HPLC基礎(chǔ)知識(shí)

HPLC 基礎(chǔ)知識(shí)基礎(chǔ)知識(shí) 一 液相色譜理論發(fā)展簡況 1 色譜法的分離原理是 溶於流動(dòng)相 mobile phase 中的各組分經(jīng)過固定相時(shí) 由於與固定相 stationaryphase 發(fā)生作用 吸附 分配 離子吸引 排阻 親和 的大小 強(qiáng)弱不同 在固定相中滯留時(shí)間不同 從而先後從固定相 中流出 又稱為色層法 層析法 2 色譜法最早是由俄國植物學(xué)家茨維特 Tswett 在 1906 年研究用碳酸鈣分 離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的 色譜法 Chromatography 因之得名 後來在此基礎(chǔ) 上發(fā)展出紙色譜法 薄層色譜法 氣相色譜法 液相色譜法 3 液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送 流動(dòng)相 稱為經(jīng)典液相色譜法 此方法柱效低 時(shí)間長 常有幾個(gè)小時(shí) 4 高效液相色譜法 High performance Liquid Chromatography HPLC 是在經(jīng) 典液相色譜法的基礎(chǔ)上 於 60 年代後期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展 起來的 它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻 小顆粒具有高 柱效 但會(huì)引起高阻力 需用高壓輸送流動(dòng)相 故又稱高壓液相色譜法 High Pressure Liquid Chromatography HPLC 又因分析速度快而稱為高 速液相色譜法 High Speed Liquid Chromatography HSLP 也稱現(xiàn)代液相 色譜 二 HPLC 的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn) 高壓壓力可達(dá) 150 300 Kg cm2 色譜柱每米降壓為 75 Kg cm2 以上 高速流速為 0 1 10 0 ml min 高效可達(dá) 5000 塔板每米 在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá) 100 種 高靈敏度紫外檢測器靈敏度可達(dá) 0 01ng 同時(shí)消耗樣品少 HPLC 與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn) 速度快 通常分析一個(gè)樣品在 15 30 min 有些樣品甚至在 5 min 內(nèi)即可完成 分辨率高可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果 靈敏度高 紫外檢測器可達(dá) 0 01ng 螢光和電化學(xué)檢測器可達(dá) 0 1pg 柱子可反覆使用用一根色譜柱可分離不同的化合物 樣品量少 容易回收 樣品經(jīng)過色譜柱後不被破壞 可以收集單一組分或做 制備 三 色譜法分類 按兩相的物理狀態(tài)可分為 氣相色譜法 GC 和液相色譜法 LC 氣相色譜法 適用於分離揮發(fā)性化合物 GC 根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法 GSC 和氣 液色譜法 GLC 其中以 GLC 應(yīng)用最廣 液相色譜法適用於分離低揮發(fā)性或非 揮發(fā)性 熱穩(wěn)定性差的物質(zhì) LC 同樣可分為液固色譜法 LSC 和液液色譜法 LLC 此外還有超臨界流體色譜法 SFC 它以超臨界流體 界於氣體和液體 之間的一種物相 為流動(dòng)相 常用 CO2 因其擴(kuò)散係數(shù)大 能很快達(dá)到平衡 故分析時(shí)間短 特別適用於手性化合物的拆分 按原理分為吸附色譜法 AC 分配色譜法 DC 離子交換色譜法 IEC 排 阻色譜法 EC 又稱分子篩 凝膠過濾 GFC 凝膠滲透色譜法 GPC 和親和色 譜法 此外還有電泳 按操作形式可分為紙色譜法 PC 薄層色譜法 TLC 柱色譜法 四 色譜分離原理 高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法 液液分配色譜法 正相與反相 離子交換色譜法 離子對色譜法及分子排阻色譜法 1 液固色譜法 使用固體吸附劑 被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定 相對組分吸附力大小不同而分離 分離過程是一個(gè)吸附 解吸附的平衡過程 常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁 粒度 5 10 m 適用於分離分子量 200 1000 的 組分 大多數(shù)用於非離子型化合物 離子型化合物易產(chǎn)生拖尾 常用於分離同 分異構(gòu)體 2 液液色譜法 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)塗於擔(dān)體表面 或化學(xué)鍵合於擔(dān)體表面 而形成的固定相 分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不 同而分離 分離過程是一個(gè)分配平衡過程 塗布式固定相應(yīng)具有良好的惰性 流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽和 以減少固 定相從擔(dān)體表面流失 溫度的變化和不同批號流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化 另外在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分離和收集複雜化 由於塗布式固定 相很難避免固定液流失 現(xiàn)在已很少採用 現(xiàn)在多採用的是化學(xué)鍵合固定相 如 C18 C8 氨基柱 氰基柱和苯基柱 液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法 NPC 和反相色 譜法 RPC 正相色譜法 採用極性固定相 如聚乙二醇 氨基與腈基鍵合相 流動(dòng)相 為相對非極性的疏水性溶劑 烷烴類如正已烷 環(huán)已烷 常加入乙醇 異丙 醇 四氫呋喃 三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間 常用於分離中等極性和極 性較強(qiáng)的化合物 如酚類 胺類 羰基類及氨基酸類等 反相色譜法 一般用非極性固定相 如 C18 C8 流動(dòng)相為水或緩衝液 常加入甲醇 乙腈 異丙醇 丙酮 四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保 留時(shí)間 適用於分離非極性和極性較弱的化合物 RPC 在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用 最為廣泛 據(jù)統(tǒng)計(jì) 它佔(zhàn)整個(gè) HPLC 應(yīng)用的 80 左右 隨著柱填料的快速發(fā)展 反相色譜法的應(yīng)用範(fàn)圍逐漸擴(kuò)大 現(xiàn)已應(yīng)用於某些 無機(jī)樣品或易解離樣品的分析 為控制樣品在分析過程的解離 常用緩衝液控 制流動(dòng)相的 pH 值 但需要注意的是 C18 和 C8 使用的 pH 值通常為 2 5 7 5 2 8 太高的 pH 值會(huì)使硅膠溶解 太低的 pH 值會(huì)使鍵合的烷基脫 落 有報(bào)告新商品柱可在 pH 1 5 10 範(fàn)圍操作 正相色譜法與反相色譜法比較表 正相色譜法 反相色譜法 固定相極性 高 中 中 低 流動(dòng)相極性 低 中 中 高 組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出 從上表可看出 當(dāng)極性為中等時(shí)正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線 如氨基鍵合固定相 3 離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂 常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的 聚合物骨架 在表面末端芳環(huán)上接上羧基 磺酸基 稱陽離子交換樹脂 或季 氨基 陰離子交換樹脂 被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離 子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行可逆交換 根據(jù)各離 子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離 緩衝液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相 被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí) 間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外 它還受流動(dòng)相的 pH 值和離子強(qiáng)度影響 pH 值可改變化合物的解離程度 進(jìn)而影響其與固定相的作 用 流動(dòng)相的鹽濃度大 則離子強(qiáng)度高 不利於樣品的解離 導(dǎo)致樣品較快流 出 離子交換色譜法主要用於分析有機(jī)酸 氨基酸 多肽及核酸 4 離子對色譜法 又稱偶離子色譜法 是液液色譜法的分支 它是根據(jù)被測組 分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物後 在非極性固定相中溶解 度增大 從而使其分離效果改善 主要用於分析離子強(qiáng)度大的酸鹼物質(zhì) 分析鹼性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽 如戊烷磺酸鈉 辛烷磺酸鈉 等 另外高氯酸 三氟乙酸也可與多種鹼性樣品形成很強(qiáng)的離子對 分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽 如四丁基溴化銨 四丁基銨磷酸鹽 離子對色譜法常用 ODS 柱 即 C18 流動(dòng)相為甲醇 水或乙腈 水 水中加 入 3 10 mmol L 的離子對試劑 在一定的 pH 值範(fàn)圍內(nèi)進(jìn)行分離 被測組分保時(shí)間與 離子對性質(zhì) 濃度 流動(dòng)相組成及其 pH 值 離子強(qiáng)度有關(guān) 5 排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料 流動(dòng)相是可以溶解樣品的 溶劑 小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中 滯留時(shí)間長 大分子量的化合物不能 進(jìn)入孔中 直接隨流動(dòng)相流出 它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻 能力的差異而完成分離 常用於分離高分子化合物 如組織提取物 多肽 蛋 白質(zhì) 核酸等 II 基本概念和理論 一 基本概念和術(shù)語 1 色譜圖和峰參數(shù) 色譜圖 chromatogram 樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器 所得到的信號 時(shí)間曲線 又稱色譜流出曲線 elution profile 基線 base line 經(jīng)流動(dòng)相沖洗 柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡後 檢測器測出一段時(shí) 間的流出曲線 一般應(yīng)平行於時(shí)間軸 噪音 noise 基線信號的波動(dòng) 通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過載 檢測器不 穩(wěn)定 流動(dòng)相含有氣泡或色譜柱被污染所致 漂移 drift 基線隨時(shí)間的緩緩變化 主要由於操作條件如電壓 溫度 流動(dòng) 相及流量的不穩(wěn)定所引起 柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會(huì)產(chǎn)生漂 移 色譜峰 peak 組分流經(jīng)檢測器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線 流出曲線上的 突起部分 正常色譜峰近似於對稱形正態(tài)分佈曲線 高斯 Gauss 曲線 不對 稱色譜峰有兩種 前延峰 leading peak 和拖尾峰 tailing peak 前者少見 拖尾因子 tailing factor T T 用以衡量色譜峰的對稱性 也稱為對稱因 子 symmetry factor 或不對稱因子 asymmetry factor 中國藥典 規(guī)定 T 應(yīng)為 0 95 1 05 T 0 95 為前延峰 T 1 05 為拖尾峰 峰底 基線上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離 峰高 peak height h 峰的最高點(diǎn)至峰底的距離 峰寬 peak width W 峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)間的距 離 W 4 半峰寬 peak width at half height Wh 2 峰高一半處的峰寬 Wh 2 2 355 標(biāo)準(zhǔn)偏差 standard deviation 正態(tài)分佈曲線 x 1 時(shí) 拐點(diǎn) 的峰寬之 半 正常峰的拐點(diǎn)在峰高的 0 607 倍處 標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說明組分在流出色譜 柱過程中的分散程度 小 分散程度小 極點(diǎn)濃度高 峰形瘦 柱效高 反 之 大 峰形胖 柱效低 峰面積 peak area A 峰與峰底所包圍的面積 A h 2 507 h 1 064 Wh 2 h 2 定性參數(shù) 保留值 死時(shí)間 dead time t0 不保留組分的保留時(shí)間 即流動(dòng)相 溶劑 通過色譜 柱的時(shí)間 在反相 HPLC 中可用苯磺酸鈉來測定死時(shí)間 死體積 dead volume V0 由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測器流動(dòng)池未被固定相所佔(zhàn)據(jù)的空間 它 包括 4 部分 進(jìn)樣器至色譜柱管路體積 柱內(nèi)固定相顆粒間隙 被流動(dòng)相佔(zhàn)據(jù) Vm 柱出口管路體積 檢測器流動(dòng)池體積 其中只有 Vm 參與色譜平衡過程 其它 3 部分只起峰擴(kuò)展作用 為防止峰擴(kuò)展 這 3 部分體積應(yīng)盡量減小 V0 F t0 F 為流速 保留時(shí)間 retention time tR 從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分在柱後出現(xiàn)濃度極大值 的時(shí)間 保留體積 retention volume VR 從進(jìn)樣開始到某組分在柱後出現(xiàn)濃度極大 值時(shí)流出溶劑的體積 又稱洗脫體積 VR F tR 調(diào)整保留時(shí)間 adjusted retention time t R 扣除死時(shí)間後的保留時(shí)間 也稱 折合保留時(shí)間 reduced retention time 在實(shí)驗(yàn)條件 溫度 固定相等 一定時(shí) t R 只決定於組分的性質(zhì) 因此 t R 或 tR 可用於定性 t R tR t0 調(diào)整保留體積 adjusted retention volume V R 扣除死體積後的保留體積 V R VR V0 或 V R F t R 3 柱效參數(shù) 理論塔板數(shù) theoretical plate number N 用於定量表示色譜柱的分離效率 簡稱柱效 N 取決於固定相的種類 性質(zhì) 粒度 粒徑分佈等 填充狀 況 柱長 流動(dòng)相的種類和流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì) 如果峰形對稱並 符合正態(tài)分佈 N 可近似表示為 N 2 16 2 5 54 2N 為常量時(shí) W 隨 tR 成正比例變化 在一張多組分色譜圖上 如果各組分含量相當(dāng) 則後洗脫的峰 比前面的峰要逐漸加寬 峰高則逐漸降低 用半峰寬計(jì)算理論塔數(shù)比用峰寬計(jì)算更為方便和常用 因?yàn)榘敕鍖捀诇?zhǔn)確 測定 尤其是對稍有拖尾的峰 N 與柱長成正比 柱越長 N 越大 用 N 表示柱效時(shí)應(yīng)註明柱長 如果未註 明 則表示柱長為 1 米時(shí)的理論塔板數(shù) 一般 HPLC 柱的 N 在 1000 以上 若用調(diào)整保留時(shí)間 t R 計(jì)算理論塔板數(shù) 所得值稱為有效理論塔板數(shù) N 有效 或 Neff 理論塔板高度 theoretical plate height H 每單位柱長的方差 H 實(shí)際 應(yīng)用時(shí)往往用柱長 L 和理論塔板數(shù)計(jì)算 H H 有效 4 相平衡參數(shù) 分配係數(shù) distribution coefficient K 在一定溫度下 化合物在兩相間達(dá) 到分配平衡時(shí) 在固定相與流動(dòng)相中的濃度之比 K 分配係數(shù)與組分 流動(dòng)相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān) 也與溫度 壓力有關(guān) 在不同的色譜分離機(jī)制中 K 有不同的概念 吸附色譜法為吸附係數(shù) 離子交 換色譜法為選擇性係數(shù) 或稱交換係數(shù) 凝膠色譜法為滲透參數(shù) 但一般 情況可用分配係數(shù)來表示 在條件 流動(dòng)相 固定相 溫度和壓力等 一定 樣品濃度很低時(shí) Cs Cm 很小 時(shí) K 只取決於組分的性質(zhì) 而與濃度無關(guān) 這只是理想狀 態(tài)下的色譜條件 在這種條件下 得到的色譜峰為正常峰 在許多情況下 隨 著濃度的增大 K 減小 這時(shí)色譜峰為拖尾峰 而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度增大 K 也增大 這時(shí)色譜峰為前延峰 因此 只有盡可能減少進(jìn)樣量 使組分在柱內(nèi) 濃度降低 K 恆定時(shí) 才能獲得正常峰 在同一色譜條件下 樣品中 K 值大的組分在固定相中滯留時(shí)間長 後流出色 譜柱 K 值小的組分則滯留時(shí)間短 先流出色譜柱 混合物中各組分的分配係 數(shù)相差越大 越容易分離 因此混合物中各組分的分配係數(shù)不同是色譜分離的 前提 在 HPLC 中 固定相確定後 K 主要受流動(dòng)相的性質(zhì)影響 實(shí)踐中主要靠調(diào) 整流動(dòng)相的組成配比及 pH 值 以獲得組分間的分配係數(shù)差異及適宜的保留時(shí) 間 達(dá)到分離的目的 容量因子 capacity factor k 化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí) 在固定相 與流動(dòng)相中的量之比 k 因此容量因子也稱質(zhì)量分配係數(shù) 分配係數(shù) 容量 因子與保留時(shí)間之間有如下關(guān)係 k K t R k t0 上式說明容量因子 的物理意義 表示一個(gè)組分在固定相中停留的時(shí)間 t R 是不保留組分保留時(shí) 間 t0 的幾倍 k 0 時(shí) 化合物全部存在於流動(dòng)相中 在固定相中不保留 t R 0 k 越大 說明固定相對此組分的容量越大 出柱慢 保留時(shí)間越長 容量因子與分配係數(shù)的不同點(diǎn)是 K 取決於組分 流動(dòng)相 固定相的性質(zhì)及 溫度 而與體積 Vs Vm 無關(guān) k 除了與性質(zhì)及溫度有關(guān)外 還與 Vs Vm 有 關(guān) 由於 t R t0 較 Vs Vm 易於測定 所以容量因子比分配係數(shù)應(yīng)用更廣泛 選擇性因子 selectivity factor 相鄰兩組分的分配係數(shù)或容量因子之比 設(shè) k2 k1 因 k t R t0 則 所以 又稱為相對保留時(shí)間 美 國藥典 要使兩組分得到分離 必須使 1 與化合物在固定相和流動(dòng)相中的分配 性質(zhì) 柱溫有關(guān) 與柱尺寸 流速 填充情況無關(guān) 從本質(zhì)上來說 的大小 表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異 即分子間相互作用力的差 異 5 分離參數(shù) 分離度 resolution R 相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值 也叫 分辨率 表示相鄰兩峰的分離程度 R 當(dāng) W1 W2 時(shí) R 當(dāng) R 1 時(shí) 稱為 4 分離 兩峰基本分離 裸露峰面積為 95 4 內(nèi)側(cè)峰基重疊約 2 R 1 5 時(shí) 稱為 6 分離 裸露峰面積為 99 7 R 1 5 稱為完全分離 中國藥典 規(guī)定 R 應(yīng)大於 1 5 基本分離方程 分離度與三個(gè)色譜基本參數(shù)有如下關(guān)係 R 其中稱為柱效項(xiàng) 為柱選擇性項(xiàng) 為柱容量項(xiàng) 柱效項(xiàng)與色譜過程動(dòng)力學(xué)特 性有關(guān) 後兩項(xiàng)與色譜過程熱力學(xué)因素有關(guān) 從基本分離方程可看出 提高分離度有三種途徑 增加塔板數(shù) 方法之一 是增加柱長 但這樣會(huì)延長保留時(shí)間 增加柱壓 更好的方法是降低塔板高度 提高柱效 增加選擇性 當(dāng) 1 時(shí) R 0 無論柱效有多高 組分也不可 能分離 一般可以採取以下措施來改變選擇性 a 改變流動(dòng)相的組成及 pH 值 b 改變柱溫 c 改變固定相 改變?nèi)萘恳蜃?這常常是提高分離度的最容易 方法 可以通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成來實(shí)現(xiàn) k2 趨於 0 時(shí) R 也趨於 0 k2 增大 R 也增大 但 k2 不能太大 否則不但分離時(shí)間延長 而且峰形變寬 會(huì)影響分 離度和檢測靈敏度 一般 k2 在 1 10 範(fàn)圍內(nèi) 最好為 2 5 窄徑柱可更小些 二 塔板理論 1 塔板理論的基本假設(shè) 塔板理論是 Martin 和 Synger 首先提出的色譜熱力學(xué)平衡理論 它把色譜柱 看作分餾塔 把組分在色譜柱內(nèi)的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程 即組 分在塔板間隔內(nèi)的分配平衡過程 塔板理論的基本假設(shè)為 1 色譜柱內(nèi)存在許多塔板 組分在塔板間隔 即塔板高度 內(nèi)完全服從分配 定律 並很快達(dá)到分配平衡 2 樣品加在第 0 號塔板上 樣品沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散可以忽略 3 流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)間歇式流動(dòng) 每次進(jìn)入一個(gè)塔板體積 4 在所有塔板上分配係數(shù)相等 與組分的量無關(guān) 雖然以上假設(shè)與實(shí)際色譜過程不符 如色譜過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程 很難達(dá)到 分配平衡 組分沿色譜柱軸方向的擴(kuò)散是不可避免的 但是塔板理論導(dǎo)出了色 譜流出曲線方程 成功地解釋了流出曲線的形狀 濃度極大點(diǎn)的位置 能夠評 價(jià)色譜柱柱效 2 色譜流出曲線方程及定量參數(shù) 峰高 h 和峰面積 A 根據(jù)塔板理論 流出曲線可用下述正態(tài)分佈方程來描述 C e 或 C e 由色譜流出曲線方程可知 當(dāng) t tR 時(shí) 濃度 C 有極大值 Cmax Cmax 就是色譜峰的峰高 因此上式說明 當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí) 即 一定 峰高 h 與組分的量 C0 進(jìn)樣量 成正比 所以正常峰的峰高可用於定量分析 當(dāng) 進(jìn)樣量一定時(shí) 越小 柱效越高 峰高越高 因此提高柱效能提高 HPLC 分析的靈敏度 由流出曲線方程對 V 0 求積分 即得出色譜峰面積 A Cmax C0 可見 A 相當(dāng)於組分進(jìn)樣量 C0 因此是常用的定量參數(shù) 把 Cmax h 和 Wh 2 2 355 代入上式 即得 A 1 064 Wh 2 h 此為正常峰的峰面積計(jì)算公 式 三 速率理論 又稱隨機(jī)模型理論 1 液相色譜速率方程 1956 年荷蘭學(xué)者 Van Deemter 等人吸收了塔板理論的概念 並把影響塔板高度 的動(dòng)力學(xué)因素結(jié)合起來 提出了色譜過程的動(dòng)力學(xué)理論 速率理論 它把色 譜過程看作一個(gè)動(dòng)態(tài)非平衡過程 研究過程中的動(dòng)力學(xué)因素對峰展寬 即柱效 的影響 後來 Giddings 和 Snyder 等人在 Van Deemter 方程 H A B u Cu 後稱氣相色譜速率方程 的基礎(chǔ)上 根據(jù)液體與氣體的性質(zhì)差異 提出了液相 色譜速率方程 Giddings 方程 H 2 dp s up 5 2p s up 5 2p s up 5 2f 2 影響柱效的因素 1 渦流擴(kuò)散 eddy diffusion 由於色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結(jié)構(gòu)不同 分子在 色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬 渦流擴(kuò)散項(xiàng) A 2 dp dp 為填料直徑 為填充不規(guī)則因子 填充越不均勻 越大 HPLC 常用填料粒度一般為 3 10 m 最好 3 5 m 粒度分佈 RSD 5 但粒度太小難於填充均勻 大 且會(huì)使柱壓過高 大而均勻 球形或近球形 的顆粒容易填充規(guī)則均勻 越 小 總的說來 應(yīng)採用細(xì)而均勻的載體 這樣有助於提高柱效 毛細(xì)管無填料 A 0 2 分子擴(kuò)散 molecular diffusion 又稱縱向擴(kuò)散 由於進(jìn)樣後溶質(zhì)分子在柱 內(nèi)存在濃度梯度 導(dǎo)致軸向擴(kuò)散而引起的峰展寬 分子擴(kuò)散項(xiàng) B u 2 Dm u u 為流動(dòng)相線速度 分子在柱內(nèi)的滯留時(shí)間越長 u 小 展寬 越嚴(yán)重 在低流速時(shí) 它對峰形的影響較大 Dm 為分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散係 數(shù) 由於液相的 Dm 很小 通常僅為氣相的 10 4 10 5 因此在 HPLC 中 只要 流速不太低的話 這一項(xiàng)可以忽略不計(jì) 是考慮到填料的存在使溶質(zhì)分子不 能自由地軸向擴(kuò)散 而引入的柱參數(shù) 用以對 Dm 進(jìn)行校正 一般在 0 6 0 7 左右 毛細(xì)管柱的 1 3 傳質(zhì)阻抗 mass transfer resistance 由於溶質(zhì)分子在流動(dòng)相 靜態(tài)流動(dòng)相 和固定相中的傳質(zhì)過程而導(dǎo)致的峰展寬 溶質(zhì)分子在流動(dòng)相和固定相中的擴(kuò)散 分配 轉(zhuǎn)移的過程並不是瞬間達(dá)到平衡 實(shí)際傳質(zhì)速度是有限的 這一時(shí)間上 的滯後使色譜柱總是在非平衡狀態(tài)下工作 從而產(chǎn)生峰展寬 液相色譜的傳質(zhì) 阻抗項(xiàng) Cu 又分為三項(xiàng) 流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗 Hm Cmd2pu Dm Cm 為常數(shù) 這是由於在一個(gè)流路中流 路中心和邊緣的流速不等所致 靠近填充顆粒的流動(dòng)相流速較慢 而中心較快 處於中心的分子還未來得及與固定相達(dá)到分配平衡就隨流動(dòng)相前移 因而產(chǎn)生 峰展寬 靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗 Hsm Csmd2pu Dm Csm 為常數(shù) 這是由於溶質(zhì)分子 進(jìn)入處於固定相孔穴內(nèi)的靜止流動(dòng)相中 晚回到流路中而引起峰展寬 Hsm 對 峰展寬的影響在整個(gè)傳質(zhì)過程中起著主要作用 固定相的顆粒越小 微孔孔徑 越大 傳質(zhì)阻力就越小 傳質(zhì)速率越高 所以改進(jìn)固定相結(jié)構(gòu) 減小靜態(tài)流動(dòng) 相傳質(zhì)阻力 是提高液相色譜柱效的關(guān)鍵 Hm 和 Hsm 都與固定相的粒徑平方 d2p 成正比 與擴(kuò)散係數(shù) Dm 成反比 因 此應(yīng)採用低粒度固定相和低粘度流動(dòng)相 高柱溫可以增大 Dm 但用有機(jī)溶劑 作流動(dòng)相時(shí) 易產(chǎn)生氣泡 因此一般採用室溫 固定相傳質(zhì)阻抗 Hs Csd2fu Ds 液液分配色譜 Cs 為常數(shù) df 為固定液 的液膜厚度 Ds 為分子在固定液中的擴(kuò)散係數(shù) 在分配色譜中 Hs 與 df 的平方 成正比 在吸附色譜中 Hs 與吸附和解吸速度成反比 因此只有在厚塗層固定 液 深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中 Hs 才有明顯影響 採用單 分子層的化學(xué)鍵合固定相時(shí) Hs 可以忽略 從速率方程式可以看出 要獲得高效能的色譜分析 一般可採用以下措施 進(jìn)樣時(shí)間要短 填料粒度要小 改善傳質(zhì)過程 過高的吸附作用力可導(dǎo) 致嚴(yán)重的峰展寬和拖尾 甚至不可逆吸附 適當(dāng)?shù)牧魉?以 H 對 u 作圖 則 有一最佳線速度 uopt 在此線速度時(shí) H 最小 一般在液相色譜中 uopt 很小 大約 0 03 0 1mm s 在這樣的線速度下分析樣品需要很長時(shí)間 一般來說 都選在 1mm s 的條件下操作 較小的檢測器死體積 3 柱外效應(yīng) 速率理論研究的是柱內(nèi)峰展寬因素 實(shí)際在柱外還存在引起峰展寬的因素 即柱外效應(yīng) 色譜峰在柱外死空間裡的擴(kuò)展效應(yīng) 色譜峰展寬的總方差等於 各方差之和 即 2 2 柱內(nèi) 2 柱外 2 其它 柱外效應(yīng)主要由低劣的進(jìn)樣技術(shù) 從進(jìn)樣點(diǎn)到檢測池之間除柱子本身以外的 所有死體積所引起 為了減少柱外效應(yīng) 首先應(yīng)盡可能減少柱外死體積 如使 用 零死體積接頭 連接各部件 管道對接宜呈流線形 檢測器的內(nèi)腔體積應(yīng) 盡可能小 研究表明柱外死體積之和應(yīng) VR 其次 希望將樣品直接進(jìn)在柱 頭的中心部位 但是由於進(jìn)樣閥與柱間有接頭 柱外效應(yīng)總是存在的 此外 要求進(jìn)樣體積 VR 2 柱外效應(yīng)的直觀標(biāo)誌是容量因子 k 小的組分 如 k 2 峰形拖尾和峰寬增加 得更為明顯 k 大的組分影響不顯著 由於 HPLC 的特殊條件 當(dāng)柱子本身效 率越高 N 越大 柱尺寸越小時(shí) 柱外效應(yīng)越顯得突出 而在經(jīng)典 LC 中則 影響相對較小 III HPLC 系統(tǒng) HPLC 系統(tǒng)一般由輸液泵 進(jìn)樣器 色譜柱 檢測器 數(shù)據(jù)記錄及處理裝置 等組成 其中輸液泵 色譜柱 檢測器是關(guān)鍵部件 有的儀器還有梯度洗脫裝 置 在線脫氣機(jī) 自動(dòng)進(jìn)樣器 預(yù)柱或保護(hù)柱 柱溫控制器等 現(xiàn)代 HPLC 儀 還有微機(jī)控制系統(tǒng) 進(jìn)行自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理 制備型 HPLC 儀還備有 自動(dòng)餾分收集裝置 最早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵 低效的柱 固定波長的檢測器 繪圖儀 繪出的峰是通過手工測量計(jì)算峰面積 後來的高壓泵精度很高並可編程進(jìn)行梯 度洗脫 柱填料從單一品種發(fā)展至幾百種類型 檢測器從單波長至可變波長檢 測器 可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器 可確證物質(zhì)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜檢測器 數(shù)據(jù)處理不再用繪圖儀 逐漸取而代之的是最簡單的積分儀 計(jì)算機(jī) 工作站 及網(wǎng)絡(luò)處理系統(tǒng) 目前常見的 HPLC 儀生產(chǎn)廠家國外有 Waters 公司 Agilent 公司 原 HP 公 司 島津公司等 國內(nèi)有大連依利特公司 上海分析儀器廠 北京分析儀器 廠等 一 輸液泵 1 泵的構(gòu)造和性能 輸液泵是 HPLC 系統(tǒng)中最重要的部件之一 泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系 統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性 輸液泵應(yīng)具備如下性能 流量穩(wěn)定 其 RSD 應(yīng) 0 5 這對定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要 流量範(fàn)圍寬 分析型應(yīng)在 0 1 10ml min 範(fàn)圍內(nèi)連續(xù)可調(diào) 制備型應(yīng)能達(dá)到 100 ml min 輸出壓力高 一般應(yīng)能達(dá)到 150 300 kg cm2 液缸容積小 密封性能好 耐腐蝕 泵的種類很多 按輸液性質(zhì)可分為恆壓泵和恆流泵 恆流泵按結(jié)構(gòu)又可分為 螺旋注射泵 柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵 恆壓泵受柱阻影響 流量不穩(wěn)定 螺 旋泵缸體太大 這兩種泵已被淘汰 目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵 柱塞往復(fù)泵的液缸容積小 可至 0 1ml 因此易於清洗和更換流動(dòng)相 特別 適合於再循環(huán)和梯度洗脫 改變電機(jī)轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量 流量不受柱阻影 響 泵壓可達(dá) 400kg cm2 其主要缺點(diǎn)是輸出的脈衝性較大 現(xiàn)多採用雙泵系 統(tǒng)來克服 雙泵按連接方式可分為並聯(lián)式和串聯(lián)式 一般說來並聯(lián)泵的流量重 現(xiàn)性較好 RSD 為 0 1 左右 串聯(lián)泵為 0 2 0 3 但出故障的機(jī)會(huì)較多 因多一單向閥 價(jià)格也較貴 各品牌輸液泵的基本參數(shù) 項(xiàng)目 Waters 515 型 HP 1100 型 LC 10ATvp 型 Elite P200 II 型 檢定要求 流速範(fàn)圍 0 001 10 0 001 10 0 001 9 999 0 01 4 99 調(diào)節(jié)精度 0 001 0 001 0 001 0 01 流量精密度 RSD 0 1 0 15 0 3 0 3 0 5 1 5 流量準(zhǔn)確度 2 0 5 0 2 0 最高壓力 4000 Psi 40 MPa 39 2 MPa 40 0 MPa 密封圈壽命 流動(dòng)相的脈衝 2 泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng) 為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性 必須按照下列注意事項(xiàng)進(jìn)行操 作 防止任何固體微粒進(jìn)入泵體 因?yàn)閴m?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會(huì)磨損柱塞 密封環(huán) 缸體和單向閥 因此應(yīng)預(yù)先除去流動(dòng)相中的任何固體微粒 流動(dòng)相最 好在玻璃容器內(nèi)蒸餾 而常用的方法是濾過 可採用 Millipore 濾膜 0 2m 或 0 45m 等濾器 泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒 或片 輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換 流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì) 含有緩衝液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi) 尤 其是在停泵過夜或更長時(shí)間的情況下 如果將含緩衝液的流動(dòng)相留在泵內(nèi) 由 於蒸發(fā)或洩漏 甚至只是由於溶液的靜置 就可能析出鹽的微細(xì)晶體 這些晶 體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等 因此 必須泵入純水將泵充分 清洗後 再換成適合於色譜柱保存和有利於泵維護(hù)的溶劑 對於反相鍵合硅膠 固定相 可以是甲醇或甲醇 水 泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動(dòng)相被用完 否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會(huì)磨損柱塞 缸體或密封環(huán) 最終產(chǎn)生漏液 3 柱的填充和性能評價(jià) 色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外 還與填充技術(shù)有關(guān) 在正常條件下 填料粒度 20m 時(shí) 干法填充制備柱較為合適 顆粒 20m 時(shí) 濕法填充較為理想 填充方法一般有 4 種 高壓勻漿法 多用於分析柱和小 規(guī)模制備柱的填充 徑向加壓法 Waters 專利 軸向加壓法 主要用於裝 填大直徑柱 干法 柱填充的技術(shù)性很強(qiáng) 大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商 品柱 必須指出 高效液相色譜柱的獲得 裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié) 但根本問題還在 於填料本身性能的優(yōu)劣 以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理 無論是自己裝填的還是購買的色譜柱 使用前都要對其性能進(jìn)行考察 使用 期間或放置一段時(shí)間後也要重新檢查 柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下 樣 品 流動(dòng)相 流速 溫度 下的柱壓 理論塔板高度和塔板數(shù) 對稱因子 容 量因子和選擇性因子的重複性 或分離度 一般說來容量因子和選擇性因子的 重複性在 5 或 10 以內(nèi) 進(jìn)行柱效比較時(shí) 還要注意柱外效應(yīng)是否有變化 一份合格的色譜柱評價(jià)報(bào)告應(yīng)給出柱的基本參數(shù) 如柱長 內(nèi)徑 填料的種 類 粒度 色譜柱的柱效 不對稱度和柱壓降等 4 柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng) 色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要 稍有不慎就會(huì)降低柱效 縮短使用壽命 甚至損壞 在色譜操作過程中 需要注意下列問題 以維護(hù)色譜柱 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng) 溫度的突然變化或者使色譜 柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況 柱壓的突然升高或降低也會(huì)衝動(dòng)柱內(nèi) 填料 因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行 在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩 如前 所述 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成 特別是反相色譜中 不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)?全部是水 反之亦然 一般說來色譜柱不能反衝 只有生產(chǎn)者指明該柱可以反衝時(shí) 才可以反衝 除去留在柱頭的雜質(zhì) 否則反衝會(huì)迅速降低柱效 選擇使用適宜的流動(dòng)相 尤其是 pH 以避免固定相被破壞 有時(shí)可以在 進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱 分析柱是鍵合硅膠時(shí) 預(yù)柱為硅膠 可使流動(dòng)相在進(jìn) 入分析柱之前預(yù)先被硅膠 飽和 避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解 避免將基質(zhì)複雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi) 需要對樣品進(jìn)行預(yù) 處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱 保護(hù)柱一般是填有相似固定相 的短柱 保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換 經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱 清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì) 在進(jìn)行清洗時(shí) 對流 路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡 每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱 體積的 20 倍左右 即常規(guī)分析需要 50 75ml 下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序 作為參考 硅膠柱以正已烷 或庚 烷 二氯甲烷和甲醇依次沖洗 然後再以相反順序依次沖洗 所有溶劑都必 須嚴(yán)格脫水 甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì) 已烷使硅膠表面重新活化 反相 柱以水 甲醇 乙腈 一氯甲烷 或氯仿 依次沖洗 再以相反順序依次沖洗 如果下一步分析用的流動(dòng)相不含緩衝液 那麼可以省略最後用水沖洗這一步 一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì) 在甲醇 乙腈 沖洗時(shí)重複注射 100 200l 四氫呋喃數(shù)次有助於除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì) 四氫呋喃與乙腈或甲 醇的混合溶液能除去類脂 有時(shí)也注射二甲亞砜數(shù)次 此外 用乙腈 丙酮和 三氟醋酸 0 1 梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染 陽離子交換柱可用稀酸緩衝液沖洗 陰離子交換柱可用稀鹼緩衝液沖洗 除 去交換性能強(qiáng)的鹽 然後用水 甲醇 二氯甲烷 除去吸附在固定相表面的有 機(jī)物 甲醇 水依次沖洗 保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇 柱接頭要擰緊 防止溶劑揮發(fā)乾 燥 絕對禁止將緩衝溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時(shí)間 色譜柱使用過程中 如果壓力升高 一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞 這時(shí)應(yīng) 更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗 另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi) 使柱頭被污染 如果柱效降低或色譜峰變形 則可能柱頭出現(xiàn)塌陷 死體積增大 在後兩種情況發(fā)生時(shí) 小心擰開柱接頭 用潔淨(jìng)小鋼將柱頭填料取出 1 2mm 高度 注意把被污染填料取淨(jìng) 再把柱內(nèi)填料整平 然後用適當(dāng)溶劑濕 潤的固定相 與柱內(nèi)相同 填滿色譜柱 壓平 再擰緊柱接頭 這樣處理後柱 效能得到改善 但是很難恢復(fù)到新柱的水平 柱子失效通常是柱端部分 在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱 5 30mm 可以起到保護(hù) 延長柱壽命的作用 採用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱 效 這是值得的 通常色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá) 2 年以上 以硅膠為基質(zhì)的填料 只能在 pH2 9 範(fàn)圍內(nèi)使用 柱子使用一段時(shí)間後 可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留 於柱頂 特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙?新的色譜柱在 使用一段時(shí)間後柱頂填料可能塌陷 使柱效下降 這時(shí)也可補(bǔ)加填料使柱效恢 復(fù) 每次工作完後 最好用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗 例如 ODS 柱宜用甲醇沖 洗至基線平衡 當(dāng)採用鹽緩衝溶液作流動(dòng)相時(shí) 使用完後應(yīng)用無鹽流動(dòng)相沖洗 含鹵族元素 氟 氯 溴 的化合物可能會(huì)腐蝕不銹鋼管道 不宜長期與之接 觸 裝在 HPLC 儀上柱子如不經(jīng)常使用 應(yīng)每隔 4 5 天開機(jī)沖洗 15 分鐘 四 檢測器 檢測器是 HPLC 儀的三大關(guān)鍵部件之一 其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變 為電信號 HPLC 的檢測器要求靈敏度高 噪音低 即對溫度 流量等外界變 化不敏感 線性範(fàn)圍寬 重複性好和適用範(fàn)圍廣 1 分類 1 按原理可分為光學(xué)檢測器 如紫外 螢光 示差折光 蒸發(fā)光散射 熱學(xué) 檢測器 如吸附熱 電化學(xué)檢測器 如極譜 庫侖 安培 電學(xué)檢測器 電導(dǎo) 介電常數(shù) 壓電石英頻率 放射性檢測器 閃爍計(jì)數(shù) 電子捕獲 氦離子化 以及氫火焰離子化檢測器 2 按測量性質(zhì)可分為通用型和專屬型 又稱選擇性 通用型檢測器測量的是 一般物質(zhì)均具有的性質(zhì) 它對溶劑和溶質(zhì)組分均有反應(yīng) 如示差折光 蒸發(fā)光 散射檢測器 通用型的靈敏度一般比專屬型的低 專屬型檢測器只能檢測某些 組分的某一性質(zhì) 如紫外 螢光檢測器 它們只對有紫外吸收或螢光發(fā)射的組 分有響應(yīng) 3 按檢測方式分為濃度型和質(zhì)量型 濃度型檢測器的響應(yīng)與流動(dòng)相中組分的濃 度有關(guān) 質(zhì)量型檢測器的響應(yīng)與單位時(shí)間內(nèi)通過檢測器的組分的量有關(guān) 4 檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種 2 性能指標(biāo) 1 噪音和漂移 在儀器穩(wěn)定之後 記錄基線 1 小時(shí) 基線帶寬為噪音 基線在 1 小時(shí)內(nèi)的變化為漂移 它們反映檢測器電子元件的穩(wěn)定性 及其受溫度和電 源變化的影響 如果有流動(dòng)相從色譜柱流入檢測器 那麼它們還反映流速 泵 的脈動(dòng) 和溶劑 純度 含有氣泡 固定相流失 的影響 噪音和漂移都會(huì)影 響測定的準(zhǔn)確度 應(yīng)盡量減小 2 靈敏度 sensitivity 表示一定量的樣品物質(zhì)通過檢測器時(shí)所給出的信號大小 對濃度型檢測器 它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小 單位為 mVml g 對質(zhì)量型檢測器 它表示在單位時(shí)間內(nèi)通過檢測器的單位質(zhì) 量的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小 單位為 mVs g 3 檢測限 detection limit 檢測器靈敏度的高低 並不等於它檢測最小樣品量或最低樣品濃度能力的高 低 因?yàn)樵诙x靈敏度時(shí) 沒有考慮噪聲的大小 而檢測限與噪聲的大小是直 接有關(guān)的 檢測限指恰好產(chǎn)生可辨別的信號 通常用 2 倍或 3 倍噪音表示 時(shí)進(jìn)入檢測 器的某組分的量 對濃度型檢測器指在流動(dòng)相中的濃度 注意與分析方法檢 測限的區(qū)別 單位 g ml 或 mg ml 對質(zhì)量型檢測器指的是單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測 器的量 單位 g s 或 mg s 又稱為敏感度 detectability D 2N S 式中 N 為 噪聲 S 為靈敏度 通常是把一個(gè)已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入到檢測器中來測定其 檢測限的大小 檢測限是檢測器的一個(gè)主要性能指標(biāo) 其數(shù)值越小 檢測器性能越好 值得 注意的是 分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關(guān)外 還與色譜 條件 色譜柱和泵的穩(wěn)定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關(guān) 4 線性範(fàn)圍 linear range 指檢測器的響應(yīng)信號與組份量成直線關(guān)係的範(fàn)圍 即在固定靈敏 度下 最大與最小進(jìn)樣量 濃度型檢測器為組分在流動(dòng)相中的濃度 之比 也 可用響應(yīng)信號的最大與最小的範(fàn)圍表示 例如 Waters 996 PDA 檢測器的線性範(fàn) 圍是 0 1 2 0A 定量分析的準(zhǔn)確與否 關(guān)鍵在於檢測器所產(chǎn)生的信號是否與被 測樣品的量始終呈一定的函數(shù)關(guān)係 輸出信號與樣品量最好呈線性關(guān)係 這樣 進(jìn)行定量測定時(shí)既準(zhǔn)確又方便 但實(shí)際上沒有一臺(tái)檢測器能在任何範(fàn)圍內(nèi)呈線 性響應(yīng) 通常 A BCx B 為響應(yīng)因子 當(dāng) x 1 時(shí) 為線性響應(yīng) 對大多數(shù)檢 測器來說 x 只在一定範(fàn)圍內(nèi)才接近於 1 實(shí)際上通常只要 x 0 98 1 02 就認(rèn)為 它是呈線性的 線性範(fàn)圍一般可通過實(shí)驗(yàn)確定 我們希望檢測器的線性範(fàn)圍盡可能大些 能 同時(shí)測定主成分和痕量成分 此外還要求池體積小 受溫度和流速的影響小 能適合梯度洗脫檢測等 幾種檢測器的主要性能 UV 螢光 安培 質(zhì)譜 蒸發(fā)光散射 信號 吸光度 螢光強(qiáng)度 電流 離子流強(qiáng)度 散射光強(qiáng) 噪音 10 5 10 3 10 9 線性範(fàn)圍 105 104 105 寬 選擇性 是 是 是 否 否 流速影響 無 無 有 無 溫度影響 小 小 大 小 檢測限 g ml 10 10 10 13 10 13 10 9g s 10 9 池體積 l 2 10 7 1 梯度洗脫 適宜 適宜 不宜 適宜 適宜 細(xì)管徑柱 難 難 適宜 適宜 適宜 樣品破壞 無 無 無 有 無 5 池體積 除制備色譜外 大多數(shù) HPLC 檢測器的池體積都小於 10l 在使用細(xì)管徑柱時(shí) 池體積應(yīng)減少到 1 2l 甚至更低 不然檢測系統(tǒng)帶 來的峰擴(kuò)張問題就會(huì)很嚴(yán)重 而且這時(shí)池體 檢測器與色譜柱的連接 接頭等 都要精心設(shè)計(jì) 否則會(huì)嚴(yán)重影響柱效和靈敏度 3 紫外檢測器 ultraviolet detector UV 檢測器是 HPLC 中應(yīng)用最廣泛的檢測器 當(dāng)檢測波長範(fàn)圍包括可見光時(shí) 又稱為紫外 可見檢測器 它靈敏度高 噪音低 線性範(fàn)圍寬 對流速和溫度均 不敏感 可於制備色譜 由於靈敏高 因此既使是那些光吸收小 消光係數(shù)低 的物質(zhì)也可用 UV 檢測器進(jìn)行微量分析 但要注意流動(dòng)相中各種溶劑的紫外吸 收截止波長 如果溶劑中含有吸光雜質(zhì) 則會(huì)提高背景噪音 降低靈敏度 實(shí) 際是提高檢測限 此外 梯度洗脫時(shí) 還會(huì)產(chǎn)生漂移 註 將溶劑裝入 1cm 的比色皿 以空氣為參比 逐漸降低入射波長 溶劑的吸 光度 A 1 時(shí)的波長稱為溶劑的截止波長 也稱極限波長 中國藥典對 UV 法溶劑的要求是 以空氣為空白 溶劑和吸收池的吸收度在 220 240nm 範(fàn)圍內(nèi)不得超過 0 40 在 241 250nm 範(fàn)圍內(nèi)不得過 0 20 在 251 300nm 範(fàn)圍內(nèi)不得過 0 10 在 300nm 以上不得過 0 05 UV 檢測器的工作原理是 Lambert Beer 定律 即當(dāng)一束單色光透過流動(dòng)池時(shí) 若流動(dòng)相不吸收光 則吸收度 A 與吸光組分的濃度 C 和流動(dòng)池的光徑長度 L 成 正比 A lg lg ECL 式中 I0 為入射光強(qiáng)度 I 為透射光強(qiáng)度 T 為透光率 E 為吸收係數(shù) UV 檢測器分為固定波長檢測器 可變波長檢測器和光電二極管陣列檢測器 photodiode array detector PDAD 按光路系統(tǒng)來分 UV 檢測器可分為單光路 和雙光路兩種 可變波長檢測器又可分單波長 單通道 檢測器和雙波長 雙 通道 檢測器 PDAD 是 80 年代出現(xiàn)的一種光學(xué)多通道檢測器 它可以對每個(gè) 洗脫組分進(jìn)行光譜掃瞄 經(jīng)計(jì)算機(jī)處理後 得到光譜和色譜結(jié)合的三維圖譜 其中吸收光譜用於定性 確證是否是單一純物質(zhì) 色譜用於定量 常用於複 雜樣品 如生物樣品 中草藥 的定性定量分析 4 與檢測器有關(guān)的故障及其排除 1 流動(dòng)池內(nèi)有氣泡 如果有氣泡連續(xù)不斷地通過流動(dòng)池 將使噪音增大 如果氣泡較大 則會(huì)在 基線上出現(xiàn)許多線狀 峰 這是由於系統(tǒng)內(nèi)有氣泡 需要對流動(dòng)相進(jìn)行充分 的除氣 檢查整個(gè)色譜系統(tǒng)是否漏氣 再加大流量驅(qū)除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡 如果氣 泡停留在流動(dòng)池內(nèi) 也可能使噪音增大 可採用突然增大流量的辦法除去氣泡 最好不連接色譜柱 或者啟動(dòng)輸液泵的同時(shí) 用手指緊壓流動(dòng)池出口 使 池內(nèi)增壓 然後放開 可反覆操作數(shù)次 但要注意不使壓力增加太多 以免流 動(dòng)池破裂 2 流動(dòng)池被污染 無論參比池或樣品池被污染 都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移 可以使用適當(dāng)溶 劑清洗檢測池 要注意溶劑的互溶性 如果污染嚴(yán)重 就需要依次採用 1mol L 硝酸 水和新鮮溶劑沖洗 或者取出池體進(jìn)行清洗 更換窗口 3 光源燈出現(xiàn)故障 紫外或螢光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時(shí) 可能產(chǎn)生嚴(yán)重 噪音 基線漂移 出現(xiàn)平頭峰等異常峰 甚至使基線不有回零 這時(shí)需要更換 光源燈 4 倒峰 倒峰的出現(xiàn)可能是檢測器的極性接反了 改正後即可變成正峰 用示差折光 檢測器時(shí) 如果組分的折光指數(shù)低於流動(dòng)相的折光指數(shù) 也會(huì)出現(xiàn)倒峰 這就 需要選擇合適的流動(dòng)相 如果流動(dòng)相中含有紫外吸收的雜質(zhì) 使用紫外檢測器 時(shí) 無吸收的組分就會(huì)產(chǎn)生倒峰 因此必須用高純度的溶劑作流動(dòng)相 在死時(shí) 間附近的尖銳峰往往是由於進(jìn)樣時(shí)的壓力變化 或者由於樣品溶劑與流動(dòng)相不 同所引起的 五 數(shù)據(jù)處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng) 早期的 HPLC 儀器是用記錄儀記錄檢測信號 再手工測量計(jì)算 其後 使用 積分儀計(jì)算並打印出峰高 峰面積和保留時(shí)間等參數(shù) 80 年代後 計(jì)算機(jī)技術(shù) 的廣泛應(yīng)用使 HPLC 操作更加快速 簡便 準(zhǔn)確 精密和自動(dòng)化 現(xiàn)在已可在 互聯(lián)網(wǎng)上遠(yuǎn)程處理數(shù)據(jù) 計(jì)算機(jī)的用途包括三個(gè)方面 採集 處理和分析數(shù) 據(jù) 控制儀器 色譜系統(tǒng)優(yōu)化和專家系統(tǒng) 六 恆溫裝置 在 HPLC 儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準(zhǔn)確地控制工作環(huán)境溫度 柱子 的恆溫精度要求在 0 1 0 5 之間 檢測器的恆溫要求則更高 溫度對溶劑的溶解能力 色譜柱的性能 流動(dòng)相的粘度都有影響 一般來說 溫度升高 可提高溶質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解度 從而降低其分配係數(shù) K 但對分 離選擇性影響不大 還可使流動(dòng)相的粘度降低 從而改善傳質(zhì)過程並降低柱壓 但溫度太高易使流動(dòng)相產(chǎn)生氣泡 色譜柱的不同工作溫度對保留時(shí)間 相對保留時(shí)間都有影響 在凝膠色譜中 使用軟填料時(shí)溫度會(huì)引起填料結(jié)構(gòu)的變化 對分離有影響 但如使用硬質(zhì)填料 則影響不大 總的說來 在液固吸附色譜法和化學(xué)鍵合相色譜法中 溫度對分離的影響並 不顯著 通常實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行操作 在液固色譜中有時(shí)將極性物質(zhì) 如緩衝 劑 加入流動(dòng)相中以調(diào)節(jié)其分配係數(shù) 這時(shí)溫度對保留值的影響很大 不同的檢測器對溫度的敏感度不一樣 紫外檢測器一般在溫度波動(dòng)超過 0 5 時(shí) 就會(huì)造成基線漂移起伏 示差折光檢測器的靈敏度和最小檢出量常 取決於溫度控制精度 因此需控制在 0 001 左右 微吸附熱檢測器也要求在 0 001 以內(nèi) IV 固定相和流動(dòng)相 在色譜分析中 如何選擇最佳的色譜條件以實(shí)現(xiàn)最理想分離 是色譜工作者 的重要工作 也是用計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn) HPLC 分析方法建立和優(yōu)化的任務(wù)之一 本章 著重討論填料基質(zhì) 化學(xué)鍵合固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)及其選擇 一 基質(zhì) 擔(dān)體 HPLC 填料可以是陶瓷性質(zhì)的無機(jī)物基質(zhì) 也可以是有機(jī)聚合物基質(zhì) 無機(jī) 物基質(zhì)主要是硅膠和氧化鋁 無機(jī)物基質(zhì)剛性大 在溶劑中不容易膨脹 有機(jī) 聚合物基質(zhì)主要有交聯(lián)苯乙烯 二乙烯苯 聚甲基丙烯酸酯 有機(jī)聚合物基質(zhì)剛 性小 易壓縮 溶劑或溶質(zhì)容易滲入有機(jī)基質(zhì)中 導(dǎo)致填料顆粒膨脹 結(jié)果減 少傳質(zhì) 最終使柱效降低 1 基質(zhì)的種類 1 硅膠 硅膠是 HPLC 填料中最普遍的基質(zhì) 除具有高強(qiáng)度外 還提供一個(gè)表面 可 以通過成熟的硅烷化技術(shù)鍵合上各種配基 製成反相 離子交換 疏水作用 親水作用或分子排阻色譜用填料 硅膠基質(zhì)填料適用於廣泛的極性和非極性溶 劑 缺點(diǎn)是在鹼性水溶性流動(dòng)相中不穩(wěn)定 通常 硅膠基質(zhì)的填料推薦的常規(guī) 分析 pH 範(fàn)圍為 2 8 硅膠的主要性能參數(shù)有 平均粒度及其分佈 平均孔徑及其分佈 與比表面積成反比 比表面積 在液固吸附色譜法中 硅膠的比表面積越大 溶質(zhì)的 k 值越大 含碳量及表面覆蓋度 率 在反相色譜法中 含碳量越大 溶質(zhì)的 k 值越 大 含水量及表面活性 在液固吸附色譜法中 硅膠的含水量越小 其表面硅醇 基的活性越強(qiáng) 對溶質(zhì)的吸附作用越大 端基封尾 在反相色譜法中 主要影響鹼性化合物