細胞培養(yǎng)技術(實驗篇)四

細胞培養(yǎng)技術 實驗篇 2013年1月3日合肥 實驗四 一 VSVTCID50滴定 二 干擾素效價測定 一 三 中和試驗 一 一 VSVTCID50滴定 實驗目的 掌握病毒TCID50滴定的基本原理和計算方法熟悉病毒TCID50的應用 實驗原理 多數(shù)病毒感染體外培養(yǎng)的細胞后 常引起細胞形態(tài)學改變 如細胞團縮 裂解 細胞腫大或脫落等 這種改變稱為病毒的致細胞病變效應 CPE TCID50 50 tissuecultureinfectiousdose 是病毒毒力的傳統(tǒng)表示法 即能在50 組織細胞培養(yǎng)孔或試管內引起細胞病變所需的病毒最高稀釋度 TCID50滴定法是50 50 endpoint 終點法測定病毒滴度的方法之一 是將病毒懸浮液經(jīng)一系列稀釋后 接種至培養(yǎng)成的單層細胞 將每個稀釋度造成的細胞病變做成曲線 找出造成50 細胞病變的終點稀釋度 實驗材料 細胞 Hep 2細胞株病毒 水泡性口炎病毒 VSV 試劑 DMEM培養(yǎng)液 或RPMI1640 小牛血清 PBS VTP材料 細胞板 微量移液器 tip頭 實驗步驟 細胞的制備與培養(yǎng) 已完成 病毒的稀釋與接種結果觀察與計算 結果的記錄時間為感染細胞的病變不再進展為止 不同的病毒不一樣 本實驗所用的水泡性口炎病毒 VSV 增殖較快 一般48小時左右即可觀察染色 計算方法常用的有Reed Muench法 制備細胞 已經(jīng)完成 按傳代細胞培養(yǎng)的方法制備Hep 2細胞懸液 細胞濃度約為1 106 ml 用微量移液器將細胞懸液加入40孔板微孔中 每孔100 l 37 5 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 形成良好的單層 病毒稀釋 用含3 小牛血清的DMEM 或RPMI1640 維持液將待測病毒VSV作連續(xù)10倍稀釋 依次為10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 稀釋病毒液 待測VSV DMEM維持液 管號 稀釋度 病毒接種 將長好單層細胞的培養(yǎng)板各孔培養(yǎng)液全部傾棄 用微量加樣器將各稀釋度VSV病毒液加入相應孔中 每孔100 l 每個稀釋度加2孔 同時設細胞對照孔 不加病毒液 只加維持液 37 5 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 123456789C DMEM維持液 復孔 試驗孔 結果觀察 于培養(yǎng)后的不同時間 18h 24h 48h在倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況 當病變不再發(fā)展時記錄結果 細胞病變程度表示法如下 表示無細胞病變 表示1 25 的細胞有病變 表示26 50 的細胞有病變 表示51 75 的細胞有病變 表示76 100 的細胞有病變 Reed Muench法計算TCID50 舉例如下 由上表可知病毒的TCID50介于10 4與10 5兩個稀釋度之間 兩稀釋度之間的距離比計算如下 高于50 病變的百分數(shù) 50 距離比例 lg稀釋倍數(shù)高于50 病變的百分數(shù) 低于50 病變的百分數(shù)83 50 lg10 0 76783 40lgTCID50 高于50 病變的稀釋度的對數(shù) 距離比例 4 0 767 4 767則該病毒的TCID50 10 4 767 0 1ml 即此病毒的10 4 767的濃度 1 63000 0 1ml接種一組細胞孔后 可使50 的細胞感染病變 如何計算200TCID50 200TCID50 63000 200 315 將病毒作315倍稀釋時即得200TCID50的病毒液 注意事項 不同的病毒應選用各自敏感的細胞 接種病毒前細胞單層必須良好 接種病毒時應從低濃度向高濃度方向加樣 防止跳管現(xiàn)象 二 干擾素效價測定 一 8組做此實驗 實驗目的 掌握微量細胞病變抑制法測定干擾素效價的基本步驟以及結果分析 熟悉常用生物制品生物學活性測定的實際意義 了解影響結果的常見因素 實驗原理 何謂干擾素 病毒或其他干擾素誘生劑作用于人或動物的白細胞 T細胞或成纖維細胞后 刺激細胞產(chǎn)生的具有抗病毒 抗腫瘤和調節(jié)免疫功能的一類小分子糖肽 統(tǒng)稱為干擾素 具有間接的廣譜抗病毒作用 實驗原理 為了進一步確定人工方法制備的干擾素的生物學活性 需進行體外抗病毒試驗測定 即干擾素效價的測定 干擾素效價一般定義為 若1ml干擾素標本的最高稀釋度仍能保護半數(shù)細胞 50 免受 攻擊病毒 損害 則該稀釋度的倒數(shù)即為干擾素的效價 表示為單位 毫升 實驗原理 測定干擾素效價的方法有多種 最常用的是 細胞病變抑制法 MethodofCytopathiceffectinhibitionassay 此法的主要優(yōu)點是操作簡便 易于掌握 結果可靠 故已成為目前各實驗室的常規(guī) 亦可用 放射化學測定法 染料攝入測定法 全量細胞病變抑制測定法 常規(guī)微量細胞病變抑制測定法 微量快速檢測法 一步快速法 實驗材料 待測標本 本室制備的動物干擾素測定細胞 人喉癌上皮細胞 Hep 2 攻擊病毒 100TCID50VSV其它材料 DMEM液 VTP 小牛血清 雙抗 40孔細胞培養(yǎng)板 微量移液器 tip頭 10ml吸管等 實驗步驟 稀釋待檢干擾素 待測干擾素先作稀釋后 然后在40孔板中作倍比稀釋 微量單層細胞培養(yǎng) 按傳代細胞的方法制備4 105 ml的Hep 2細胞懸液 由低稀釋度向高稀釋度的順序向上述各孔加100 l細胞懸液 37 5 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 形成良好的單層 三 中和試驗 一 7組做此實驗 稀釋血清固定病毒法 實驗目的 測定血清中的VSV中和抗體效價 實驗原理 特異的抗病毒免疫血清 中和抗體 和病毒作用后 使病毒失去感染的能力 一種病毒只能被相應的免疫血清所中和 中和一定量的病毒的感染力必須有一定效價的中和抗體 根據(jù)稀釋成分不同可分為兩種方法 一為固定病毒用量 100TCID50 與等量一系列倍比稀釋的血清進行中和試驗 以血清中和抗體滴度表示 二為固定血清用量與等量一系列對數(shù)稀釋的病毒進行中和試驗 結果以中和指數(shù)表示 實驗材料 VSV免疫動物血清 S1 S2100TCID50VSV病毒懸液稀釋液 40孔平底細胞板 Hep 2細胞一瓶 吸管 加樣器等 實驗步驟 1 1 40孔板每孔加稀釋液 DMEM 50 l 作好標記 每塊板做2個血清標本 S1 S2 2 取滅活血清 第一孔加入50 l 吹吸三次后吸出50 l加入第二孔 吹吸三次吸出50 l加入第三孔 依次直至第八孔 吸出50 l棄去 第九孔細胞對照 第十孔病毒對照均不加血清 稀釋血清 血清S1 稀釋液 管號 稀釋度 棄0 05ml 100TCID50VSV S2操作同上 Hep 2細胞 3 預先配好100TCID50VSV病毒懸液 按照每孔50 l加入 C對照 即第9孔 不加病毒 V對照加100TCID5050 l 最后每孔總量200 l 4 37 作用1小時 實驗步驟 2 5 利用此1小時制備Hep 2細胞懸液并加入上述混合液中 Hep 2一瓶 PBS洗滌二次VTP1ml消化約5min后傾去37 至細