肺結核痰檢質量控制培訓資料.doc

肺結核痰檢質量控制 萬建國各級各類實驗室職責：縣（區(qū)）級結核病實驗室在省、地（市）參比實驗室的指導下，制定本縣（市）結核病實驗室檢查的工作計劃。按照國家結核病實驗室質量保證體系的要求，做好本實驗室開展檢查項目的室內(nèi)質控工作，承擔同級間實驗室（縣級）第一復檢者盲法復檢工作，在所屬地（市）級實驗室的組織下，開展痰涂片鏡檢盲法復檢。按國家統(tǒng)一的標準化操作程序常規(guī)開展痰涂片鏡檢工作，根據(jù)實際情況有能力、具備條件的可以開展結核菌培養(yǎng)。接受上級實驗室的督導、現(xiàn)場評估和定期培訓。對轄區(qū)內(nèi)鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院查痰點的工作提供技術支持。鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點在我國結核病防治工作中發(fā)揮著重要作用，它可以方便結核病可疑癥狀者就醫(yī)，增加病人發(fā)現(xiàn)。各地應根據(jù)實際情況設立鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點。鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點應該按衛(wèi)生部要求開展工作，國家統(tǒng)一的標準化操作程序開展痰涂片鏡檢工作，并按規(guī)定送痰涂片至縣級進行復檢；接受上級實驗室的培訓、現(xiàn)場督導和技術指導。醫(yī)療機構實驗室醫(yī)療機構結核病實驗室在相應級別臨床檢驗中心和上級結核病實驗室的技術指導下，開展質量有保證的結核病實驗室檢查工作，嚴格按照相關各項標準化、規(guī)范化操作程序進行實驗室相關活動，并接受結核病實驗室的質量控制。涂片鏡檢實驗室基本要求：實驗室應有實驗室分區(qū)（涂片染色區(qū)域和讀片鏡檢區(qū)域），布局應該符合生物安全二級（BSL-2）的要求；實驗室應在靠近出口處設置洗手池；實驗室的墻壁、天花板和地面應平整、易清潔、不滲水、耐化學品和消毒劑的腐蝕，地面應防滑；實驗操作臺面應能防水，耐腐蝕、耐熱；實驗室中的廚柜和實驗臺應牢固，廚柜、實驗臺彼此之間應保持一定距離，以便于清潔；對于實驗室中可開啟的窗戶，應安裝紗窗；實驗室內(nèi)應保證工作照明，避免不必要的反光和強光；應有適當?shù)南驹O備；在實驗室門口處應設掛衣裝置，個人便裝與實驗室工作服分開放置；10、實驗室應該裝備開展痰涂片檢查所需要的儀器和設備。檢查對象及要求：痰涂片檢查 （一）痰盒推薦使用螺旋蓋、可密封、廣口的塑料盒收集痰標本，參考規(guī)格：直徑4厘米，高度2厘米。醫(yī)務人員在容器上應注明患者姓名、編號（門診序號或登記號）、檢查項目、痰標本序號1、2、3（1當日即時痰，2夜間痰，3次日晨痰），然后交給患者。（二）標本采集1、時間根據(jù)痰標本采集的時間，可將標本分為三類：即時痰：就診時深呼吸后咳出的痰液；晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2口、第3口痰液；夜間痰：送痰前一日，患者晚間咳出的痰液；2、痰采集方法宣教對疑似肺結核病者，臨床醫(yī)護人員應通過解釋，使其充分了解標本質量對相應檢查項目的重要性，示范并指導其掌握從肺部深處咳痰的方法；如患者識字，可提供宣教材料。3、地點由于當患者咳嗽、咳痰時，易于產(chǎn)生含有結核菌的氣溶膠，感染周邊人群的機率較高，故采集痰標本時應在遠離人群的開放空間進行，或在通風良好的室內(nèi)進行?；颊吡羧〉奶禈吮荆瑧蓹z驗人員或經(jīng)培訓的專人目視檢查標本質量（特別是用于初次診斷的痰標本）。合格的痰標本應是患者深呼吸后，由肺部深處咳出的分泌物，標本量一般在35 ml。干酪痰：標本外觀以黃色（或奶酪色）、膿樣、團塊狀的肺部分泌物為主，粘度較粘液痰低，制片時較易涂抹；涂片染色后鏡檢，可發(fā)現(xiàn)大量膿性炎癥細胞、肺上皮脫落細胞。由于此類標本是由肺部深處咳出，對肺結核的診斷最有價值，故AFB的檢出率較高。血痰：此類標本是因粘液痰或干酪痰標本中混有血液而形成，顏色為褐色或深褐色、鮮紅色或伴有血絲；涂片染色后鏡檢除能夠觀察到粘液痰或干酪痰的細胞特征外，含新鮮血液的標本中可見到被染色的血細胞。由于含血標本易干擾AFB鏡檢的結果，故在制片時應盡量避免挑取含血標本。粘液痰：標本外觀以白色、粘稠度較高的肺部和支氣管分泌物為主，制片時需仔細涂抹；涂片染色后鏡檢時，鏡下可見支氣管內(nèi)膜纖毛柱狀上皮細胞（細胞較長且形態(tài)不規(guī)則、細胞核和細胞質著色均較深，細胞一端可見著色較淺的纖毛），伴有少量肺上皮脫落細胞（多數(shù)為圓形、細胞核較小且著色較細胞質深，核質比大于 1:3）、膿性炎癥細胞（卵圓形、細胞核占細胞比例較大且著色較深，核質比低于 1:1）、口腔脫落細胞及口腔寄生菌。此類標本的AFB檢出率較唾液高。唾液：目視觀察標本整體外觀，以透明或半透明水樣、粘度較低的口腔分泌物為主，標本中有時伴有氣泡；涂片染色鏡檢時，鏡下可見少量口腔上皮脫落細胞（形態(tài)不規(guī)則、細胞核著色較細胞質深，核質比接近或大于 1:2）和口腔內(nèi)寄生菌，有時可見食物殘渣。由于此類標本進行AFB檢查時的檢出率很低，用于對患者確定診斷時是不合格的標本。合格的痰標本一般為干酪痰、褐色血痰或含少量新鮮血液的血痰、粘液痰。痰標本不合格時，應進一步指導并要求病人重新送檢。進行細菌學檢查時應在登記本和檢驗報告單上注明標本性狀，以供分析結果時參考。直接涂片檢查檢查對象根據(jù)檢查目的分為兩類：確定診斷，發(fā)現(xiàn)傳染源；療效評價，作為確定化療方案和治療效果評價的指標。（1）確定診斷：凡因結核病癥狀求診及轉診的可疑肺結核患者，均應進行痰涂片檢查。確定診斷的涂片檢查應采集3個合格的痰標本。就診當時在門診留一份“即時痰”標本，同時給患者2個痰盒，囑患者留取“夜間痰”和“晨痰”，于次日交驗。（2）療效評價：凡已確診、登記、治療的肺結核患者，在化療期間按照規(guī)定應定期查痰： 初治涂陽患者在療程強化期末、繼續(xù)期滿3個月和繼續(xù)期結束時（一般為治療后的第2、5和6個月）；復治涂陽患者在療程強化期末、繼續(xù)期滿3個月和繼續(xù)期結束時（一般為治療后的第2、5和8個月）分別收集一份晨痰和即時痰進行涂片檢查。 初、復治涂陽患者在療程強化期結束時，痰菌仍為陽性者，應在1個月時增加痰涂片檢查一次；若復治涂陽患者治療滿3個月時痰菌仍陽性，應在治療滿5個月增加痰涂片檢查一次。 確診、登記的涂陰肺結核患者，即使患者因故未接受治療，也應在登記后滿2和6個月時進行痰菌檢查（一）玻片的制備1、用于抗酸菌（AFB）檢查的載玻片要求（1）一張載玻片上只能涂抹一份痰標本。（2）每張載玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于AFB涂片檢查。（3）應使用以95%乙醇擦拭（或浸泡）脫脂，經(jīng)干燥、清潔、無油污、無劃痕的新載玻片制備涂片，在玻片背面一端的1/3處注明實驗室序號及標本序號（如使用的載玻片一端無磨砂面，必須使用玻璃刻刀注明編號；如使用的載玻片一端有磨砂面，可使用2B鉛筆在磨砂面上直接書寫）。2、制備涂片（1）小心打開承載痰標本的容器，防止產(chǎn)生氣溶膠或使標本外溢。（2）仔細觀察標本，使用折斷的竹簽茬端，挑取痰標本中干酪樣、膿樣或可疑部分約0.050.1 ml，于玻片正面右側2/3處，均勻涂抹成1020 mm的卵圓形痰膜。痰膜朝上靜置自然干燥后（一般約需要30分鐘）進行染色鏡檢。（3）涂抹完畢后的痰標本，在結果報告前應暫時保留。（4）為了保證檢驗人員的安全，嚴禁在涂抹痰標本的同時，對載玻片進行加熱。（二）染色1、萋爾尼爾遜染色法（Ziehl-Neelson），簡稱萋尼氏染色法（Z-N）（1）試劑的配制： 石碳酸復紅染色液： 堿性復紅儲存液：堿性復紅8g加95%酒精至100 ml，充分振蕩使復紅溶解。5%石碳酸水溶液：40-50水浴加熱石碳酸使之融解，取5 g液態(tài)石碳酸溶于90ml熱蒸餾水中，待溶液冷卻至室溫時，補充蒸餾水至100 ml。石碳酸復紅工作液：10 ml經(jīng)定性濾紙過濾的堿性復紅儲存液與90 ml 5%石碳酸水溶液充分振蕩、混合均勻后，使用定性濾紙過濾。 5%鹽酸乙醇脫色液：5 ml濃鹽酸（35%）與95 ml95%乙醇混合。 亞甲蘭復染液：儲存液：0.3 g亞甲蘭溶于50 ml95%乙醇中，完全溶解后加蒸餾水至終體積100ml。亞甲蘭復染液：以蒸餾水3倍稀釋0.3%亞甲蘭儲存液，經(jīng)充分振蕩、混合均勻后，亞甲蘭的終濃度為0.1%。使用定性濾紙過濾，即得亞甲蘭復染液。（2）染色步驟： 涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片間距保持10 mm 以上的距離；火焰固定（在5秒鐘內(nèi)將玻片置于火焰上烤4次）。 滴加石碳酸復紅染液，蓋滿痰膜，火焰加熱至出現(xiàn)蒸汽后，脫離火焰，保持染色5分鐘。染色期間應始終保持痰膜被染色液覆蓋，必要時可續(xù)加染色液。加溫時勿使染色液沸騰。 流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去染色液，瀝去標本上剩余的水。 自痰膜上端外緣滴加脫色劑布滿痰膜，脫色3分鐘；如有必要，需流水洗去脫色液后，再次脫色至痰膜無可視紅色為止。 流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去脫色液，瀝去玻片上剩余的水。 滴加亞甲藍復染液，染色30秒鐘。 流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去復染液，然后瀝去標本上剩余的水。待玻片干燥后鏡檢。 一張染色合格的玻片，由于被亞甲蘭染色而呈亮藍色。將染色后的玻片放置在報紙上，如果透過痰膜不能分辨報紙上的文字，則表明該玻片涂抹過厚。2、熒光染色法AFB采用熒光染色法鏡檢，只限于那些每日工作量較大（日讀片數(shù)超過25張）、具備熒光顯微鏡、且鏡檢人員閱讀熒光染色玻片具有豐富經(jīng)驗的實驗室開展。（1）試劑配制： 染色劑（金胺O染液）：金胺O1g石碳酸50ml乙醇100ml補蒸餾水至1000ml 金胺O（auramine O，分子式為C17H21N3HCl）：用于AFB染色時必須使用最低染料含量約80的生物染色劑。 脫色劑：3%鹽酸乙醇（配制方法參照萋尼氏染色）。 復染劑：0.5%高錳酸鉀水溶液。（2）染色步驟： 玻片經(jīng)火焰固定后,滴加染色劑蓋滿玻片，染色30分鐘；流水自玻片一端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩余的水。 自痰膜上端外緣滴加脫色劑，布滿痰膜，脫色3分鐘或至無色, 流水自玻片一端輕洗，洗去脫色劑。 滴加復染劑復染2分鐘，瀝去復染液，自然干燥，準備鏡檢。（三）鏡檢1、萋尼氏染色玻片鏡檢使用10目鏡雙目顯微鏡讀片。取染色完畢且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片臺上并以卡尺固定。首先使用40物鏡，轉動卡尺移動玻片至痰膜左端，將光線調(diào)節(jié)至適當亮度，調(diào)節(jié)焦距至可見細胞形態(tài)；移開40物鏡，在玻片上滴12滴鏡油，使用100油鏡進行細致觀察。在淡藍色背景下，抗酸菌呈紅色；其它細菌和細胞呈藍色。為防止AFB的交叉污染，嚴禁油鏡鏡頭直接接觸玻片上的痰膜。由于香柏油（cedarwood immersion oil）能夠溶解復紅染料，使萋尼氏染色退色，并且容易干燥凝結，對油鏡頭造成損害；故推薦使用專門用于100油鏡、不干燥、不變硬的鏡油（immersion oil）。讀片時，首先應從左向右觀察相鄰的視野；當玻片移動至痰膜一端時，縱向向下轉換一個視野，然后從右向左觀察，依此類推。通常20 mm的痰膜，使用100油鏡，每行可觀察約100個視野。仔細觀察完300個視野，一般需要5分鐘以上；每個工作日，一位鏡檢人員的玻片閱讀量不要超過25張，且連續(xù)閱讀1012張玻片后，應休息20分鐘左右。2、熒光染色玻片鏡檢玻片放置在玻片臺上并以卡尺固定后，首先以10目鏡、20物鏡進行鏡檢，發(fā)現(xiàn)疑為AFB的桿狀熒光顆粒時，使用40物鏡確認。在暗背景下，抗酸菌發(fā)出桿狀熒光。相應波長光線激發(fā)染料產(chǎn)生可視光的能力，隨著時間而衰減。故熒光染色后的涂片應于當日鏡檢；如果玻片數(shù)量過多，應將涂片放置于4避光保存，次日必須完成鏡檢。（四）結果報告1、萋尼氏染色鏡檢結果分級報告標準抗酸桿菌陰性（）：連續(xù)觀察300個不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。報告抗酸桿菌菌數(shù)：12條抗酸桿菌/300視野?？顾釛U菌陽性（1）：39條抗酸桿菌/100視野?？顾釛U菌陽性（2）：19條抗酸桿菌/10視野?？顾釛U菌陽性（3）：19條抗酸桿菌/每視野?？顾釛U菌陽性（4）：10條抗酸桿菌/每視野。2、熒光染色鏡檢結果分級報告標準熒光染色抗酸桿菌陰性 （-）：0條/50視野。熒光染色抗酸桿菌陽性（報告抗酸菌數(shù)）：13條/50視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（1+）：10