Nrf2缺陷損害小鼠食管黏膜的屏障功能ppt課件

Nrf2缺陷損害小鼠食管黏膜的屏障功能,冬威敏建,內(nèi)容,驗(yàn)證Nrf2參與食管黏膜的屏障功能，在抵抗胃食管反流病中發(fā)揮保護(hù)作用,目的,人食管樣品獲取、小鼠手術(shù)模型的建立；測(cè)定跨膜電阻；食管黏膜超微結(jié)構(gòu)變化的鏡檢；食管黏膜ATP含量測(cè)定；基因芯片、免疫組化、Western雜交和染色質(zhì)免疫共沉淀評(píng)價(jià)基因表達(dá),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),Nrf2缺陷通過(guò)破壞依賴能量的緊密連接而損害食管屏障功能,結(jié)論,食管黏膜屏障功能,黏膜屏障系統(tǒng)由3部分組成：上皮前屏障包括表面黏液層（作用低到可以忽略），不移動(dòng)水層和上皮細(xì)胞分泌的碳酸氫根離子；上皮屏障包括多層磷狀上皮細(xì)胞膜、細(xì)胞間連接復(fù)合物（緊密蛋白、糖蛋白機(jī)制和緩沖劑）、細(xì)胞內(nèi)緩沖劑、和膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；上皮后屏障包括血液流動(dòng)和酸堿平衡,細(xì)胞質(zhì),1,（Nfe2L2，紅細(xì)胞衍生核因子2樣蛋白2）屬于轉(zhuǎn)錄因子CNC家族，含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（bZip結(jié)構(gòu)），調(diào)節(jié)解毒和抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶的表達(dá)，是一種主要的細(xì)胞防御途徑,Nrf2蛋白,Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1，一種與胞漿肌動(dòng)蛋白結(jié)合的含624個(gè)氨基酸的多肽，是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要調(diào)控因子,細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種蛋白的表達(dá)、細(xì)胞分化和凋亡，同樣含有bZip結(jié)構(gòu)的。大Maf蛋白可以直接活化相應(yīng)基因，小Maf蛋白必須與其他具有轉(zhuǎn)錄活性的bZip蛋白結(jié)合，形成異源二聚體促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，或自身形成同源二聚體抑制基因轉(zhuǎn)錄,Keap1蛋白,小Maf蛋白,正常生理?xiàng)l件,氧化應(yīng)激或外源物質(zhì)刺激,細(xì)胞核,ARE,Nrf2信號(hào)通路在小鼠食管黏膜發(fā)育的成熟階段被激活。在這個(gè)階段，角質(zhì)化的復(fù)層磷狀上皮持續(xù)變厚，最后形成成人的食管黏膜。由于角質(zhì)化層是主要的抵抗物理應(yīng)激和化學(xué)損傷的保護(hù)層，末端分化角質(zhì)化細(xì)胞表達(dá)能夠通過(guò)淬滅活性氧來(lái)提供保護(hù)作用的蛋白，故推測(cè)Nrf2可能參與食管黏膜屏障功能，可能在胃食管反流病中發(fā)揮保護(hù)作用。,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),人類食管活檢樣品采樣人排除條件；10副正常人和非糜爛性胃食管反流病患者的活檢組織樣品；在胃鏡檢查期間從（食管）5cm近端到胃食管連接處獲得的。動(dòng)物手術(shù)模型的建立8周齡的野生型和Nrf2缺陷型C57BL/6J小鼠，每組5只。麻醉之后通過(guò)上中線切口進(jìn)行吻合手術(shù)。食管胃吻合手術(shù)的目的是消除括約肌功能，允許自由的胃液反流，建立胃反流模型；食管胃十二指腸吻合術(shù)加胃切除術(shù)是為了獲得十二指腸反流模型；食管胃十二指腸吻合術(shù)是為了獲得混合反流模型。吻合手術(shù)之后，清洗腹腔，用6-0絲線縫合腹腔。,十二指腸,食管胃吻合術(shù)：在食管遠(yuǎn)端和前胃處作3個(gè)越5mm切口，然后精確地黏膜對(duì)黏膜縱向縫合。,食管胃十二指腸吻合術(shù)：在食管和十二指腸上作2個(gè)5mm切口，然后精確的黏膜對(duì)黏膜縫合。,食管胃十二指腸吻合術(shù)加胃切除術(shù)：除了食管胃十二指腸吻合術(shù)，在胃食管連接處和幽門處結(jié)扎后切除胃部。,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),測(cè)跨膜電阻：食管黏膜組織浸入冰冷富氧的林格氏溶液，立即在迷你尤斯灌流室將黏膜一側(cè)朝上固定住。平衡30min后，在2h內(nèi)每15min，獲取一次PD（電勢(shì)差）、Isc(短路電流)和RT（總電阻）的基礎(chǔ)電子讀數(shù)。食管黏膜超微結(jié)構(gòu)變化的鏡檢：每組處死上3只鼠，切開食管黏膜組織，用二甲胂酸緩沖液固定，之后用醋酸鈾酰染色，以聚/床812樹脂包裹，超薄切片機(jī)切厚薄兩種切片，厚切片用甲苯胺藍(lán)硼砂染色后，光鏡下為薄切片尋找適合鏡檢區(qū)域，薄切片固定在銅柵格上，用醋酸鈾酰和雷諾檸檬酸鉛進(jìn)行雙染，透射電子顯微鏡鏡檢。用顯微生物學(xué)組件分析鏡檢照片上至少30個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞間隙和電子致密物質(zhì)密度。細(xì)胞間隙是測(cè)定兩個(gè)相鄰細(xì)胞細(xì)胞膜之間的區(qū)域。細(xì)胞間隙中的電子致密物質(zhì)密度用除以細(xì)胞間隙得到的平均灰度值計(jì)算。用方差分析比較各組之間的差異。,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),RNA分離：每組處死3只鼠，切開食管黏膜，用RNA組織提取試劑盒提取總RNA，凝膠電泳測(cè)質(zhì)量，分光光度計(jì)測(cè)濃度，生物分析儀測(cè)RNA完整性（RIN）。（RIN是RNA降解程度的指標(biāo)，RNA的RIN必須在7以上才適合做芯片分析）基因表達(dá)譜分析：文中的芯片分析就是基因表達(dá)譜分析，目的是分析對(duì)照組和模型組食管黏膜組織中各種差異表達(dá)的基因和基因簇及其豐度。（基因表達(dá)譜是通過(guò)構(gòu)建處于某一特定狀態(tài)下的細(xì)胞或組織的非偏性cDNA文庫(kù)，大規(guī)模cDNA測(cè)序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群體組成，從而描繪該特定細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)種類和豐度信息。一般需要純化mRNA做表達(dá)譜分析，本文沒有說(shuō)明有沒有提純mRNA)使用安捷倫雙通道小鼠444微陣列芯片，通過(guò)北卡羅萊納大學(xué)的芯片數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理以進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。獲取的芯片數(shù)據(jù)映射的基因標(biāo)記作為基因表達(dá)值。使用Excel進(jìn)行組間（正常組和模型組）基因芯片顯著性分析獲取差異表達(dá)基因（假陽(yáng)性平均數(shù)小于1）?；虼胤治觯ɑ蚣细患确治觯┮彩怯肊xcel進(jìn)行的。,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),Western雜交：目的獲得緊密連接蛋白4，緊密連接蛋白1，環(huán)氧化酶4和Nrf2在黏膜組織中的表達(dá)情況。處死小鼠切開食管黏膜；從食管黏膜、舌組織和肝臟組織中分離總蛋白；BCA蛋白試劑測(cè)蛋白濃度；蛋白樣品通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；轉(zhuǎn)移到PVDF聚偏二氟乙烯膜中；用脫脂乳粉封閉后，以兔子的抗緊密連接蛋白-1（Cldn1）的多克隆抗體，兔子的抗緊密連接蛋白-4(Cldn4)的多克隆抗體、小鼠的抗環(huán)氧化酶-4(Cox-4)的單克隆抗體或者兔子的抗Nrf2多克隆抗體（都經(jīng)特定緩沖液稀釋過(guò)）作為探針在4反應(yīng)過(guò)夜；將膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的小鼠或者兔子的第二抗體共培養(yǎng)；通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶化學(xué)發(fā)光底物利用X光顯影。為了驗(yàn)證等量上樣（黏膜組織），將印記剝離并使用小鼠的抗-肌動(dòng)蛋白(-Actin)的單克隆抗體進(jìn)行重新雜交。（-肌動(dòng)蛋白是在細(xì)胞的表達(dá)水平通常不會(huì)發(fā)生改變，被廣泛用于Western時(shí)上樣量是否一致的內(nèi)參，通過(guò)內(nèi)參證明你要檢測(cè)的蛋白表達(dá)水平的變化）,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),組織化學(xué)染色：黏膜組織按常規(guī)方法制作石蠟切片，按標(biāo)準(zhǔn)方法經(jīng)行HE染色，之后用顯微生物學(xué)組件檢測(cè)切片獲得角質(zhì)化層厚度。（細(xì)胞核紫藍(lán)色，胞漿及胞外基質(zhì)為紅色）免疫組織化學(xué)染色：目的是定位差異表達(dá)的Nrf2、8-OHdG、Cldn4和Cldn1等蛋白在組織中的表達(dá)位置。室溫下將脫蠟切片浸泡在包含0.3%過(guò)氧化氫的甲醇中15min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，之后進(jìn)行抗原修復(fù)。以兔子的抗-Nrf2多克隆抗體，兔子的抗血紅素加氧酶-1(HO1)多克隆抗體，兔子的抗緊密連接蛋白-1(Cldn1)多克隆抗體，小鼠的抗緊密連接蛋白-4(Cldn4)單克隆抗體或者小鼠抗8-羥基脫氧鳥苷單克隆抗體(8-OHdG)做為1抗在4反應(yīng)過(guò)夜。以抗角蛋白5（Keratin5）抗體作為免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照（陽(yáng)性對(duì)照），之后用PBS沖洗組織切片，并與過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的第二抗體在37共培養(yǎng)30分鐘。使用抗生蛋白鏈菌素-過(guò)氧化物酶反應(yīng)試劑盒以二氨基聯(lián)苯胺作為發(fā)色物檢測(cè)抗體復(fù)合物。（染色結(jié)果陰性藍(lán)色、陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)橘紅色，陽(yáng)性細(xì)胞核深橘紅色）計(jì)算并分析10個(gè)正常人和胃食管反流病人的樣品，及Nrf2缺陷型C57BL小鼠、胃部、十二指腸和混合反流模型小鼠的3個(gè)樣品的Nrf2陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比與核染色細(xì)胞占總陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分比通過(guò)3只野生型小鼠和3只Nrf2缺陷型小鼠測(cè)定。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以比較野生型和Nrf2缺陷型小鼠的8-羥基脫氧鳥苷的表達(dá)水平。,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),ATP含量測(cè)定：食管黏膜組織樣品稱重，并在三氯乙酸中均質(zhì)。用蒸餾水稀釋上清液，用一種生物熒光ATP試劑盒測(cè)定ATP。使用微孔板檢測(cè)儀（即酶標(biāo)儀）的ATP熒光模式測(cè)定3min內(nèi)的熒光信號(hào)，設(shè)定積分時(shí)間為1.0s，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用測(cè)得總量除以每個(gè)樣品的各自的重量得到ATP的濃度。染色質(zhì)免疫共沉淀:目的是確定推測(cè)的Cldn4、Cldn1是不是Nrf2的靶基因。通過(guò)錨定組合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（TFBS）聚類分析預(yù)測(cè)緊密連接蛋白4的5kb長(zhǎng)的5-上游DNA序列中的Nrf2結(jié)合位點(diǎn)。在緊密連接蛋白4的上游341bp347bp和423bp429bp片段處找到了“保守結(jié)合位點(diǎn)簇組合”（TGAGTCA）。使用EZ-ChIP試劑盒對(duì)三個(gè)平行樣進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀分析。使用對(duì)照組小鼠免疫球蛋白G（IgG）或者兔子的抗Nrf2多克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀操作。取2L免疫沉淀的DNA用下面的引物對(duì)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增：緊密連接蛋白4(5-GTTGTCCCCACCCGGTGAGCATC-3和5-GGCCAACAAAGGCGTTCAGAGGC-3;預(yù)測(cè)大小:168bp);醌氧化還原酶1（Nqo1）(5-GCAGTTTCTAAGAGCAGAACG-3和5-GTAGATTAGTCCTCACTCAGCCG-3;預(yù)測(cè)大小:176bp);P63（一種腫瘤抑制基因）(5-CAAATGTTGCTTGTCTGGTG-3和5GTCAGTCGAGTGCACAGTTT-3;預(yù)測(cè)大小:210bp)。作為一種知名的Nrf2靶基因，醌氧化還原酶1作為陽(yáng)性對(duì)照，P63（不是Nrf2靶基因）作為陰性對(duì)照。,結(jié)果與討論,正常人,胃食管反流病人,圖1：人體活檢樣品的組織化學(xué)免疫染色,Nrf2在正常人食管活檢組織中的表達(dá)（A、C、E）；Nrf2在胃食管反流病人活檢組織中的表達(dá)（B、D、F）；C、E為A的局部放大圖，D、F為B的局部放大圖。（染色結(jié)果陰性藍(lán)色、陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)橘紅色，陽(yáng)性細(xì)胞核深橘紅色）在正常人食管中，Nrf2蛋白主要存在于上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（C），而不是存在于基底細(xì)胞中（E）。但在胃食管反流病人的活檢樣品中（B），Nrf2在上皮細(xì)胞（D）和基底細(xì)胞（F）中過(guò)量表達(dá)，并易位到細(xì)胞核中。,結(jié)果與討論,正常小鼠食管黏膜中Nrf2蛋白出現(xiàn)在上皮細(xì)胞和基底旁細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，胃反流、十二指腸反流或混合反流4周后，在上皮細(xì)胞，基底旁細(xì)胞和基底細(xì)胞的細(xì)胞核中出現(xiàn)了Nrf2蛋白，上調(diào)顯著；十二指腸反流和混合反流模型中，血紅素加氧酶表達(dá)上調(diào)（Nrf2的一種標(biāo)記物）。,圖2：四周后小鼠模型樣品中Nrf2的組織化學(xué)免疫染色結(jié)果,非手術(shù)對(duì)照,十二指腸反流,胃反流,混合反流,人類活檢樣品：胃食管反流樣品中Nrf2蛋白表達(dá)上調(diào)顯著，在細(xì)胞核中表達(dá)上調(diào)顯著；血紅素加氧酶(Nrf2靶基因)表達(dá)上調(diào)顯著,小鼠模型樣品：反流模型樣品4周后，食管黏膜組織中Nrf2表達(dá)上調(diào)顯著；十二指腸、混合反流模型中血紅素加氧酶表達(dá)上調(diào),Nrf2在胃食管反流病中被激活,結(jié)果與討論,非手術(shù)對(duì)照,胃灌流,十二指腸灌流,混合灌流,圖3：野生型和Nrf2缺陷型小鼠食管黏膜跨膜電阻，兩表縱坐標(biāo)為電阻，上表橫坐標(biāo)為時(shí)間,跨膜電阻是黏膜屏障功能的指標(biāo)。Nrf2缺陷組的食管黏膜跨膜電阻在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著低于野生型小鼠，表明Nrf2在食管黏膜中發(fā)揮了抵抗離子轉(zhuǎn)運(yùn)的保護(hù)作用。反流手術(shù)4周后，野生型和Nrf2缺陷型小鼠都出現(xiàn)了食管跨膜電阻的顯著降低，尤其是在那些經(jīng)歷胃反流和十二指腸反流的小鼠中。胃反流和混合反流組中，Nrf2缺陷進(jìn)一步降低了食管的跨膜電阻，但十二指腸反流組卻沒因Nrf2進(jìn)一步降低跨膜電阻。這些數(shù)據(jù)揭示了在是否患胃食管反流病時(shí)，Nrf2都在食管抗性方面發(fā)揮保護(hù)作用。,Nrf2缺陷型,混合反流模型,圖4：透射電子顯微鏡下反流四周后小鼠食管黏膜基底細(xì)胞層中的超微結(jié)構(gòu)變化的形態(tài)學(xué)和量化（放大倍數(shù)4,400 x;尺寸欄sizebar=2m）,非手術(shù)對(duì)照組,胃反流模型,野生型,結(jié)果與討論,十二指腸反流模型,胃反流Nrf2缺陷組食管基底層中細(xì)胞間隙的增寬、線粒體數(shù)量的減少、可見細(xì)胞橋粒減少、基底細(xì)胞之間的電子致密物質(zhì)減少，表明Nrf2缺陷型小鼠的基底細(xì)胞之間的細(xì)胞間粘附力降低了；胃反流Nrf2缺陷型小鼠中從基底細(xì)胞延伸進(jìn)入基底膜的細(xì)胞過(guò)程也減少了，表明Nrf2缺陷型小鼠中，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的粘附力也降低了；胃、十二指腸、混合反流的野生型小鼠，黏膜基底層細(xì)胞間隙增寬；胃、十二指腸、混合反流的Nrf2缺陷小鼠顯示，Nrf2缺陷顯著加劇了黏膜超微結(jié)構(gòu)變化；定量分析表明Nrf2缺陷鼠的細(xì)胞間隙顯著增寬，電子致密物質(zhì)顯著減少，在胃反流模型中更加顯著。,結(jié)果與討論,食管黏膜組織化學(xué)染色（HE染色）結(jié)果：野生型和Nrf2缺陷型小鼠的食管黏膜沒有組織形態(tài)和厚度的明顯差異。,結(jié)果與討論,野生型和Nrf2缺陷型小鼠食管黏膜基因及基因簇表達(dá)的差異基因表達(dá)譜（芯片分析）結(jié)果基因表達(dá)差異：相比于野生型小鼠，15種已知的Nrf2靶基因（醛糖還原酶8Akr1b8,谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞基Gclc,谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶A3Gsta3,谷胱苷肽s轉(zhuǎn)移酶m1Gstm1,Gstm3,紅細(xì)胞衍生核因子2樣蛋白2Nfe2l2,醌氧化還原酶1Nqo1,胎球蛋白AAhsg,Ces1,Esd,Gstp1,Mgst1,Npn3,PpargandSelenbp2）在Nrf2缺陷型小鼠中的表達(dá)被下調(diào)了。由于這些基因都是已知的與應(yīng)激反應(yīng)和解毒作用相關(guān)基因，數(shù)據(jù)表明Nrf2在野生型小鼠的食管黏膜細(xì)胞中正?；罨蕴峁┑挚股響?yīng)激的保護(hù)作用。（在胃反流模型中，相比于野生型，Nrf2缺陷型小鼠中有7種已知的Nrf2靶基因（Nqo1,Gstm1,Akr1b8,Gstm3,Gclc,Pln,Gstp1）表達(dá)被下調(diào)了。在十二指腸反流模型中，5中已知的Nrf2靶基因表達(dá)被下調(diào)了（Nfe2l2,Nqo1,Gstm1,Gstm3,Ptgr1）。在混合反流模型中，有24種已知的Nrf2靶基因的表達(dá)被下調(diào)了（Gstm1,Gsta3,Gstm3,Nfe2l2,Nqo1,Gstm2,Blvrb,Hmox1,Entpd5,Cbr3,Ppp1r12b,Gclc,Mgst3,Gstm5,Txnrd1,Cat,Meis1,Ftl1,Sdpr,Selenbp2,Pparg,Gstp1,Esd,Mgst1)。）基因簇表達(dá)差異：相比于野生型小鼠，Nrf2缺陷型小鼠食管黏膜中有20個(gè)跟刺激/應(yīng)激有反應(yīng)和氧化還原酶活性相關(guān)的基因簇的表達(dá)被下調(diào)了；與Nrf2缺陷型小鼠基底細(xì)胞中線粒體數(shù)量降低相一致，在缺陷信小鼠的食管黏膜中有11個(gè)與線粒體合成相關(guān)的基因簇和32個(gè)與代謝和能量相關(guān)的基因簇表達(dá)被下調(diào)了,結(jié)果與討論,圖5：野生型和Nrf2缺陷型小鼠黏膜中8-OHdG的組織化學(xué)免疫染色結(jié)果（A、B），ATP濃度（C）和線粒體標(biāo)記蛋白COX-4的Western雜交結(jié)果（D）,8羥基脫氧鳥苷是一種DNA氧化損傷的標(biāo)記物。相比于野生型，8OHdG在Nrf2缺陷型小鼠食管黏膜細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)急劇升高（A，B，A，B