乳酸菌的分離純化.doc

乳酸菌的分離與純化1.實驗?zāi)康?.實驗材料 2.1試驗設(shè)備天平、 牛角匙、 電爐、 pH試紙、 刻度搪瓷杯、 量筒、 漏斗 、漏斗架、 玻璃棒、 試管、 棉塞、 培養(yǎng)基、 吸管、 牛皮紙、 線繩 、標(biāo)簽、 500mL錐形瓶兩個、 250mL錐形瓶兩個、 試管20只、 500mL燒杯兩個、 250mL燒杯兩個、 100mL燒杯兩個、 酒精燈、 石棉網(wǎng)、 接種針（環(huán)）。 2.2實驗儀器 50L的高壓蒸汽滅菌鍋、 恒壓干熱滅菌箱 、 超鏡臺、 光學(xué)顯微鏡、 75%酒精棉、 冰箱。 2.3實驗藥品 新鮮酸奶、 脫脂奶粉或全脂奶粉、 蔗糖、 1.6%溴甲酚綠乙醇溶液、 酵母膏、 瓊 脂、 結(jié)晶紫染液、 盧戈氏碘液、 95%乙醇、 詩壇酸復(fù)紅染液。3.試驗方法及操作過程 3.1BCG牛乳培養(yǎng)基配方及滅菌（A）液：脫脂奶粉10克，水50ml，加入1.6%溴甲酚綠乙醇溶液1ml，80滅菌20min。（B）液：酵母膏1克，水50克，瓊脂2克，pH6.8，121滅菌2.min。 按照配方正確稱取所需藥品放于燒杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒攪勻，加熱溶解，用1N NaOH或1N HCl調(diào)pH，用pH試紙對照，加瓊脂溶化，加熱過程要不斷攪拌，可適當(dāng)補(bǔ)水。瓊脂完全溶解后倒入250mL的錐形瓶中，用紗布包扎好（注意不要污染紗布）再用牛皮紙包扎，貼上標(biāo)簽（必須用鉛筆寫），注明何種培養(yǎng)基。在高壓鍋中，在1kg/cm2壓力下維持30min。 3.2倒BCG培養(yǎng)基平板的方法 將滅好菌的A液和B液趁熱充分混合，點燃酒精燈對周圍的空氣進(jìn)行滅菌，并在酒精燈的附近用左手握著平板用拇指和小拇指打開一個小縫，趁熱將培養(yǎng)液倒如平板內(nèi)，倒入的量能使培養(yǎng)基剛要覆蓋平板底部，倒好后把平板平放到實驗臺，輕輕晃動是培養(yǎng)基形成一個平面，等培養(yǎng)基冷卻凝固后倒放并貼上標(biāo)簽。（注意：整個實驗要在酒精燈附近做，以保證培養(yǎng)基不染菌） 3.3脫脂乳試管的配制與滅菌 直接選用脫脂乳液或按脫脂奶粉10克與蔗糖5克，水95克（蔗糖與水的比例在1：10的范圍內(nèi)）的比例配制，裝量以試管的1/3為宜，115滅菌15min。 3.4乳酸菌的分離純化 取市場銷售的新鮮的酸奶，分別用接種針接入BCG牛培養(yǎng)基瓊脂平板上，40培養(yǎng)48h，如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步定為乳酸菌。選取乳酸菌典型菌落轉(zhuǎn)致脫脂乳試管中，40培養(yǎng)824h若牛乳出現(xiàn)凝固，無氣泡，顯酸性，涂片鏡檢細(xì)胞桿狀或鏈球狀，革蘭氏染色顯陽性，則可將其連續(xù)傳代3次，最終選擇出在36h能凝固的牛乳管，作菌種待用。 3.5乳酸發(fā)酵及檢查 發(fā)酵：觀察BCG培養(yǎng)基中乳酸菌菌落特征，選取長勢比較好的菌落無菌操作下將乳酸菌接種于裝有脫脂乳的試管中，4042靜止培養(yǎng)。 檢測：為了便于測定乳酸發(fā)酵情況，取脫脂乳試管中的溶液進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡檢查。革蘭氏陽性，無芽胞的球菌或桿菌可定為乳酸菌，記錄測定結(jié)果。3.6實驗具體過程兩周實驗具體過程521 上午 清洗儀器、 下午 配BCG牛乳培養(yǎng)基100ml、滅菌、倒平板 下午 乳酸菌、劃線分離、配脫脂乳試管100ml、滅菌、裝10支試管522 上午 配BCG牛乳培養(yǎng)基100ml、滅菌、倒平板 下午 等待滅菌523 上午 第一代接到脫脂乳試管、培養(yǎng)24h(21日平板仍染菌選相似菌落乳酸菌為第一代) 下午 做無菌水（20min滅菌121）、空錐形瓶滅菌裝清明酸奶劃線分離524 上午 配BCG牛乳培養(yǎng)基100ml、滅菌、倒平板（先B后A）、脫脂乳試管第二代劃線分離、脫脂乳試管做革蘭氏染色 下午 等待滅菌526 上午 配BCG牛乳培養(yǎng)基100ml、滅菌、倒平板（先B后A）、第三代劃線分離（光明由于染菌就此終斷光明的接種） 下午 等待滅菌527 上午 第三代接種到脫脂乳試管中 下午 配制BCG牛乳培養(yǎng)基100ml、滅菌、倒平板（先B后A）、528 上午 27日平板染菌，將剩余BCG牛乳培養(yǎng)基滅菌、倒平板、用脫脂乳試管做第四代劃線分離及革蘭氏染色 下午 等待滅菌529 上午 配酸奶培養(yǎng)基100ml兩瓶、滅菌、冷卻至不燙手為宜將第四代接種到酸奶培養(yǎng)基、待凝固 下午 寫實驗報告3.8.實驗分析 用提前滅好菌的燒杯取少量從市場上購買的（伊利、蒙牛）新鮮酸奶，用接種環(huán)將兩種酸奶接入已經(jīng)配好的BCG培養(yǎng)平板中（注意整個過程應(yīng)在無菌條件下操作），接好種后帖上標(biāo)簽進(jìn)行培養(yǎng)。 培養(yǎng)后的平板上大多都染上了雜菌，雜多為灰白色，只要個別平板長有淡黃色的乳酸菌菌落，且長勢不好。 第一代：選擇長勢較好的乳酸菌菌落，用接種針在無菌條件下將菌種接入兩只脫脂乳試管中，接好種后帖上標(biāo)簽進(jìn)行培養(yǎng)。 結(jié)果：兩只脫脂乳試管，一支凝固較好，顏色為乳白色略顯黃，表面有淡黃色上清液，一支凝固不好。 對試管中的酸奶進(jìn)行了革蘭氏染色，現(xiàn)象如下： 顯微鏡下：有3種菌，革蘭氏染色為紫色，有球菌、鏈球菌和少量細(xì)長的桿菌 第二代：選擇凝固較好的脫脂乳試管，用接種環(huán)在無菌條件下將菌種接入BCG培養(yǎng)平板中，接好種后帖上標(biāo)簽進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果：平板上沒有長出較好的菌落，且長有雜菌。雜菌的菌落為突起的水泡、灰白色，經(jīng)革蘭氏染色為紫色，為粗短的桿菌有莢膜。有的平板長有少量的乳酸菌，顏色為乳白色略顯黃。染菌的平板 第三代：選擇長勢較好的乳酸菌菌落，用接種針在無菌條件下將菌種接入剩余八只脫脂乳試管中，接好種后帖上標(biāo)簽進(jìn)行培養(yǎng)。 培養(yǎng)結(jié)果：八只脫脂乳試管中，有六只支凝固較好，顏色為乳白色略顯黃，表面有淡黃色上清液，兩支凝固不好。 對試管中的酸奶進(jìn)行了革蘭氏染色： 凝固效果較差成絮狀，顏色為乳白色，表面有淡黃色上清液。顯微鏡下：革蘭氏染色為紫色，含粗短和細(xì)短的桿菌，兩者含量都少。 凝固效果極好，白色，幾乎沒有液體。顯微鏡下：革蘭氏染色為紫色，含大量的細(xì)長桿菌、有芽孢的大球菌和梭形菌。 第四代：選擇凝固較好的脫脂乳試管，用接種環(huán)在無菌條件下將菌種接入BCG培養(yǎng)平板中，接好種后帖上標(biāo)簽進(jìn)行培養(yǎng)。 培養(yǎng)結(jié)果：平板上有的沒有長出較好的菌落，且長有雜菌，雜菌的菌落為突起的水泡、灰白色，有的沒有染菌，長出較好的菌落。長勢較好的菌落4.實驗結(jié)果及討論 4.1實驗結(jié)果 酸奶凝塊均勻，乳白色，細(xì)膩、絮狀、涌出氣泡，表面有少量的乳清(清水狀液體)，氣味清淡，有奶香。 4.2革蘭氏染色的注意事項 1.涂片不宜過厚，且應(yīng)將它涂均勻，如果太粘稠就用無菌水進(jìn)行稀釋，這樣更能觀察 細(xì)菌的形態(tài)。 2.染色過程中，染液要覆蓋菌體，用水沖洗時應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋影響染色結(jié)果，且水流不宜過大，以免菌體被沖走。 3.染色成敗關(guān)鍵是脫色的時間，時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌，脫色過度，革蘭氏陽性菌也會被染成革蘭氏陰性菌。另外，時間長短還與涂片薄厚、乙醇用量有關(guān)。染色不宜過深，這樣不利于觀察細(xì)菌的形態(tài)。 4.3雜菌污染途徑及預(yù)防1) 種子帶菌。原因主要有：培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底；菌種在移接過程中受污染；菌種在培養(yǎng)或保藏過程中受污染等。2) 空氣帶菌。由于實驗室的條件有限，只能用酒精燈進(jìn)行滅菌，滅菌不徹底等引入的細(xì)菌會引起染菌。3) 培養(yǎng)基和設(shè)備滅菌不徹底導(dǎo)致染菌。原因主要有：原料性狀影響滅菌效果；實罐滅菌時未能充分排出罐內(nèi)空氣；培養(yǎng)基連續(xù)滅菌時，蒸汽壓力波動大，培養(yǎng)基未達(dá)到滅菌溫度，導(dǎo)致滅菌不徹底而污染；設(shè)備、管道存在“死角”。4) 設(shè)備滲漏引起染菌。發(fā)酵設(shè)備、管道、閥門