【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）金龜子綠僵菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及轉(zhuǎn)化子特性分析農(nóng)業(yè)微生物學(xué)碩士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 金龜子綠僵菌遺傳轉(zhuǎn)化體系 的 建立 及轉(zhuǎn)化子特性分析 I 摘 要 金龜子綠僵菌 （ 農(nóng)林害蟲(chóng)生物防治中應(yīng)用廣泛，也是目前微生物農(nóng)藥的研究熱點(diǎn)之一。 與傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥相比， 綠僵菌寄主范圍廣 ， 致病力強(qiáng) ， 具有對(duì)人、畜 、農(nóng)作物無(wú)毒 ， 無(wú)殘留、菌劑易生產(chǎn) ， 持效期長(zhǎng)，害蟲(chóng)不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn) ， 具有廣闊的應(yīng)用前景。但作為一種昆蟲(chóng)病原真菌，綠僵菌同時(shí)也存在著殺蟲(chóng)速度慢、效率低、防治效果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，大大影響了其殺蟲(chóng)效果。 另外 由于自然分離到的菌株往往毒力不強(qiáng)或?qū)Νh(huán)境的適應(yīng)力較弱，需改良后才能應(yīng)用于生物防治， 國(guó)外對(duì)其遺傳轉(zhuǎn)化方面已有大量研究，然而國(guó)內(nèi)在這方面尚未進(jìn)行深入研究從而制約了綠僵菌優(yōu)良菌株的開(kāi)發(fā)與利用。 本研究以金龜子綠僵菌 目標(biāo)菌株，研究其原生質(zhì)體制備、轉(zhuǎn)化體系的建立并對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究， 為我 國(guó) 綠僵菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究提供參考。主要研究結(jié)果如下： 采用二級(jí)培養(yǎng)法收集菌絲體在 采用 的 液作為滲透壓穩(wěn)定劑， 20生質(zhì)體30下處理 5h 的酶解條件下可形成 5 6 107108 個(gè) /g 濕菌絲 原生質(zhì)體，再生率為 15%。 用 導(dǎo) 法對(duì)綠僵菌原生質(zhì)體進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，用 為篩選標(biāo)記，構(gòu)建了綠僵菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系。通過(guò)敏感性試驗(yàn)得出 使用濃度為 300g/轉(zhuǎn)化頻率達(dá)到 1523個(gè) /g 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化子能夠穩(wěn)定遺傳。 導(dǎo)的綠僵菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，為從基因水平利用分子生物學(xué)手段對(duì)綠僵菌進(jìn)行改造，得到穩(wěn)定高效的殺毒工程菌株奠定了基礎(chǔ)。 對(duì)得到的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了 培養(yǎng)基篩選、 生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量、致病性等 方面進(jìn)行了 研究 。通過(guò) 對(duì)轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，篩選出 轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基 。 對(duì)生長(zhǎng)速度進(jìn)行測(cè)定 結(jié)果表明 ，對(duì)照菌株的平均日增長(zhǎng)量為 化子的日增長(zhǎng)量為 間，生長(zhǎng)速度均比對(duì)照慢 ； 在轉(zhuǎn)化子中 株生長(zhǎng)速度最快 ，分別為： 落生長(zhǎng)速度最慢，日增長(zhǎng) 量為 轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)孢量 介于 108sp/間 ，與對(duì)照 108sp/比， 株的產(chǎn)孢量為 108sp/于對(duì)照但不存在顯著性差異 。 對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行毒力測(cè)定發(fā)現(xiàn)： 株轉(zhuǎn)化子的 與其它幾株轉(zhuǎn)化子之間均存在顯著性差異， 0 值分別為 d 和 d，致死中時(shí)長(zhǎng)于其它菌株，說(shuō)明這兩株菌株對(duì)東亞飛蝗的致病力比其它菌株減弱。 本研究建立的 化體系， 并對(duì)得到的轉(zhuǎn)化子的生物學(xué)特性進(jìn) 行了測(cè)定， 為進(jìn)一步深入研究綠僵菌的遺傳轉(zhuǎn)化、 工程菌的構(gòu)建、以及產(chǎn)孢量和 致病性 等 相關(guān)基因的克隆鑒定奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞： 金龜子綠僵菌 ， 原生質(zhì)體 ， 性 ， 遺傳轉(zhuǎn)化 in of is of at M. a of no to So it be in or so it be of . of of . of as by it h 0 , 0.7 as 56 107108sp g 5%. . 418 as M. 00g /of of 523 g NA 418 00g/. a . on of as 1. 2. of of K, K ( in M1 M3 in M6 3. As 08sp/to M2 4. on of to of is in be of of . 錄 第一章 綠僵菌的研究應(yīng)用與絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展 . 1 僵菌概況 . 1 僵菌防治害蟲(chóng)的作用機(jī)理及防治效果 . 1 僵菌基因工程研究 . 2 狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化 . 3 因標(biāo)記的概念 . 3 因標(biāo)記技術(shù)在真菌的分子遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用 . 3 狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化研究概況 . 3 菌原生質(zhì)體的研究進(jìn)展 . 4 狀真菌轉(zhuǎn)化方法 . 5 擇標(biāo)記和轉(zhuǎn)化載體 . 6 第二章 材料與方法 . 9 驗(yàn)菌株與質(zhì)粒 . 9 具酶與試劑 . 9 養(yǎng)基及溶液 . 9 生質(zhì)體的制備與再生 . 10 體培養(yǎng) . 10 絲體的收集 . 10 生質(zhì)體制備 . 10 生質(zhì)體再生 . 10 性標(biāo)記的篩選 . 11 生素的篩選 . 11 生素敏感性測(cè)定 . 11 粒 制備 . 11 菌轉(zhuǎn)化 . 11 粒提取 . 11 粒 化綠僵菌原生質(zhì)體 . 12 化 . 12 化子抗性標(biāo)記驗(yàn)證 . 12 化子遺傳穩(wěn)定性測(cè)驗(yàn) . 12 418 轉(zhuǎn)化子的表型分析 . 12 化子生長(zhǎng)最適培養(yǎng)基的選擇 . 12 長(zhǎng)速度的測(cè)定 . 13 孢量的測(cè)定 . 13 轉(zhuǎn)化子對(duì)東亞飛蝗的毒力測(cè)定 . 13 第三章 結(jié)果與分析 . 15 生質(zhì)體的制備與再生 . 15 生質(zhì)體制備 . 15 生質(zhì)體再生 . 15 性標(biāo)記的篩選 . 15 生素的篩選 . 15 生素的敏感性測(cè)定 . 16 粒 制備 . 17 粒 化綠僵 菌原生質(zhì)體 . 18 化 . 18 化子抗性標(biāo)記驗(yàn)證 . 18 化子穩(wěn)定性測(cè)驗(yàn) . 19 418 轉(zhuǎn)化子的表型分析 . 20 化子生長(zhǎng)最適培養(yǎng)基的選擇 . 20 長(zhǎng)速度的測(cè)定 . 22 孢量的測(cè)定 . 24 化子對(duì)東亞飛蝗的毒力測(cè)定 . 26 第四章 討論 . 31 參考文獻(xiàn) . 33 致謝 . 39 作者簡(jiǎn)歷 . 40 V 英文縮略表 英文縮寫(xiě) 英文全稱 中文名稱 鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 鈴薯葡萄糖 酵母 培養(yǎng)基 氏培養(yǎng)基 乙二醇 甲基亞砜 霉素 B 芐青霉素 桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化 制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合法 418 新霉素的類似物 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 綠僵菌的研究應(yīng)用與絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展 1 第一章 綠僵菌的研究應(yīng)用與絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展 僵菌概況 綠僵菌屬 （ 是由 883年建立的 ， 其分類地位隸屬于真菌門(mén) （ 、有絲分裂孢子真菌類 （ 、絲孢綱 （ 、絲孢目 （ 、絲孢科 （ ， 但是隨著戴氏綠僵菌 （ 的有性型戴氏蟲(chóng)草 （ 發(fā)現(xiàn) ， 綠僵菌真正的系統(tǒng)分類地位應(yīng)為 真菌門(mén) ， 子囊菌亞綱 （ 、核菌綱（ 、球殼菌目 （ 、麥角菌科 （ （ 黃勃等 ， 2002） 。綠僵菌是一種廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)害蟲(chóng)防治的昆蟲(chóng)病原真菌，其應(yīng)用于害蟲(chóng)防治的時(shí)間已久 。 據(jù)本草綱目記載，我國(guó)太湖地區(qū) 蠶戶就 開(kāi)始 采集僵病死亡的野蠶，加水搗碎，噴灑在桑葉上，以此來(lái)防治一種桑蟥的 為 害（洪華珠，楊紅 ， 1997） 。 截止到目前，據(jù)記錄 綠僵菌可感染 200多種害蟲(chóng)， 包括 蝗蟲(chóng)、蚱蜢、 蠐螬、天牛、蟑螂 、 螞蟻、 食心蟲(chóng)、白蟻、斜紋夜蛾、甘藍(lán)夜蛾 、禽壁虱（ 2001） 等，尤其是對(duì)蝗蟲(chóng)的防治有特效 。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生防所（現(xiàn)在已改名為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究 所）利用金龜子綠僵菌防治草原害蟲(chóng)，截止 到 2003年為止，其防治面積已逾 200萬(wàn)畝。 綠僵菌 對(duì)檢疫性害蟲(chóng)稻水象甲、椰心葉甲也具有一定的防治效 果（ 2004； 2005；李寶玉， 2005） 。 2005年 海南椰心葉甲大爆發(fā) ，中國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科學(xué) 院植物保護(hù)研究所綠僵菌實(shí)驗(yàn)室利用綠僵菌防治椰心葉甲，取得了可喜的成績(jī) （應(yīng)月青， 2006） 。所以利用綠僵菌對(duì)害蟲(chóng)進(jìn)行微生物生物防治具有廣闊的前景 ， 綠僵菌已被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（ 薦為環(huán)保產(chǎn)品推廣應(yīng)用 （ 1997） 。 從防治規(guī)?？?， 綠僵菌已發(fā)展成為僅次于白僵菌的真菌殺蟲(chóng)劑。 綠僵菌 形態(tài)接近于青霉菌，產(chǎn)生孢子時(shí)為綠色 ，菌落為以綠色為基調(diào)的各種色澤 。 由于綠僵菌具有寄主范圍廣，致病力強(qiáng)， 對(duì)人、畜、農(nóng)作物無(wú)毒，菌劑易生產(chǎn)，持效期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，所以有著廣闊的應(yīng)用前景。但是由于自然分離到的菌株往往毒力不強(qiáng)或?qū)Νh(huán)境的適應(yīng)力較弱，需改良后才能應(yīng)用于生物防治（農(nóng)向群等， 1990），所以改變綠僵菌菌株的性狀成為 急需 解決的問(wèn)題。 僵菌防治害蟲(chóng)的作用機(jī)理及防治效果 綠僵菌是一種昆蟲(chóng)內(nèi)寄生菌物，殺蟲(chóng)機(jī)理獨(dú)特 （ 2000） ，既 可橫向傳播，又可縱向傳播 。大量研究 結(jié)果 表明，綠僵菌與其他蟲(chóng)生真菌一樣，主要侵染部位是寄主昆蟲(chóng)的表皮，經(jīng)由體壁侵入到寄主昆蟲(chóng)體內(nèi)（王海川等， 1999）。 綠僵菌 侵 染寄主昆蟲(chóng)時(shí)，首先是分生孢子附著在昆蟲(chóng)體表，孢子萌發(fā)后產(chǎn)生入侵菌絲，穿過(guò)體壁，在蟲(chóng)體內(nèi)大量繁殖，產(chǎn)生毒素，形成孢子，最終導(dǎo)致寄主死亡。在侵染過(guò)程中綠僵菌分泌各種相應(yīng)的酶（如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂酶等），有機(jī)酸（草酸、檸檬酸等）以及毒素（李文華等， 2001），形成特殊結(jié)構(gòu)（如附著胞、穿透釘、穿透菌絲、穿透板等），同時(shí)要克服昆蟲(chóng)體表某些物質(zhì)的抑制作用及昆蟲(chóng)體內(nèi)的一系列免疫活動(dòng)，侵染過(guò)程 是附著胞、表皮降解酶和破壞菌素等物質(zhì)的生理生化作用的綜合結(jié)果 （ et 2000，裘輝等， 2004） 。 綠 僵菌孢子 在 觸及靶標(biāo)昆蟲(chóng)后，通過(guò)酶的作用進(jìn)入昆蟲(chóng)表皮，隨后侵入血液，導(dǎo)致昆蟲(chóng)感染死亡 ， 被感染后的昆蟲(chóng)尸體依然附著在作物上 ， 新產(chǎn)生的綠僵菌孢子通過(guò)昆中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 綠僵菌的研究應(yīng)用與絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展 2 蟲(chóng)外骨骼的孢子轉(zhuǎn)運(yùn)體被釋放出來(lái) ， 再度感染其它健康蟲(chóng)體。一般情況下只要靶標(biāo)害蟲(chóng) 10%左右的個(gè)體被感染上綠 僵 菌后，便可相繼摧毀整個(gè)群體 ， 殺蟲(chóng)率 極 高 。 在氣候條件適宜的情況下，可連續(xù)幾年攻擊靶標(biāo)害蟲(chóng) ， 因此綜合防治成本大大降低 。 此外，綠僵菌 是一種高效、低毒、無(wú)公害，害蟲(chóng)難以產(chǎn)生抗藥性的綠色環(huán)保型生物農(nóng)藥 ， 對(duì)人、畜、林木和農(nóng)作物等無(wú)害 ， 環(huán)保意義突出。但是由于真菌殺蟲(chóng)劑的使用量較 大、生產(chǎn)成本相對(duì)較高，分生孢子存活率低，貯存期短等缺點(diǎn)，尋找優(yōu)良菌株尚需進(jìn)行深入研究。 隨著大量使用化學(xué)合成農(nóng)藥所造成的環(huán)境污染和害蟲(chóng)抗藥性提高等問(wèn)題日益突出，生物防治越來(lái)越受到重視 （馮明光， 1998 ） 。 1992年世界環(huán)境與發(fā)展大會(huì)決議中指出，要在全球范圍內(nèi)控制化學(xué)農(nóng)藥的銷(xiāo)售與使用，我國(guó)已將發(fā)展生物農(nóng)藥 與綠色食品列入中國(guó) 21世紀(jì)議程。 昆蟲(chóng)病原真菌是自然界中昆蟲(chóng)種群數(shù)量得以控制的主要因素之一 （ 997 ） 。 昆蟲(chóng)病原真菌具有主動(dòng)侵染、寄主不易產(chǎn)生抗性和可觀的擴(kuò)散效果等特點(diǎn)，因此 ，昆蟲(chóng)病原真菌作為一種潛力巨大的生物防治工具而倍受關(guān)注。為充分挖掘昆蟲(chóng)病原真菌的應(yīng)用潛力，必須闡明它們致病昆蟲(chóng)的分子機(jī)制 （ 1994） 。近年來(lái)，昆蟲(chóng)病原真菌特別是金龜子綠僵菌致病機(jī)理方面的研究 已經(jīng) 有了長(zhǎng)足的進(jìn)展。利用基因工程等手段對(duì)昆蟲(chóng)病原真菌進(jìn)行改造，獲得安全、高效的真菌殺蟲(chóng)菌劑，已成為可能。 僵菌基因工程研究 提高昆蟲(chóng)病原真菌的毒力是進(jìn)一步擴(kuò)大其應(yīng)用的關(guān)鍵。可以通過(guò)如下幾個(gè)途徑來(lái)提高毒力： 通 過(guò)體細(xì)胞工程技術(shù)將不同菌株的優(yōu)良性狀集中到同一菌株上；篩選優(yōu)良 菌株，并通過(guò)準(zhǔn)性生殖雜交技術(shù)得到集多個(gè)優(yōu)良性狀于一體的菌株；通過(guò)基因工程技術(shù)在病原真菌中高效或誘導(dǎo)表達(dá)與毒力相關(guān)的基因。其中基因工程技術(shù)被認(rèn)為是最有效的途徑，而且它還成為研究昆蟲(chóng)病原真菌分子生物學(xué)的新工具 （裴炎等， 2003） 。 （ 1988）發(fā)現(xiàn)，凝乳彈性蛋白酶（ 致病力決定體，因此，克隆 因及其它致病力的決定體基因，不僅可以澄清致病機(jī)制，還將為蟲(chóng)生真菌殺蟲(chóng)劑培育出高毒菌株 。 1996） 通過(guò) 穿孔及生物轉(zhuǎn)染法，將帶有苯菌靈抗性質(zhì)粒 入金龜子綠僵菌，以生 物轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)化率及穩(wěn)定性最高。帶有苯菌靈抗性基因 粒 帶有 因的質(zhì)粒 金龜子綠僵菌 1080 菌株進(jìn)行共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，經(jīng)抗性及富營(yíng)養(yǎng)篩選，得到能夠在煙草天蛾的血淋巴中過(guò)量表達(dá) 工程菌株，該菌株大大提高了殺蟲(chóng)活性 （ ， 1996） 。 （ 1989） 證明用質(zhì)粒 化 綠僵菌 ，形成的轉(zhuǎn)化子比較穩(wěn)定并保持對(duì)煙草天 蛾幼蟲(chóng)的致病性， 交表明多數(shù)轉(zhuǎn)化體是重復(fù)載體序列隨機(jī)染色體中形成的。用綠僵菌防治害蟲(chóng)時(shí)會(huì)與防治真菌病害的殺菌劑接觸并被大 量殺死，降低防治效果。 苯并咪唑類殺菌劑抗性基因在綠僵菌的轉(zhuǎn)化率僅為每微克質(zhì)粒 生 轉(zhuǎn)化子（ 1990）， 因此，建立工程菌株意義重大。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 綠僵菌的研究應(yīng)用與絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展 3 狀真菌 遺傳轉(zhuǎn)化 因標(biāo)記 的概念 基因標(biāo)記是指將外源 入到受體細(xì)胞的基因組中，使受體細(xì)胞產(chǎn)生不同于正常細(xì)胞的表型。被引入的 以整合到受體細(xì)胞的質(zhì)?；蛉旧w中并穩(wěn)定遺傳。由于特殊的設(shè)計(jì)，被引入的 含能方便地進(jìn)行檢測(cè)的基因，即標(biāo)記基因。基因標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于基因的克隆 及 基因的功能鑒定。此外，還可以利 用基因標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行生防菌的追蹤分析。 感受態(tài)細(xì)胞是指能獲得外源 細(xì)胞，在外源 入受體細(xì)胞時(shí)，受體細(xì)胞必須處于感受態(tài)。感受態(tài)細(xì)胞直接攝取外源 過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化。原生質(zhì)體雖然除去大部分細(xì)胞壁，但仍然保持完整細(xì)胞的遺傳特性及生理、生化特性，在適當(dāng)?shù)臈l件下能夠再生細(xì)胞壁進(jìn)而恢復(fù)成完整細(xì)胞。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)常利用無(wú)壁的原生質(zhì)體，直接攝取外源 細(xì)胞器，與異種原生質(zhì)體融合形成新的體細(xì)胞雜種，從而大大提高育種效率。 因標(biāo)記技術(shù)在真菌的分子遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用 基因標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于 基因的克隆、基因的功能鑒定。此外，還可以利用基因標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行生防菌的追蹤分析。 近年來(lái)，由于蟲(chóng)生真菌在害蟲(chóng)持續(xù)控制及維護(hù)物種多樣性方面的特殊優(yōu)勢(shì)，其應(yīng)用及基礎(chǔ)研究發(fā)展迅速，通過(guò)遺傳工程改良菌株是今后發(fā)展的主要方向， 化技術(shù)是菌株改良的主要途徑之一，國(guó)內(nèi)外一些專家學(xué)者試圖將這一技術(shù)應(yīng)用到昆蟲(chóng)病原菌的菌種選育中，以促進(jìn)病原真菌在害蟲(chóng)控制上的優(yōu)勢(shì)及潛力。 該技術(shù)的先決條件是建立外源 定導(dǎo)入 真菌 的方法。向絲狀真菌中轉(zhuǎn)化 常常 是向含原生質(zhì)體的氯化鈣溶液中加入外源 借助 作用來(lái)完成，但形成 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的頻率較低。 狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化研究概況 蟲(chóng)生真菌的菌株改良大體有 3 種方法。第 1 種：利用突變與誘變育種進(jìn)行人工改良。方祺霞等（ 1985）用 線和紫外線對(duì)座殼孢野生型 自然分離株 行誘變育種，得到高產(chǎn)高毒的誘變菌株。鄧春生等（ 1991）對(duì)蠟蚧輪枝菌原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變得到產(chǎn)孢量提高10 倍， 并且 致病力提高 30%50%的效果。 1991） 采用從野生群體中分離突變株的富集分離技術(shù)分離出二倍體和三倍體突變株。第 2 種：應(yīng)用細(xì)胞工程技術(shù)培育優(yōu)良菌 株 。 早在70 年代，在許多人致力于通過(guò)誘變改良菌株的同時(shí)，就有人通過(guò)原生質(zhì)體融合即形成異核體來(lái)改良菌株。農(nóng)向群等（ 1988）對(duì)金龜子綠僵菌、粉擬青霉原生質(zhì)體的形成條件、再生、融合及檢測(cè)等進(jìn)行了研究探討。此后，農(nóng)向群等（ 1990）用 維素酶和 牛酶的混合酶液處理了金龜子綠僵菌的菌絲，可從濕菌絲中獲得 5 107個(gè)以上的原生質(zhì)體。第 3 種：利用基因工程技術(shù)進(jìn)行菌株改良?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展為蟲(chóng)生真菌的遺傳學(xué)研究提供了極好的手段。 通過(guò)遺傳工程改良菌株是今后發(fā)展的主要方向，它的先決條件是建立外源 定 導(dǎo)入的方法。向絲狀真菌中轉(zhuǎn)化 本上是向含原生質(zhì)體的氯化鈣溶液中加入外源 助 作用來(lái)完成，但形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的頻率較低（高興喜等， 2005， 2006）。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 綠僵菌的研究應(yīng)用與絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展 4 絲狀真菌 是自然界中普遍存在并 且 有重要經(jīng)濟(jì)意義 的 一種 真菌，被廣泛用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等方面，在基礎(chǔ)生物學(xué)研究中具有重要作用。例如產(chǎn)黃青霉 （ 和 點(diǎn)青霉 （ 等都能大量產(chǎn)生青霉素 ，頂頭孢霉 （ 能 分別產(chǎn)生青霉素和頭孢菌素，廣泛 用于疾病的治療 ； 工業(yè)上如黑曲霉 （ 和米曲霉（ 被廣泛用于生產(chǎn)酶類和有機(jī)酸；在農(nóng)業(yè)上，絲狀真菌是農(nóng)作物重要的致病菌，并能導(dǎo)致糧食等貯藏過(guò)程中的腐敗變質(zhì)，同時(shí)有些絲狀真菌如白僵菌 （ 、綠僵菌（ 哈氏木霉 （ 等可用于作物病蟲(chóng)害的生物防治 ； 不過(guò) 有些絲狀真菌 也 能產(chǎn)生對(duì)人體有害的物質(zhì)，如黃曲霉菌 （ 能產(chǎn)生黃曲霉毒素 。由于絲狀真菌在經(jīng)濟(jì)上和科學(xué)中的重要性，多年來(lái)一直被廣泛 的關(guān)注 ， 對(duì)其進(jìn)行研究的報(bào)道較多，有利于了解其有益性狀，從而控制其不利性狀 。絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立為人們從基因水平研究絲狀真菌的遺傳背景和進(jìn)一步的菌株改造提供了條件，通過(guò)轉(zhuǎn)化把外源基因?qū)虢z狀真菌細(xì)胞，利用基因互補(bǔ)、基因破壞和基因替換等原理克隆或表達(dá)目的基因、分析基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)理乃至改造工業(yè)生產(chǎn)菌株（劉朋絹， 2005）。 1979 年將外源 9因?qū)氪植诿}孢菌（ 色體基因組，建立了 化系統(tǒng)，從 而開(kāi)創(chuàng)了絲狀真菌轉(zhuǎn)化的先河。 1983 年， 構(gòu)巢曲霉（ 的 化獲得成功，為科學(xué)家研究絲狀真菌的 化技術(shù)及以 絲狀真菌作為新的基因表達(dá)系統(tǒng)的研究奠定了基礎(chǔ)。近年來(lái)，具有顯性選擇標(biāo)記的潮霉素（ ）等抗藥性基因的利用，加快了在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要意義的各類真菌轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展。據(jù)報(bào)道目前已有 100 多種絲狀真菌建立了 化系統(tǒng)。隨著植物病原菌對(duì)殺菌劑 產(chǎn)生 抗性問(wèn)題的日益嚴(yán)重，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始嘗試對(duì)生物防治微生物進(jìn)行抗藥性的遺傳改造，已將包括多菌靈在內(nèi)的 苯并咪唑類殺菌劑抗性基因轉(zhuǎn)入綠僵菌、木霉 102 中 ，從而 使生物防治菌具有對(duì)抗化學(xué)農(nóng)藥的性質(zhì)，使二者能夠同時(shí)應(yīng)用于植物病蟲(chóng)害的綜合防治，有利于保護(hù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和減少化學(xué)農(nóng)藥的使用（李梅等， 2003）。 目前，在絲狀真菌中整合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大腸桿菌和酵母菌，一般每微克質(zhì)粒能產(chǎn)生 1020 個(gè)轉(zhuǎn)化子（張惠展， 2000）。苯并咪唑類殺菌劑抗性基因在綠僵菌 中 的轉(zhuǎn)化率僅為每微克質(zhì)粒 生 轉(zhuǎn)化子（ 1990），木霉菌的轉(zhuǎn)化率僅為每微克質(zhì)粒 生 轉(zhuǎn)化子（楊謙， 1998），這 給 外源基因的克隆和菌種改造帶來(lái)很大困難。 但是，通過(guò)對(duì)目的基因載體的構(gòu)建、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化條件、轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)時(shí)間等方面進(jìn)行優(yōu)化研究，可以提高其轉(zhuǎn)化率。 菌原生質(zhì)體的研究進(jìn)展 自 20 世紀(jì) 70 年代以來(lái)，生物技術(shù)迅速崛起，現(xiàn)在已經(jīng)成為新技術(shù)革命的重要組成部分。生物技術(shù)可以將理想的異源遺傳物質(zhì)，包括基因、染色體移植到目標(biāo)生物中去，從而按照人們的要求去改造物種。例如，基因工程可以越過(guò)有性雜交的屏障，使基因在遠(yuǎn)緣物種之間轉(zhuǎn)移，為定向地改變生物遺傳性，創(chuàng)造新型的物種提供了有利手段。利用原生質(zhì)體融合（體細(xì) 胞雜交）技術(shù)，可以得到有性雜交難以得到的種屬間或細(xì)胞雜種。原生質(zhì)體（ 為一個(gè)研究體系已備受人們關(guān)注（柴容明， 2000）。 原生質(zhì)體是保留完整細(xì)胞質(zhì)膜而沒(méi)有細(xì)胞壁的細(xì)胞，去壁不完全而帶有部分細(xì)胞壁的細(xì)胞叫中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 綠僵菌的研究應(yīng)用與絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展 5 球狀體。最初，人們得到原生質(zhì)體是通過(guò)機(jī)械搗碎的方法（ 1892），但由于該方法難以得到大量原生質(zhì)體，因此實(shí)際應(yīng)用較少。后來(lái)許多研究者試圖改進(jìn)和發(fā)展這一技術(shù)，但是進(jìn)展甚微。原生質(zhì)體簡(jiǎn)便、快捷的制備方法得益于人量工業(yè)化酶的制備，酶解細(xì)胞壁可以大量獲得原生質(zhì)體，這是原生質(zhì)體技術(shù) 建立和發(fā)展的基礎(chǔ)。 到了 20 世紀(jì) 50 年代，人們開(kāi)始關(guān)注原生質(zhì)體技術(shù)， 1953 年 次利用融菌酶酶解制備了巨大芽孢菌的原生質(zhì)體 。 受細(xì)菌原生質(zhì)體融合的啟發(fā)， 1957 年 首次用蝸牛酶酶解制備了酵母菌的原生質(zhì)體 。 60 年代捷克的 西班牙的 個(gè)研究中心對(duì)原生質(zhì)體技術(shù)做了大量基礎(chǔ)性工作，前者主要應(yīng)用原生質(zhì)體研究酵母細(xì)胞的生活史與細(xì)胞分裂，后者主要研