-甲苯（3:1）洗滌 3 次，每次 1ml，洗液 置同一 PestiCarb/NH2串聯(lián)柱上，再用乙腈-甲苯（3:1）25ml 洗脫，置氮吹儀 上 40吹至近干，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液 40l、乙酸乙酯 960l 使溶解，渦旋混勻， 經(jīng) 0.2m 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。 2.2.3.32.2.3.3 三七通舒膠囊供試品溶液的制備三七通舒膠囊供試品溶液的制備 提取提取 取供試品膠囊內(nèi)容物約 2g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入 乙腈 20ml，無水硫酸鈉 8g，振蕩 60min（250r/min） ，濾過，濾液備用；藥渣加 入乙腈 10ml，振蕩 10min（250r/min） ，濾過，濾液與前濾液合并，置氮吹儀上 40吹至約 1ml，待凈化。 凈化凈化 將上述提取濃縮液置于 C18 固相萃取柱（1000mg/6ml，加樣前柱 上加無水硫酸鈉約 1cm 高，用乙腈 5ml 預(yù)淋洗）上，容器用乙腈洗滌 3 次，每 次 1ml，洗液置于同一 C18 柱上，再用乙腈 15ml 洗脫，收集洗脫液，置氮吹儀 XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 16 上 40吹至約 1ml，置于石墨化碳/氨基（PestiCarb/NH2）串聯(lián)固相萃取柱 （500mg+500mg/6ml，加樣前柱上加無水硫酸鈉約 1cm 高，用乙腈-甲苯 （3:1）5ml 預(yù)淋洗）上，容器用乙腈-甲苯（3:1）洗滌 3 次，每次 1ml，洗液 置同一 PestiCarb/NH2串聯(lián)柱上，再用乙腈-甲苯（3:1）25ml 洗脫，置氮吹儀 上 40吹至近干，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液 40l、乙酸乙酯 960l 使溶解，渦旋混勻， 經(jīng) 0.2m 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。 2.2.42.2.4 實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化研究實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化研究 2.2.4.12.2.4.1 色譜條件的選擇色譜條件的選擇 （1 1）色譜柱的優(yōu)選）色譜柱的優(yōu)選 對 HP-1MS 毛細(xì)管柱（30m0.25mm0.25m） 、HP-1MS 毛細(xì)管柱 （30m0.32mm 1m）和 DB-35MS 毛細(xì)管柱（30m0.32mm0.25m）進(jìn)行了試驗(yàn)比較，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)第一柱各農(nóng)藥出峰時間比后兩柱短，但是個別定量離子相同的峰不能達(dá)到 基線分離；第三柱雖然能夠使 20 種農(nóng)藥峰基線分離，然而多數(shù)峰形差，部分峰 出現(xiàn)嚴(yán)重的拖尾；只有第二柱雖然各物質(zhì)出峰時間比第一柱長一些，但是能使 20 中農(nóng)藥全部達(dá)到基線分離，而且峰形較好，故實(shí)驗(yàn)選擇 HP-1MS 毛細(xì)管柱 （30m0.32mm1m） 。 （2 2）進(jìn)樣口溫度的確定）進(jìn)樣口溫度的確定 進(jìn)樣口溫度直接影響著目標(biāo)物的響應(yīng)值、峰形和峰分離度，是一個很重要 的實(shí)驗(yàn)條件。取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別于進(jìn)樣口溫度 230、240、250、 260、270時進(jìn)樣分析，結(jié)果表明：當(dāng)進(jìn)洋口溫度250時，20 種農(nóng)藥的 響應(yīng)值變化不大，峰形較好，達(dá)到基線分離。由于實(shí)驗(yàn)所用的 20 種農(nóng)藥沸點(diǎn)差 異較大，為保證其充分汽化，并考慮到儀器的承受能力和使用壽命，最終實(shí)驗(yàn) 選擇進(jìn)樣口溫度為 260。 2.2.4.22.2.4.2 質(zhì)譜條件的選擇質(zhì)譜條件的選擇 （1 1）特征離子的確定）特征離子的確定 移取內(nèi)標(biāo)工作溶液 0.1ml，混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1.0ml 置于同一 2ml 容量瓶內(nèi)， XXXX 醫(yī)藥大學(xué) XXXX 年碩士研究生畢業(yè)論文 17 加乙酸乙酯定容至刻度，搖勻，進(jìn)樣分析，選擇全掃描方式（SCAN）得到 20 種 農(nóng)藥和內(nèi)標(biāo)三硫磷的總離子流色譜圖（TIC）,提取出每個峰的質(zhì)譜圖，再在化 合物譜庫中進(jìn)行檢索，確證每一種農(nóng)藥。然后在每種農(nóng)藥的質(zhì)譜圖中選擇三至 四個豐度高、質(zhì)量數(shù)大、干擾小的碎片離子作為相應(yīng)農(nóng)藥的定性、定量特征監(jiān) 測離子，其中定量離子 1 個，定性離子 2-3 個，采用選擇離子監(jiān)測（SIM）方式 進(jìn)行定性和定量分析。20 種農(nóng)藥和內(nèi)標(biāo)三硫磷的總離子流色譜圖（TIC）見圖 1，保留時間、定量離子、定性離子與 SIM 開始時間見表 5。 表表 5 5 2020 種農(nóng)藥和內(nèi)標(biāo)三硫磷的保留時間、定量離子、定性離子與種農(nóng)藥和內(nèi)標(biāo)三硫磷的保留時間、定量離子、定性離子與 SIMSIM 開始時間開始時間 農(nóng)藥名稱 保留時間 (min) 定量離子 (m/z) 定性離子 (m/z) SIM 開始 時間(min) -六六六 15.70181(100)219(96),254(71),111(80)14.50 -六六六 16.22183(92)219(100),254(63),109(73)16.00 -六六六 17.06181(100)219(95),254(77),111(43)16.70 五氯硝基苯 17.58237(100)295(73),214(52),177(35)17.30 百菌清 18.03266(100)264(83),268(23)17.80 七氯 22.32272(100)237(63),337(15)21.50 甲基五氯苯基硫醚 23.95296(100)246(7