第六章原核生物基因表達調(diào)控

.,第六章原核生物基因表達調(diào)控,前言,.,一、基因表達(geneexpression),在一定調(diào)節(jié)機制控制下，基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯而產(chǎn)生其蛋白質(zhì)產(chǎn)物，或轉(zhuǎn)錄后直接產(chǎn)生其RNA產(chǎn)物，如tRNA、rRNA等的過程。大多數(shù)基因的表達產(chǎn)物是蛋白質(zhì),部分基因如tRNA和rRNA基因表達產(chǎn)物是RNA。,.,.,一個典型的原核生物基因的結(jié)構(gòu),.,.,.,二、基因表達調(diào)控,圍繞基因表達過程中發(fā)生的各種各樣的調(diào)節(jié)方式都通稱為基因表達調(diào)控.轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控翻譯水平的調(diào)控,DNA水平,基因丟失；,基因擴增,基因重排；,甲基化修飾；,染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài),RNA水平,轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控；,RNA的轉(zhuǎn)錄后加工；,mRNA從核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)運；,mRNA穩(wěn)定性,蛋白質(zhì)水平,翻譯過程；,翻譯后加工；,蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,.,三、基因表達的特性：,1）時間特異性或階段特異性,2）空間特異性或組織細胞特異性,.,1、時間特異性,按功能需要，某一特定基因的表達嚴格按特定的時間順序發(fā)生，稱之為基因表達的時間特異性(temporalspecificity)。,多細胞生物基因表達的時間特異性又稱階段特異性(stagespecificity)。,.,2、空間特異性（spatialspecificity）:,在個體生長全過程，某種基因產(chǎn)物在個體按不同組織空間順序出現(xiàn)，稱之為基因表達的空間特異性(spatialspecificity)。,基因表達伴隨時間順序所表現(xiàn)出的這種分布差異，實際上是由細胞在器官的分布決定的，所以空間特異性又稱細胞或組織特異性(cellortissuespecificity)。,.,四、基因表達的方式,組成性基因表達適應性表達（誘導和阻遏表達）,.,1、組成性基因表達,某些基因在一個生物個體的幾乎所有細胞中持續(xù)表達，通常被稱為管家基因(house-keepinggene)。,.,無論表達水平高低，管家基因較少受環(huán)境因素影響，而是在個體各個生長階段的大多數(shù)或幾乎全部組織中持續(xù)表達，或變化很小。區(qū)別于其他基因，這類基因表達被視為組成性表達。,.,2、誘導和阻遏表達,誘導表達（induction）指在特定環(huán)境因素刺激下，基因被激活，從而使基因的表達產(chǎn)物增加。這類基因稱為可誘導基因。,阻遏表達（repression）指在特定環(huán)境因素刺激下，基因被抑制，從而使基因的表達產(chǎn)物減少。這類基因稱為可阻遏基因。,.,在一定機制控制下，功能上相關(guān)的一組基因，無論其為何種表達方式，均需協(xié)調(diào)一致、共同表達，即為協(xié)調(diào)表達(coordinateexpression)，這種調(diào)節(jié)稱為協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)(coordinateregulation)。,協(xié)調(diào)表達,.,五、基因表達調(diào)控的基本原理：,1.基因表達調(diào)控的多層次和復雜性,2.基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本要素,.,1.基因表達調(diào)控的多層次和復雜性,四個基本調(diào)控點（1）基因結(jié)構(gòu)的活化（2）轉(zhuǎn)錄起始：最有效的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)（3）轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運（4）翻譯及翻譯后加工,.,DNA水平,基因丟失；,基因擴增,基因重排；,甲基化修飾；,染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài),RNA水平,轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控；,RNA的轉(zhuǎn)錄后加工；,mRNA從核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)運；,mRNA穩(wěn)定性,蛋白質(zhì)水平,翻譯過程；,翻譯后加工；,蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,.,2.基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本要素,基因表達的調(diào)節(jié)與基因的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)，生物個體或細胞所處的內(nèi)、外環(huán)境，以及細胞內(nèi)所存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白有關(guān)。,三個基本要素：1）特異的DNA調(diào)節(jié)序列2）調(diào)節(jié)蛋白3）RNA聚合酶,.,.,基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本要素,1、特異DNA序列,原核生物的操縱子真核生物的順式作用元件（cis-actingelement）,2、調(diào)節(jié)蛋白,.,-操縱子(operon),.,-操縱子(operon),.,-操縱子(operon),由操縱基因以及相鄰的若干結(jié)構(gòu)基因所組成的功能單位，其中結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄受操縱基因所控制。操縱基因是順式控制元件，阻抑蛋白是反式作用因子,.,是指可影響自身基因表達活性的特異DNA序列。通常是非編碼序列。包括啟動子、增強子及沉默子等。,真核生物的順式作用元件,.,.,2、調(diào)節(jié)蛋白,是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白因子，如原核生物的阻遏蛋白和CAP蛋白（降解物基因活化蛋白）、真核生物的基本轉(zhuǎn)錄因子和特異轉(zhuǎn)錄因子等。,.,3、RNA聚合酶,啟動序列影響其與RNA聚合酶的親和力，而親和力大小則直接影響轉(zhuǎn)錄起動的頻率。,原核啟動序列或真核啟動子是由轉(zhuǎn)錄起始點、RNA聚合酶結(jié)合位點及控制轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)組件組成。,.,.,真核生物RNA聚合酶,.,.,六、基因表達調(diào)控的生物學意義,1、適應環(huán)境、維持生長和增殖,2、維持個體發(fā)育與分化,.,第一節(jié)原核基因表達調(diào)控總論,反義鏈模板鏈、（）鏈,正義鏈、編碼鏈、（+）鏈,基因表達,.,轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控,基因表達調(diào)控,.,原核生物主要是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因的表達。當需要某種基因產(chǎn)物時，就大量合成這種mRNA，當不需要這種基因產(chǎn)物時就抑制這種mRNA的轉(zhuǎn)錄，就是讓相應的基因不表達。,.,通常所說的基因不表達，并不是說這個基因就完全不轉(zhuǎn)錄為mRNA，而是轉(zhuǎn)錄的水平很低，維持在一個基礎(chǔ)水平（本底水平）?；虮磉_完全關(guān)閉的情況使極為少見的。,真核生物基因表達的調(diào)控可發(fā)生在不同水平上,.,一、原核基因調(diào)控機制的類型與特點,（一）原核基因調(diào)控機制的類型,負調(diào)控正調(diào)控,geneONOFF,阻遏蛋白,geneOFFON,激活蛋白,基因表達量特別低,.,1、負調(diào)控negativeregulation,在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時基因是表達的，加入某種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因活性就被關(guān)閉，這樣的控制系統(tǒng)就叫做負控系統(tǒng)。其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)叫做阻遏蛋白兩種類型：負控誘導和負控阻遏,負控誘導系統(tǒng),負控阻遏系統(tǒng),.,2、正調(diào)控positiveregulation,在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時基因是關(guān)閉的，加入某種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因活性就被開啟，這樣的控制系統(tǒng)就叫做正控系統(tǒng)。其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)叫做無輔基誘導蛋白（激活蛋白)兩種類型:正控誘導和正控阻遏系統(tǒng),.,.,（二）特殊代謝物調(diào)節(jié)基因表達的類型,可誘導調(diào)節(jié)可阻遏調(diào)節(jié),.,1、可誘導調(diào)節(jié),一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質(zhì)的誘導下使基因活化.調(diào)節(jié)分解代謝的操縱子，同時受cAMP-CAP的活性調(diào)節(jié),可誘導調(diào)節(jié)無誘導物時,geneOFF,可誘導調(diào)節(jié)有誘導物時,geneON,無葡萄糖，cAMP濃度高時,有葡萄糖，cAMP濃度低時,CAP的正性調(diào)節(jié),.,2、可阻遏調(diào)節(jié),一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來開啟的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殛P(guān)閉狀態(tài)，基因的表達被阻遏.調(diào)節(jié)合成代謝的操縱子,.,（三）原核生物基因表達調(diào)控的特點,調(diào)節(jié)的主要環(huán)節(jié)在轉(zhuǎn)錄水平上進行因子決定RNA聚合酶識別特異性主要通過操縱子模式進行調(diào)節(jié)阻遏蛋白對轉(zhuǎn)錄的抑制作用（阻遏機制）是普遍存在的負調(diào)控作用,.,原核生物中基因的組織形式,幾個作用相關(guān)的基因在染色體上串連排列在一起，由同一個調(diào)控系統(tǒng)來控制。這樣的一個整體稱為一個操縱元(operon)。,.,.,.,大腸桿菌至少有6種因子,70,負責識別一般的啟動子,54,識別與氮代謝有關(guān)的基因啟動子,32,識別熱激（heatshock）蛋白質(zhì)基因啟動子,.,二、弱化子對基因活性的影響,1、弱化子在操縱區(qū)與結(jié)構(gòu)基因之間的一段可以終止轉(zhuǎn)錄作用的核苷酸序列，當操縱子被阻遏時，RNA合成被終止，這段核苷酸起終止轉(zhuǎn)錄信號作用.,RNA聚合酶,起調(diào)節(jié)作用的是某種氨酰-tRNA的濃度,RNA分子在分子內(nèi)采用不同的堿基配對方式，形成不同的二級結(jié)構(gòu)而參與調(diào)控。當不同的結(jié)構(gòu)對是否允許終止存在差異時，改變二級結(jié)構(gòu)可對轉(zhuǎn)錄終止進行調(diào)控,2、弱化子作用機制,前導序列,第10、11密碼子為trp密碼子,14aa前導肽編碼區(qū):,包含序列1,形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)能力強弱：序列1/2序列2/3序列3/4,5,trpmRNAtrpL,12,34,寡聚U區(qū),trpE,(a)正常,(b)高Trp,1,2,轉(zhuǎn)錄終止,34,(C)低Trp,1,23,4,轉(zhuǎn)錄延伸,UUUU3,前導肽,前導mRNA,1.當色氨酸濃度高時,轉(zhuǎn)錄衰減機制,衰減子結(jié)構(gòu)就是終止子可使轉(zhuǎn)錄,RNA聚合酶,終止,前導肽,前導mRNA,RNA聚合酶,2.當色氨酸濃度低時,Trp合成酶系相關(guān)結(jié)構(gòu)基因被轉(zhuǎn)錄,序列3、4不能形成衰減子結(jié)構(gòu),.,三、降解物對基因活性的調(diào)節(jié),1、葡萄糖效應（降解物抑制作用）是指當葡萄糖和其它糖類一起作為細菌的碳源時葡萄糖總是優(yōu)先被利用，葡萄糖的存在阻止了其它糖類的利用的現(xiàn)象。,.,2、降解物對基因活性的調(diào)節(jié),葡萄糖通過降低cAMP的含量而抑制基因表達,.,四、細菌的應急反應,指細菌在惡劣生長環(huán)境中關(guān)閉tRNA和核糖體形成的能力。,1、細菌的應急反應,.,2、細菌的應急反應的機制,應急信號：鳥苷四磷酸（ppGpp）、鳥苷五磷酸（pppGpp）誘導物：空載tRNA,焦磷酸轉(zhuǎn)移酶,.,第二節(jié)乳糖操縱子與負控誘導系統(tǒng),.,一、乳糖操縱子(lacoperon)的結(jié)構(gòu)與組成,I,.,.,啟動子RNA聚合酶結(jié)合位點調(diào)節(jié)基因CAP結(jié)合位點操縱基因Z基阻遏蛋白結(jié)合位點mRNA,Lac操縱子調(diào)控區(qū)域,.,乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)基因及其表達產(chǎn)物,.,二、酶的誘導-lac體系受調(diào)控的證據(jù),在不含乳糖及-半乳糖苷的培養(yǎng)基中，lac+基因型每個大腸桿菌細胞內(nèi)大約只有12個酶分子。如果在培養(yǎng)基中加入乳糖，酶的濃度很快達到細胞總蛋白量的6%或7%，每個細胞中可有超過105個酶分子。,1、實驗證據(jù),.,2、實驗用誘導物,乳糖IPTG(異丙基巰基半乳糖苷)TMG(巰甲基半乳糖苷)ONPG(O-硝基半乳糖苷),.,.,pUC18,Ap,r,lacZ,ori,Ap+X-gal,重組子（Apr+lacZ-）,基因工程的藍白斑篩選,.,藍白顯色篩選法,.,三、lac操縱子模型及其影響因子,（一）Lac操縱子模型,控制區(qū),信息區(qū),.,1961年由莫諾（Monod,J.法)和雅各布(Jacob,F.法)提出，用來闡述大腸桿菌乳糖代謝中基因表達的調(diào)控機制。獲1965年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎,.,乳糖操縱子模型的建立(JacobandMonod,1961),獲1965年諾貝爾獎,.,乳糖操縱子模型,1、Z、Y、A基因的產(chǎn)物為一條多順反子mRNA,lacZ：編碼-半乳糖苷酶，它可以將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖；lacY：編碼半乳糖苷透性酶，它能將乳糖運送透過細菌的細胞壁；lacA：編碼硫代半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，進行乳糖代謝。,.,2、P區(qū)位于I與O之間，O為阻遏物結(jié)合位點,啟動子RNA聚合酶結(jié)合位點調(diào)節(jié)基因CAP結(jié)合位點操縱基因Z基因阻遏蛋白結(jié)合位點,.,乳糖操縱元的負調(diào)控,.,Lac操縱子P、O區(qū)的重疊,阻遏物與O區(qū)的結(jié)合影響了RNA聚合酶與啟動子區(qū)結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復合物的效率。,.,4、CAP的正性調(diào)節(jié),.,CyclicAMP,ATP在腺苷酸環(huán)化酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)式AMP(cyclicadenosinemonophosphate,cAMP)。,.,Theadenylcyclase-catalyzedsynthesisofcyclicAMP(cAMP)fromATP,2003JohnWileyandSonsPublishers,.,cAmp-CAP,Cataboliteactivatingprotein,CAP代謝激活蛋白，是cAmp的受體蛋白(cyclicAmpreceptorprotein,CRP)cAmp-CAP復合物，是lac操縱元的正調(diào)控因子,.,乳糖操縱元的正調(diào)控,.,.,.,5、協(xié)調(diào)調(diào)節(jié),當阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時，CAP對該系統(tǒng)不能發(fā)揮作用；如無CAP存在，即使沒有阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合，操縱子仍無轉(zhuǎn)錄活性。單純?nèi)樘谴嬖跁r，細菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在時，細菌首先利用葡萄糖。,.,低半乳糖時,高半乳糖時,葡萄糖低cAMP濃度高,葡萄糖高cAMP濃度低,.,(二)乳糖操縱子的影響因子,1、lac操縱子的本底水平表達,乳糖,.,.,因為誘導物需要穿過細胞膜才能與阻遏物結(jié)合，而運轉(zhuǎn)誘導物需要透過酶。在非誘導狀態(tài)下有少量（1-5個mRNA分子）lacmRNA合成-本底水平組成型合成。,lac操縱子的本底水平表達,.,3、阻遏物lacI基因產(chǎn)物及功能,弱啟動子控制的組成型合成,.,.,.,.,.,4、葡萄糖對lac操縱子的影響,葡萄糖腺苷酸環(huán)化酶活性降低ATP無法轉(zhuǎn)變成cAMP不能形成CAP-cAMP復合蛋白RNA酶無法結(jié)合在DNA上結(jié)構(gòu)基因不表達。代謝物阻遏效應研究認為葡萄糖的某些降解產(chǎn)物抑制lacmRNA的合成，這種效應稱之為代謝物阻遏效應.,.,葡萄糖效應,.,5、cAMP與代謝物激活蛋白,.,.,.,.,CRP結(jié)合位點,cAMP-CRP復合物與啟動子區(qū)的結(jié)合lacmRNA合成起始所必需的，有利于形成穩(wěn)定的開放型啟動子-RNA聚合酶結(jié)構(gòu)。,.,.,四、lac操縱子DNA的調(diào)控區(qū)域P、O區(qū),控制區(qū),信息區(qū),-82+1,-7+28,.,五、lac操縱子中的其他問題,（一）A基因及其生理功能,-半乳糖苷酶,透過酶,乙?；D(zhuǎn)移酶,.,（二）lac基因產(chǎn)物數(shù)量上的比較,Z、Y、A三個基因產(chǎn)物的拷貝數(shù)比例為1：0.5：0.2,.,1、LacmRNA可能在翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質(zhì)鏈的翻譯。,原因：在翻譯水平上的調(diào)節(jié),.,2、LacmRNA分子內(nèi)部，A基因比Z基因更易受內(nèi)切酶作用發(fā)生降解，故Z基因的完整拷貝數(shù)要比A基因多。,原因：在翻譯水平上的調(diào)節(jié),降解,.,（三）操縱子的融合與基因工程,操縱子的融合：由較弱啟動子和強啟動子的基因形成的融合基因，可以通過強啟動子使弱啟動子的轉(zhuǎn)錄增強，增加蛋白表達量。,.,第三節(jié)色氨酸操縱子與負控阻遏系統(tǒng),.,可誘導調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)分解代謝的操縱子，同時受cAMP-CAP的活性調(diào)節(jié),可阻遏調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)合成代謝的操縱子,特殊代謝物調(diào)節(jié)基因活性的類型,.,.,一、trp操縱子的阻遏系統(tǒng),（一）trp操縱子的研究背景,酶合成阻遏的現(xiàn)象JacobandMonod的工作,（二）trp操縱子的結(jié)構(gòu),阻遏型操縱子,trpA,trpB,trpC,trpE,trpD,PtrpOtrp,前導序列a,Trp阻抑物色氨酸,激活,RNA,trpEtrpDtrpCtrpBtrpA,色氨酸合成所需的酶,trpR,.,酶阻遏的操縱子模型,輔阻遏蛋白無活性，不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因表達.,輔阻遏蛋白,.,（三）trp操縱子的阻遏調(diào)控機制,色氨酸操縱子主要參與調(diào)控一系列用于色氨酸合成代謝的酶蛋白的轉(zhuǎn)錄合成。當細胞內(nèi)缺乏色氨酸時，此操縱子開放，而當細胞內(nèi)合成的色氨酸過多時，此操縱子被關(guān)閉。色氨酸操縱子的調(diào)控機制與乳糖操縱子類似，但通常情況下，操縱子處于開放狀態(tài)，其輔阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合而阻遏轉(zhuǎn)錄。而當色氨酸合成過多時，色氨酸作為輔阻遏物與輔阻遏蛋白結(jié)合而形成阻遏蛋白，后者與操縱基因結(jié)合而使基因轉(zhuǎn)錄關(guān)閉。,Trp濃度高時,Trp濃度低時,mRNA,O,P,trpR,調(diào)節(jié)區(qū),結(jié)構(gòu)基因,RNA聚合酶,RNA聚合酶,色氨酸操縱子阻遏調(diào)節(jié),?,.,二、弱化子與前導肽,（一）弱化子,在操縱區(qū)與結(jié)構(gòu)基因之間的一段可以終止轉(zhuǎn)錄作用的核苷酸序列，當操縱子被阻遏時，RNA合成被終止，這段核苷酸起終止轉(zhuǎn)錄信號作用.,前導序列,RNA聚合酶,起調(diào)節(jié)作用的是某種氨酰-tRNA的濃度,.,（二）前導肽,前導肽,前導mRNA,RNA聚合酶,當色氨酸濃度低時,Trp合成酶系相關(guān)結(jié)構(gòu)基因被轉(zhuǎn)錄,序列3、4不能形成衰減子結(jié)構(gòu),（三）mRNA前導區(qū)的序列分析,前導區(qū)mRNA上有兩個連續(xù)的色氨酸密碼子；前導序列上有4個分別以1、2、3、4表示的片斷能以兩種不同的方式進行堿基配對，有時以12和34配對，有時只以23方式互補配對.,.,（四）轉(zhuǎn)錄的弱化作用,mRNA轉(zhuǎn)錄的終止是通過前導肽基因的翻譯來調(diào)節(jié)的。在前導肽基因中有兩個相鄰的色氨酸密碼子，故這個前導肽的翻譯必定對tRNATrp的濃度敏感。,.,.,（五）衰減子的生物學意義,活性阻遏物和非活性阻遏物的轉(zhuǎn)變可能較慢，而tRNA負載與否可能更為靈敏；氨基酸的主要用途是合成蛋白質(zhì)，因而以tRNA負載情況為標準來進行控制可能更為恰當.當細胞內(nèi)氨基酸高于某一水平時，可以實現(xiàn)完全的阻遏；而只有低于這一水平時，才需用衰減子這個調(diào)節(jié)系統(tǒng)來進行調(diào)節(jié)，阻遏蛋白和衰減子調(diào)節(jié)機制都是為了避免浪費，提高效率。,.,第四節(jié)其他操縱子（自學）第五節(jié)固氮基因調(diào)控（自學）,.,第六節(jié)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,.,一、翻譯起始的調(diào)控,1、SD序列對翻譯的影響SD序列：mRNA起始密碼前的一段富含嘌呤核苷酸的序列。(9-12bp)5-AGGAPuPuUUUPuPuAUG-3SD序列的順序及位置對翻譯的影響SD與AUG之間相距一般以4-10個核苷酸為佳，9個核苷酸最佳。,.,.,2、mRNA的二級結(jié)構(gòu)對翻譯起始的調(diào)控,SDsequence,AUG,10bases,UAAGGAGGU:complementarywith16srRNA,5,.