L05067林拓

項(xiàng)目類別項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)附件3 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)項(xiàng)目結(jié)題書項(xiàng)目名稱：蘿卜抗真菌蛋白R(shí)s-AFPs的分離純化研究申 請(qǐng) 人： 林拓 連曉鋒 林仍 所在院部： 生命科學(xué)學(xué)院 專業(yè)年級(jí)： 02級(jí) 生物技術(shù)（1）班 聯(lián)系電話：020-87344986 指導(dǎo)教師: 趙亞華 職稱 教授 立項(xiàng)日期： 二五 年 五 月 八 日 結(jié)題日期： 二六 年 四 月 六 日華南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)項(xiàng)目指導(dǎo)中心 填 表 說 明 一、 填寫結(jié)題報(bào)告書前，請(qǐng)先咨詢指導(dǎo)教師或有關(guān)專業(yè)教師。申請(qǐng)書的各項(xiàng)內(nèi)容要求實(shí)事求是，逐條認(rèn)真填寫。表達(dá)明確、嚴(yán)謹(jǐn)，一律要求用打印稿件。 二 、申請(qǐng)書為A4復(fù)印紙，于左側(cè)裝訂成冊(cè)。一式三份（至少一份原件），由指導(dǎo)教師和所在院（部）審查并簽署意見后報(bào)大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)項(xiàng)目指導(dǎo)中心。三 、一級(jí)標(biāo)題三號(hào)宋體加粗，用“一、二、三”標(biāo)示；二級(jí)標(biāo)題四號(hào)楷體加粗，用“（一）（二）（三）”標(biāo)示；三級(jí)標(biāo)題四號(hào)仿宋加粗，用“1、2、3”標(biāo)示；四級(jí)標(biāo)題四號(hào)仿宋，用“”標(biāo)示。示例：一、XXXX課題立項(xiàng)與研究的目的意義（一）XXXX課題立項(xiàng)與研究的目的的意義1、XXXX課題立項(xiàng)與研究的目的意義XXXX課題立項(xiàng)與研究的目的意義四、如表格不夠，可以加附頁(yè)。一、簡(jiǎn)表項(xiàng)目簡(jiǎn)況項(xiàng)目名稱蘿卜抗真菌蛋白R(shí)s-AFPs的分離純化研究項(xiàng)目類別A、文科類； B、理科類；申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)1500 元起止年月2005.5-2006.4項(xiàng)目組成員姓 名性別出生年月年級(jí)專業(yè)班級(jí)所在學(xué)院上學(xué)年綜合測(cè)評(píng)分項(xiàng)目中的分工本人簽字林拓男1984902級(jí)生物技術(shù)（1）班生命科學(xué)學(xué)院81.82凝膠層析、電泳蛋白測(cè)定等連曉鋒男1983802級(jí)生物技術(shù)（1）班生命科學(xué)學(xué)院73.97樣品前處理林仍男1983702級(jí)生物技術(shù)（1）班生命科學(xué)學(xué)院68.92生物活性測(cè)定指導(dǎo)教師情況姓名趙亞華性別女學(xué)位碩士職稱教授碩士生導(dǎo)師研究方向生物化學(xué)和分子生物學(xué)授課名稱分子生物學(xué) 生物化學(xué)項(xiàng)目簡(jiǎn)介 蘿卜種子中有兩種富含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)，能表現(xiàn)出有效的抗真菌活性。它們被命名為蘿卜抗真菌蛋白(Rs-AFPs)。這兩種蛋白質(zhì)在種子萌發(fā)過程中優(yōu)先釋放出來，有效地增強(qiáng)了種子周圍微環(huán)境的抗真菌能力。對(duì)Rs-AFPs粗提液進(jìn)一步純化后研究了它對(duì)熱帶作物部分病原真菌的抗性，證明它對(duì)植物絲狀病原真菌有廣譜的抑制作用，為進(jìn)一步克隆和表達(dá)，開發(fā)和利用這類抗真菌蛋白質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。二、項(xiàng)目研究的內(nèi)容與方法實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法：粗提液的制備 硫酸銨分級(jí)沉淀和透析除鹽 sephadex G-50凝膠過濾（每步完成后，測(cè)定總蛋白（蛋白濃度溶液總體積） 總活性比活性（總活性/總蛋白） 生物活性分析 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)一步分析性質(zhì)等（一）蘿卜種子Rs-AFPs粗提液的制備： 用蒸餾水浸泡蘿卜種子30min，用解剖刀沿種子外周半分線切開一個(gè)小口，用100mL0.05mol/L pH7.5 Tris-HCl 緩沖液室溫浸泡4h，種子用量占總體積的2/3，記錄所用種子的重量。收集上清液，3000rpm 4離心5min。收集上清，11000rpm 4 離心5min，離心兩次，再收集上清，得到粗提液。（二）粗提液的硫酸銨分級(jí)沉淀和透析除鹽。 把粗提液分步加入硫酸銨，分別達(dá)到硫酸銨濃度為030，3050，5070，7090。離心收集各濃度范圍下的沉淀，根據(jù)沉淀的量用適量的0.05mol/L pH7.5 Tris-HCl 緩沖液溶解沉淀。把溶解后得到的溶液裝入透析袋，用0.05mol/L pH7.2 Tris-HCl 進(jìn)行透析直到完全除去硫酸銨（可用AgCl溶液檢驗(yàn)）。（三）Sephadex G-50凝膠過濾 Sephadex G-50用蒸餾水煮沸 2溶脹 ,裝入2 60層析柱。用0.05mol/L Tris-HCl 緩沖液 (7.5 )平衡、洗脫 ,流速 0 .3/，每管收集 3,測(cè)定280。收集各個(gè)蛋白流出峰，分別測(cè)定抗菌活性。初步預(yù)定目標(biāo)：得到分子量為80000左右的RsAFPs多肽，電泳表現(xiàn)為一條帶。（四）生物活性分析：瓊脂糖擴(kuò)散測(cè)定抑菌圈大小病源菌：芭蕉炭疽菌。培養(yǎng)基：PDA。PDA培養(yǎng)基的配制：稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml煮沸半個(gè)小時(shí)，紗布過濾，再加10-20g葡萄糖和17-20g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，用200ml三角瓶分裝，蒸氣（121）滅菌20分鐘左右后取出。方法：用無菌水制備芭蕉炭疽菌孢子懸液，在PDA培養(yǎng)基未凝固之前倒入培養(yǎng)基中，然后倒入平板培養(yǎng)皿中。凝固后在培養(yǎng)基上打一小孔（具體直徑暫定為0.5cm）。把30uL待測(cè)液注入小孔中，4放置過夜，待液體被培養(yǎng)基完全吸收后，把培養(yǎng)基在28放置48h，量抑菌圈的大小。（五） 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定法：用考馬斯亮藍(lán)G-250法1. 蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制： 參考生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程（趙亞華主編，華南理工大學(xué)出版社，2000）。2. 目標(biāo)蛋白濃度測(cè)定：0.1mL提取液5mL考馬斯亮藍(lán)G-250，充分混合，放置2min后測(cè)A595，比照標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出蛋白濃度。（六）尿素SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（用于鑒定純度，分析組分的分子量）濃縮膠濃度：4T，3C 分離膠濃度：20T，6C 間隙膠:10T，3CT%（丙烯酰胺（g）雙丙烯酰胺（g）/ 總體積（mL）100C%雙丙烯酰胺（g）/ （丙烯酰胺（g）雙丙烯酰胺（g）100凝膠成分分離膠間隙膠濃縮膠凝膠貯液（mL）49.5T 3C-0.600.40凝膠貯液（mL）49.5T 6C3.76-分離膠buffer(mL)4.00-濃縮膠buffer(mL)1.001.24尿素(g)4.32-10過硫酸銨(uL)401020TEMED(uL)101.02.0三、項(xiàng)目研究過程與資料查閱情況幾種藥用植物內(nèi)生真菌抗真菌活性的初步研究 李桂玲 王建鋒 黃耀堅(jiān) 鄭忠輝 蘇文金 微生物學(xué)通報(bào) 2001 28 (6)抗真菌蛋白R(shí)s-AFPs生物學(xué)特性的研究 胡新文 郭建春 鄭學(xué)勤 熱帶作物學(xué)報(bào) 1998 19 (2) 抗真菌蛋白研究進(jìn)展 胡明 李曉宇 馬平 朱寶成 生物技術(shù)通報(bào) 2004（3） 藥用植物有效成分抗真菌研究進(jìn)展 駱志成 綜述 劉子文 審校 China J Lepr Skin Dis.dec 2001 17（4）植物抗真菌有效成分研究進(jìn)展 蔣繼宏 徐州師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) 1999 17（3）植物提取物的抗白色念珠菌活性 張勝春摘譯 國(guó)外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊(cè) 1998 20（5）四、項(xiàng)目成果完成形式和價(jià)值發(fā)表一篇學(xué)術(shù)論文，目前正在撰寫中。擬投中國(guó)生物工程雜志或其他相關(guān)的學(xué)術(shù)期刊。五、經(jīng)費(fèi)使用情況用于購(gòu)買實(shí)驗(yàn)研究所需的試驗(yàn)材料和各種試劑。（一）試驗(yàn)材料 芭蕉炭疽菌，蘿卜種子等（二）試驗(yàn)試劑 sephadex G-50，SDS, Tris等。六、申請(qǐng)人對(duì)該項(xiàng)目研究工作完成后的認(rèn)識(shí)總結(jié)掌握了從蘿卜種子制備Rs-AFPs粗提液的方法，熟悉了凝膠過濾等一系列基本實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，總蛋白，總活性的測(cè)定方法。學(xué)會(huì)運(yùn)用瓊脂糖擴(kuò)散法測(cè)定測(cè)定抗真菌蛋白的生物學(xué)活性，以及運(yùn)用尿素SDS聚丙烯酰胺凝膠電