生物化學(xué)--第十一章 DNA復(fù)制RNA轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)錄.ppt

第二節(jié)轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄 transcription 以dna為模板 根據(jù)堿基配對的原則合成與dna互補(bǔ)的rna的過程 1 相同點(diǎn) 都需要模板都分為三階段合成方向都是5 3 都形成磷酸二酯鍵 一 轉(zhuǎn)錄與dna復(fù)制的比較 2 轉(zhuǎn)錄dna復(fù)制的不同點(diǎn) 底物不同轉(zhuǎn)錄不需引物 不對稱轉(zhuǎn)錄發(fā)生時(shí)間 空間等有選擇性 二 dna指導(dǎo)下rna聚合酶 一 rna聚合酶特性 四種核苷三磷酸 atp gtp ctp utp 為底物 模板以雙鏈狀態(tài)下活性最大 聚合酶無校對功能 無需引物 方向5 3 需要模板 二 酶的分類與構(gòu)成 大腸桿菌的rna聚合酶 大腸桿菌rna聚合酶各亞基的功能 酶類 分布 產(chǎn)物 鵝膏蕈堿對酶的作用 分子量 反應(yīng)條件 i 核仁 核質(zhì) 核質(zhì) rrna5 8srrna18srrna28srrna mrnasnrna trna5srrna 不抑制 低濃度抑制 高濃度抑制 500000 700000 700000 低離子強(qiáng)度 要求mg2 或mn2 高離子強(qiáng)度 高mn2 濃度 真核細(xì)胞的rna聚合酶 同樣 真核rna聚合酶無校對功能 三 大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄 一 相關(guān)概念1 鏈的名稱2 轉(zhuǎn)錄單位 一個(gè)轉(zhuǎn)錄事件從起始到終止的dna區(qū)間稱一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位 即從啟動子到終止子之間的dna序列 3 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) 指第一個(gè)核苷酸摻入的dna上的位點(diǎn) 1 4 啟動子 rna多聚酶能識別 結(jié)合 開始轉(zhuǎn)錄的一段dna序列 大腸桿菌rna聚合酶的啟動子 轉(zhuǎn)錄起始位 pribnowbox 35區(qū) 10區(qū) 5 終止子 terminator 終止子 提供轉(zhuǎn)錄終子信號的dna序列稱為終止子 有兩類 依賴r 因子的終止子和不依賴r 因子的終止子 終止因子 協(xié)助rna聚合酶識別終止信號的輔助因子 或蛋白質(zhì) 通讀 rna聚合酶越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象稱為通讀 通讀是由于終止子被特異性的因子抑制產(chǎn)生的 抗終止因子 引起抗終止作用的蛋白質(zhì)稱為抗終止因子 二 轉(zhuǎn)錄過程1 起始 利用足跡法 footprint 和dna測序法可以確定啟動子的序列結(jié)構(gòu) 足跡法示意圖 s70forstandardpromoters s32forheat shockpromoters s54fornitrogen starvationpromoters standardheat shocknitrogenstarvation 大腸桿菌不同的 因子識別不同啟動子 2 延長 因子循環(huán) 3 終止不依賴r 因子的終止子 依賴r 因子的終止子的終止反應(yīng) r 因子 含六聚體的寡聚蛋白 具有依賴rna的ntp酶活性 它結(jié)合于新生rna上 借助與水解ntp產(chǎn)生能量推動rna聚合酶向前移動 當(dāng)酶遭遇終止子時(shí)暫停前進(jìn) r 因子追上酶 與酶相互作用釋放rna 還具有rna dna解螺旋酶活性 調(diào)節(jié)序列 起始子 gcbox caatbox 真核生物編碼蛋白質(zhì)的基因的啟動子的一般特性 真核rna聚合酶 的啟動子 真核rna聚合酶 需要許多其它蛋白因子 真核rna聚合酶 和轉(zhuǎn)錄因子在啟動子上的裝配 三 rna生物合成的抑制劑 之一 模板抑制劑 烷化劑 使dna發(fā)生烷基化 發(fā)生在g n7 a n1 n3n7 c n1 易引起嘌呤的水解 在dna上留下空隙干擾復(fù)制或轉(zhuǎn)錄 或引起堿基錯配 放線菌素d 放線菌素d與dna形成非共價(jià)的復(fù)合物 抑制其模板功能 低濃度抑制轉(zhuǎn)錄 較高濃度抑制復(fù)制 具有類似作用的還有色霉素a3 橄欖霉素 光神霉素 嵌入染料 可插入雙鏈dna分子相鄰的堿基對之間 一般具有芳香族發(fā)色團(tuán) 溴化乙錠 eb 是一種高靈敏的熒光試劑 常用來檢測dna和rna 與dna結(jié)合后抑制其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄 放線菌素d 模板抑制劑 放線菌素d的結(jié)構(gòu)與作用 rna生物合成的抑制劑 之二 嘌呤和嘧啶類似物 人工合成的堿基類似物能夠抑制和干擾核酸的合成 如 sh 作為代謝拮抗物抑制合成酶類或直接摻到核酸分子中 形成異常rna或dna f rna聚合酶抑制劑 之三 rna聚合酶抑制劑 2 利鏈霉素 與細(xì)菌rna聚合酶 亞基結(jié)合 抑制轉(zhuǎn)錄過程中rna鏈的延長反應(yīng) 3 鵝膏蕈堿 抑制真核生物rna聚合酶活性 1 利福霉素 抑制細(xì)菌rna聚合酶活性 利福平可以高效抑制結(jié)核桿菌 殺死麻瘋桿菌 在體外有抗病毒作用 第三節(jié)rna轉(zhuǎn)錄后的加工 原核生物rna的加工真核生物rna的加工 轉(zhuǎn)錄后加工 指在細(xì)胞內(nèi) 由rna聚合酶合成的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需要經(jīng)過一系列的變化才能轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓膔na分子的過程 一 rrna前體的加工 甲基化 6500個(gè)核苷酸 核酸內(nèi)切酶rnase p 核酸外切酶 一 原核生物rna的加工 二 trna的加工 三 真核生物rna的一般加工 轉(zhuǎn)錄初始產(chǎn)物 hnrna 一 mrna前體的加工 真核mrna前體的加工步驟 1 hnrna被剪接 把內(nèi)含子 dna上非編碼序列 轉(zhuǎn)錄序列剪掉 把外顯子 dna上的編碼序列 轉(zhuǎn)錄序列 拼接上 真核生物一般為不連續(xù)基因 加工包括 4 分子內(nèi)部的核苷酸甲基化修飾 3 5 端連接 帽子 結(jié)構(gòu) m7g5 ppp5 nmpnp 2 3 端添加polya 尾巴 真核mrna的5 帽子 加工 多聚腺苷酸聚合酶 真核生物mrna3 尾巴 的加工 內(nèi)切酶 加尾信號 因發(fā)現(xiàn)斷裂基因而獲1993年諾貝爾生理學(xué)獎的richardjrobertandphllipasharp 二 真核rrna前體的加工 三 真核trna前體的加工 四 rna的拼接機(jī)理 大多真核生物基因是斷裂基因 即含有內(nèi)含子 斷裂基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物必需通過拼接 去除插入部分 內(nèi)含子 intron 使編碼區(qū) 外顯子 exon 成為連續(xù)序列 這是基因表達(dá)的重要環(huán)節(jié) 內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)多種多樣 拼接機(jī)制也是多種多樣的 rna的拼接方式 類型 內(nèi)含子的自我拼接 核酶的作用 類型 內(nèi)含子的自我拼接 核酶的作用 hnrna的拼接 核內(nèi)小rna snrna 與蛋白質(zhì)組成核糖核蛋白體 snrnp 的作用 類型 內(nèi)含子的切除 核trna的拼接 酶促拼接 核酶的發(fā)現(xiàn) 1981年cecht在研究四膜蟲 tetrahymenathermophila rrna前體拼接過程中發(fā)現(xiàn) 此類的拼接無需蛋白質(zhì)的酶參與作用 它可自我催化完成 cech稱具有催化功能的rna為核酶 ribozyme 1989年cecht和altmans共同獲諾貝爾化學(xué)獎 altmans的貢獻(xiàn)是發(fā)現(xiàn)rnasep中的m1rna單獨(dú)也具有催化功能 核酶的發(fā)現(xiàn)改變了酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念 被認(rèn)為是近二十年來生物化學(xué)領(lǐng)域中最令人鼓舞的成就之一 them1rnainribonucleasepiscatalytic theintroninthepre rrnaoftetrahemenaisself spliced 因發(fā)現(xiàn)核酶而獲諾貝爾獎的兩位科學(xué)家 1 類型 內(nèi)含子的自我拼接 借助與鳥苷酸或鳥苷的作用 內(nèi)含子自我催化 通過三次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)完成拼接 切下l19rna l19rna或l19ivs 含395個(gè)核苷酸 2 類型 內(nèi)含子的自我拼接 也是由內(nèi)含子自我催化完成 但轉(zhuǎn)酯反應(yīng)無鳥苷的參與 兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)后內(nèi)含子形成套索結(jié)構(gòu)而切下 細(xì)胞內(nèi)存在許多種類的小分子rna 其大小在100 300個(gè)核苷酸 稱為核內(nèi)小rna smallnuclearrna snrna u系列的snrna中尿嘧啶含量較高 因而得名 這些小rna與多種蛋白質(zhì)結(jié)合形成snrnp參與核內(nèi)rna的加工 u1 u2 u4 u5 u6結(jié)合形成的snrnp參與hnrna的拼接 u3snrnp參與rrna的拼接 u2hnrna含與分支處互補(bǔ)序列 u1hnrna含與內(nèi)含子3 端互補(bǔ)序列 核酸內(nèi)切酶 環(huán)磷酸二酯酶 激酶 激酶 連接酶 磷酸酯酶 4 核內(nèi)trna前體的酶促拼接 內(nèi)含子 的切除 rna拼接的意義 1 rna的拼接是生物機(jī)體在進(jìn)化歷史中形成的 是進(jìn)化的結(jié)果 2 rna的拼接是基因表達(dá)的重要環(huán)節(jié) rna轉(zhuǎn)錄后通過拼接而抽取有用信息 形成連續(xù)的編碼序列 并可通過選擇性拼接而控制生物機(jī)體生長發(fā)育 因此 這是真核生物遺傳信息精確調(diào)節(jié)和控制的方式之一 rna拼接現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn) 給生物學(xué)家一系列令人困惑的疑問 為什么生物機(jī)體要先轉(zhuǎn)錄內(nèi)含子 然后將其切除 rna合成后再拼接是一個(gè)非常耗能的過程 對細(xì)胞其收益是什么 內(nèi)含子由何而來 內(nèi)含子有無生物功能 圍繞以上問題 提出一些看法或觀點(diǎn) 但爭議很大 目前尚無定論 5 內(nèi)含子和外顯子是相對的 有些內(nèi)含子具有編碼序列 能產(chǎn)生蛋白質(zhì)和功能rna 如 型內(nèi)含子能產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶 型內(nèi)含子能產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶和逆轉(zhuǎn)錄酶 以幫助內(nèi)含子的轉(zhuǎn)移 rna拼接的意義 3 基因由模塊裝配而成 模塊間的間隔序列也就演變成內(nèi)含子 因此外顯子和內(nèi)含子有著同樣的古老歷史 而現(xiàn)今存在的幾類內(nèi)含子也各自有其起源和進(jìn)化歷史 從它們的拼接方式和分布可以大致推測其起源時(shí)間 4 rna的拼接主要存在于真核生物 原核生物極為少見 但并非完全沒有 一種合理的解釋是原核生物為適應(yīng)快速生長的需要 在進(jìn)化中已將內(nèi)含子丟掉 事實(shí)上 快速生長的單細(xì)胞如酵母 其編碼的基因也幾乎沒有內(nèi)含子 然而內(nèi)含子的存在和拼接作用對生物機(jī)體的進(jìn)化十分重要 不同rna拼接方式導(dǎo)致一個(gè)基因多種產(chǎn)物 降鈣素 甲狀腺 腦 降鈣素基因相關(guān)肽 返回 真核生物復(fù)雜轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的兩種不同的剪接方式 第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄 reversetranscription 1970年temin等和baltimore分別從勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病rna病毒中分離出逆轉(zhuǎn)錄酶 迄今已知的致癌rna病毒都含有逆轉(zhuǎn)錄酶 定義 以rna為模板 按照rna中的核苷酸順序合成dna的過程稱為逆轉(zhuǎn)錄 由逆轉(zhuǎn)錄酶催化進(jìn)行 用特異抑制物 放線菌素d 能抑制致癌rna病毒的復(fù)制 而對一般rna病毒的復(fù)制無影響 已知放線菌素d專門抑制以dna為模板的反應(yīng) 可見致癌rna病毒的復(fù)制過程必然涉及到dna 所以temin于1964年提出前病毒的假說 以前病毒形式整合到宿主細(xì)胞dna中而使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化單鏈病毒rnarna dna雜交分子雙鏈dna 前病毒 逆轉(zhuǎn)錄酶也和dna聚合酶一樣 沿5 3 方向合成dna 底物為四種dntp 并要求短鏈rna作引物 逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶 兼有3種酶的活性 rna指導(dǎo)的dna聚合酶活性 dna指導(dǎo)的dna聚合酶活性 核糖核酸酶h的活性 專一水解rna dna雜交分子中的rna 可沿5 3 方向起核酸外切酶的作用 無校對功能 錯誤率高 易產(chǎn)生變異 致癌rna病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程 逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活史 不能把 中心法則 絕對化 遺傳信息也可以從rna傳遞到dna 促進(jìn)了分子生物學(xué) 生物化學(xué)和病毒學(xué)的研究 為腫瘤的防治提供了新的線索 目前逆轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)成為研究這些學(xué)科的工具 1983年 發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒 humanimmunedeficiencevirus hiv 感染t淋巴細(xì)胞后即殺死細(xì)胞 造成宿主機(jī)體免疫系統(tǒng)損傷 引起艾滋病 acquiredimmunodeficiencysyndrome aids 該病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒 逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)現(xiàn)的理論與實(shí)踐意義 因發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒的遺傳物質(zhì)而獲1975年諾貝爾獎的三位科學(xué)家 1 病毒rna可充當(dāng)mrna 利用寄主中的核糖體合成外殼蛋白和復(fù)制酶的 亞基 概念 rna病毒以自身rna為模板合成與自身rna完全相同rna分子的過程稱為rna的復(fù)制 四 rna的復(fù)制 噬菌體q 和灰質(zhì)炎病毒 2 復(fù)制酶的 亞基與來自宿主細(xì)胞的亞基 自動裝配成rna復(fù)制酶 進(jìn)行rna復(fù)制 通常以分子中單鏈rna為模板 正鏈 復(fù)制出一條新的rna鏈 負(fù)鏈 然后以負(fù)鏈為模板復(fù)制出大量正鏈 再與外殼蛋白組裝成新的噬菌體顆粒 兩個(gè)階段 rna復(fù)制酶的催化性質(zhì) 以四種ntp為底物 專一性地選擇病毒rna為模板 按5 3 的方向合成病毒rna 無外切酶活性 即無校對功能 病毒rna的復(fù)制方式 1 病毒含正鏈rna 進(jìn)入宿主細(xì)胞后先進(jìn)行病毒rna復(fù)制酶和有關(guān)病毒蛋白質(zhì)的