【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）CELO禽腺病毒載體的構(gòu)建及fiber 1部分片段的原核表達(dá)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)碩士論文

密級(jí) 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 及 部分片段的原核表達(dá) A of 摘 要 即雞胚致死孤兒病毒 ，是 目前進(jìn)行病毒載體研究的主要工具 之一 。 和 基因表達(dá)的兩個(gè)纖突蛋白與該病毒的毒力和免疫原性相關(guān) 。 缺失 基因后病毒依然能復(fù)制，但 失去野生型病毒 特有 的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo) 作用 。本試驗(yàn)就是利用這一特性構(gòu)建了復(fù)制型重組 外根據(jù) 的 根據(jù) 序列號(hào) 毒的基因 組 序列 ， 利用 計(jì) 一 對(duì) 特異性 引物， 以 毒基因組 模板，用 增出了 長(zhǎng)度 3611 段 （位于 基因組序列 的 27150中包括 全基因和側(cè)翼序列 ）， 克隆到 體上，獲得 利用雙酶切位點(diǎn) 理 切處理 到增強(qiáng)式綠色熒光蛋白表達(dá)盒 二者補(bǔ)平，然后連接得到轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 毒基因組 轉(zhuǎn)染 293胞，用轉(zhuǎn)染產(chǎn)物感染 胞，拯救重組病毒，最后通過(guò)熒光、 鏡檢測(cè)重組病毒。 根據(jù) 毒的 基因序列， 選取了 蛋白的 免疫 優(yōu)勢(shì)區(qū)域 ，利用計(jì) 一 對(duì) 特異性 引物， 以 模板， 擴(kuò)增 了其中 807 目的 片段 （ 位于 的， 克隆入 體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 后用 導(dǎo)外源基因的 表達(dá) ，獲得 目的蛋白；薄層掃描顯示，重組蛋白占菌體總蛋白高達(dá)的 驗(yàn)表明 ， 目的 蛋白 具有較好的抗原活性。 本研究構(gòu)建了 望能在體內(nèi)外基因治療中發(fā)揮作用，并為今后禽類腺病毒載體疫苗的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。另外表達(dá)了 蛋白的免疫活性片段，可以為進(jìn)一步建立 行現(xiàn)地的血清學(xué)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。 關(guān)鍵詞： 毒 ，載體， ，原核表達(dá) is as a （ is of it is as a of to on a . A 611 27 150bp 0 760 （ c） of CR in a 92NA to 93-T by or to a by 07bp c a to by . in of of be in in be as ， I 目 錄 1 引言 1 毒概述 1 毒的分類地位及發(fā)展歷史 1 毒的形態(tài)、理化特性 1 毒 生物學(xué)特性 2 毒的自然宿主和實(shí)驗(yàn)室宿主 3 毒的感染和復(fù)制機(jī)理 3 毒的檢測(cè) 4 毒分子生物學(xué)研究 4 毒基因組結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白 4 毒與其他腺病毒基 因結(jié)構(gòu)和功能的比較 4 毒與基因工程載體 6 究目的 7 2 研究報(bào)告 8 毒毒株、質(zhì)粒和細(xì)胞 8 要儀器 8 劑及其他材料 8 毒載體的構(gòu)建 8 毒的復(fù)制增殖 8 毒在雞胚腎細(xì)胞和雞腎細(xì)胞傳代 8 毒的粗提純和病毒 提取 9 物的設(shè)計(jì)與合成 9 c 片段的 增及克隆 9 裂解法提取質(zhì)粒 9 粒鑒定與測(cè)序 10 組質(zhì)粒 構(gòu)建與鑒定 10 毒 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 10 毒的 基因部分片段的原核表達(dá)及抗原性鑒定 12 物的設(shè)計(jì)與合成 12 基因部分片段的 增及克隆 12 組質(zhì)粒的構(gòu)建 12 達(dá)載體的鑒定 12 基因片段的誘導(dǎo)表達(dá) 12 組蛋白的 析 13 果 13 毒細(xì)胞傳代和雞胚接種 13 c 片段的 增及克隆的鑒定 13 組質(zhì)粒 構(gòu)建與鑒定 16 毒 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 16 蛋白功能區(qū)分析 17 組原核表達(dá)載體的構(gòu)建 18 測(cè)重組蛋白 19 組蛋白的 測(cè)結(jié)果 20 論 20 3 結(jié) 論 23 參考文獻(xiàn) 24 附 錄 28 致 謝 32 作者簡(jiǎn)介 33 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引 言 1 1 引言 1954 年 人首次報(bào)告從雞胚中分離到一種新病毒，并于 1957 年命名為雞胚致死孤兒病毒 （ ， 簡(jiǎn)稱 毒 （ et 1957）。該病毒可以引起雞的包涵體肝炎（ 1963 年， 早報(bào)道了雞包涵體肝炎，發(fā)生該病后的一大特點(diǎn)就是病原復(fù)雜、感染率高，常與引起禽類呼吸道疾病的病原微生物混合感染， 毒的主要器官是肉用雞的肝臟，引起肝尖出血。 但是，對(duì)于本病毒的研究是從該病毒小倉(cāng)鼠體內(nèi)有致瘤性和作為作為病毒載體的研究上深入的。 歷史 根據(jù)宿主范圍，腺病毒大家族可以分為哺乳動(dòng)物腺病毒屬和禽腺病毒屬。 毒屬于腺病毒科，禽腺病毒屬，雞腺病毒 I 型，歸于腺病毒 A 群。 毒第一次被發(fā)現(xiàn)是在增殖牛皮膚病因子過(guò)程中于孵化的雞胚內(nèi)分離到的疾病因子（ ， 1949）， 1957 年將其確定為感染致病因子（ et 1957） 。 由于 毒具有禽腺病毒屬 內(nèi) 各種的主要生物學(xué)特性及抗原特性， 1982 年國(guó)際病毒學(xué)分類委員會(huì)（ 四次報(bào)告把 毒確定為禽腺病毒屬的代表種 。此后的研究發(fā)現(xiàn) 毒在小倉(cāng)鼠體內(nèi)有致瘤性（ et 1965），這是 化特性 毒粒子形態(tài)與組成 毒粒子與哺乳動(dòng)物腺病毒相似， 具有所有腺病毒共有的特性。病毒粒子無(wú)囊膜 ，核衣殼的直徑約 70二十面體立體對(duì)稱。線狀的雙股 et 1971； Li et 1984）。 子每條鏈的 5端共價(jià)結(jié)合一個(gè)分子量 55 000 的末端蛋白 ；病毒衣殼 是由二十面體上的殼體單位組成的，每個(gè)殼體均由衣殼蛋白五聯(lián)體（ 位和六聯(lián)體（ 位排列形成，電鏡下 252 個(gè)殼體單位排列清楚可見(jiàn)（ et 1970）。 毒編碼的兩個(gè)纖突蛋白 和 合在五聯(lián)體基座上（ et 1996）。 其形態(tài)見(jiàn)圖 1。 理化特性： 毒對(duì)外界不良環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，對(duì)脂溶劑有抵抗力，可耐 熱抗酸能力較強(qiáng)，易被甲醛滅活。 度梯度離心發(fā)現(xiàn) 毒主要集中在 +/g/密度帶上（ et 1971） 。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引 言 2 圖 1 物學(xué)特性 或 37 可以凝集倉(cāng)鼠紅細(xì)胞 （ I， 1964） 。毒粒子與倉(cāng)鼠紅細(xì)胞的吸附是由病毒的渦上突起 凝素主導(dǎo)的 毒的抗血清所抑制（ 度 1:320）， 抗血清 對(duì)血凝活性沒(méi)有影響（ 度 1:10）。 毒的致瘤性 ： 在小倉(cāng)鼠體內(nèi) ， 毒能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤 （ et 1998） 。 且對(duì)體外培養(yǎng)的倉(cāng)鼠腎細(xì)胞和人源細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化能力（ 1972） 。皮下接種和腦內(nèi)接種均可誘導(dǎo)倉(cāng)鼠產(chǎn)生腫瘤，這些腫瘤呈現(xiàn)組織學(xué)上的脈絡(luò)叢癌癥狀，以排列成索狀、折疊和乳頭裝突起的嗜堿性細(xì)胞的浸染為主要特征。處于高度有絲分裂期的單個(gè)細(xì)胞發(fā)生縮短、柱狀到立方形的變化。 毒的抗原性 ： 毒 六聯(lián)體組分中的 抗原對(duì)禽類來(lái)說(shuō)是血清型特異的，不是群特異的，與禽腺病毒其他血清型不產(chǎn)生交叉反應(yīng)， 這對(duì)于臨床診斷過(guò)程中 毒的確診有著很重要的現(xiàn)實(shí)意義 。 毒不具有哺乳動(dòng)物腺病毒共有的群特異性抗原，但含有禽腺病毒共有的群特異性抗原。試驗(yàn)表明， 毒的感染性和 補(bǔ)體結(jié)合特性， 具有熱穩(wěn)定性，而血凝活性卻對(duì)熱敏感，說(shuō)明 毒吸附紅細(xì)胞的位點(diǎn)與吸附易感宿主細(xì)胞的位點(diǎn)不同（ et 975） 。放射性免疫沉淀反應(yīng)分析顯示，熱變性的六聯(lián)體蛋白酶消化片段完全失去了天然蛋白的抗原性，而天然的 胰島素、胰凝乳蛋白酶和 聯(lián)體核心能夠被六聯(lián)體特異性抗體沉淀（ et 1986） 。 纖突 （ 五聯(lián)體（ 六聯(lián)體 （ 末端蛋白 病毒基因組 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引 言 3 從雞、鵪鶉、環(huán)脖野雞及海燕的體內(nèi)均可分離到 et 1989） 。實(shí)驗(yàn)室常以倉(cāng)鼠、雞等為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，體外可以感染 人源癌細(xì)胞（ et 1964） 、 大鼠的上皮宿主細(xì)胞（ et 2003）、 雞腎細(xì)胞 et 2000）、雞肝細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞（ 1978） 。研究證明1975） ，并發(fā)現(xiàn) et 1974）， 1993）研究發(fā)現(xiàn) 毒主要在禽類的消化道和呼吸道內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制往往形成包涵體。 、絨毛尿囊膜、尿囊腔接種培養(yǎng)，引起雞胚死亡或生長(zhǎng)遲緩。也可以用雞胚腎細(xì)胞、肝細(xì)胞或雞腎細(xì)胞、肝細(xì)胞培養(yǎng)，病變細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、折光性增強(qiáng)、細(xì)胞脫落（ 1971）?，F(xiàn)在已經(jīng)培養(yǎng)出適應(yīng) 毒生長(zhǎng)的禽源性細(xì)胞系 胞系（ et 1987） ，但主要用于重組腺病毒的構(gòu)建。 毒感染細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制的過(guò)程同一般腺病毒一樣包括以下幾個(gè)階段： （ 1）黏附 ： 腺病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞是通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用完成的。感染過(guò)程的第一步是：病毒的晶狀結(jié)構(gòu)的纖突球部靠近易感細(xì)胞膜上的特異 性跨膜受體 柯薩奇病毒 并與其表面域結(jié)合形成高度親和的復(fù)合物，該過(guò)程即為病毒吸附過(guò)程。 體是一個(gè)糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，由兩個(gè)胞外免疫球蛋白域、一個(gè)疏水 螺旋跨膜域和一個(gè)胞內(nèi)區(qū)組成，是腺病毒感染易感細(xì)胞不可缺少的結(jié)構(gòu)（ et 1999）。 （ 2）病毒進(jìn)入易感細(xì)胞及其 釋放：病毒吸附到易感細(xì)胞上以后，病毒與質(zhì)膜的相互作用可誘導(dǎo)許多信號(hào)途徑。有證據(jù)表明，病毒與細(xì)胞的吸附激活了 3酸肌醇激酶（ 徑，反過(guò)來(lái)刺激 族、肌動(dòng)朊的多聚合作用和重組裝，從而促進(jìn)細(xì)胞吞粒作用。通過(guò)胞吞作用，病毒進(jìn)入易感細(xì)胞，開(kāi)始是以受體內(nèi)體或核內(nèi)體形式存在于宿主胞質(zhì)內(nèi)。隨后在宿主細(xì)胞蛋白酶的作用下，隨著 賴性的胞吞囊泡的破壞，病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，宿主蛋白酶解離五聯(lián)體降低衣殼的穩(wěn)定性，六聯(lián)體衣殼蛋白在細(xì)胞中可能存在的胰島素、胰凝乳蛋白酶或作用下水解成為不同大小的片段（ et 1986） ，其他的相關(guān)蛋白也發(fā)生分離，病毒衣殼分解，釋放 （ 3）病毒 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制 ： 毒復(fù)制的方式是半保留復(fù)制；釋放出來(lái)的病毒 毒基因組的早期基因轉(zhuǎn)錄翻譯成的早期蛋白，與啟動(dòng)子順式元件共同調(diào)控晚期基因的表達(dá)及 復(fù)制，隨之進(jìn)行結(jié)構(gòu)蛋白等的轉(zhuǎn)錄和 制。病毒80K 的末端蛋白與 制起始有關(guān)（ et 1983） ； 病毒復(fù)制中起重要作用，主要激活宿主與 白的熱激反應(yīng)（ et 2000） 。 （ 4）病毒粒子的成熟與釋放 ： 病毒包裝過(guò)程是在細(xì)胞質(zhì)中完成的 。細(xì)胞核內(nèi)早期蛋白與啟中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引 言 4 動(dòng)子順式元件共同調(diào)控晚期基因的表達(dá)，病毒利用細(xì)胞酶合成所需要的包裝蛋白，在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的共同作用下，包裝蛋白和增殖的子代病毒 細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)到胞質(zhì)內(nèi)。在這里，包裝蛋白與增殖的子代病毒 包裝為子代病毒粒子，最后以細(xì)胞裂解或胞吐的方式釋放病毒粒子。 目前用于檢測(cè) 毒存在的方法主要有包涵體檢查、病毒分離、電鏡檢查、病毒中和試驗(yàn)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ 術(shù)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ 前五種方法只能用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，對(duì)于大型養(yǎng)殖 場(chǎng)的現(xiàn)地檢測(cè)不適應(yīng)，發(fā)展新的特異性抗原建立快速簡(jiǎn)單有效的 劑盒檢測(cè)方法是消除健康雞體及生物制品中污染的 毒的有效途徑。 毒的 列全長(zhǎng) 43 804人腺病毒 約 8et 1996） 。病毒 基因組線狀雙鏈 有一個(gè) cba 型的獨(dú)特末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列 （ 確切功能還不知道 ， 據(jù)認(rèn)為其在 制中起著重要作用 （ et 1983） 。基因組 3端序列是保守序列，保守區(qū)長(zhǎng)度為 50核苷酸序列 （ Li et 1983） 。 毒主要結(jié)構(gòu)蛋白 （如圖 2） 有 、 和 、 、 、52K、 100K，其中 和 兩種蛋白是 毒獨(dú)有的 。 圖 2 2 of E 區(qū)序列 ： 毒與人腺病毒 同的是，它沒(méi)有可以識(shí)別的 。2k 00k B P A 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引 言 5 在 人腺病毒 調(diào)控病毒基因表達(dá)、 制和病毒 1 區(qū)缺乏是 毒的一大特點(diǎn)， 對(duì)病毒的轉(zhuǎn)化能力起到主要作用，對(duì)于 毒基因組中的其它 否有代替 的功能 還有待 通過(guò)基因缺失試驗(yàn) 來(lái)證明 。 毒沒(méi)有與人腺病毒基因組 源的序列的另外一種可能是基因組末端序列發(fā)生重排，使 不能檢測(cè)到 ，并認(rèn)為是 毒與輔助性腺 聯(lián) 病毒相互作用的結(jié)果 （ et 1996） 。 毒基因組中 含 有許多新的或未注冊(cè)的 些 0 31000碼 22 個(gè) 大于 99 個(gè)氨基酸殘基的蛋白，其功能有待于缺失分析進(jìn)一步研究，這些新的可能存在與 能相似的讀碼框 （ et 1998） ，因此，深入研究這些新的讀碼框就顯得非常重要。 毒兩端的 毒 間段與哺乳動(dòng)物腺病毒的序列同源，而兩端的22 個(gè) 哺乳動(dòng)物腺病毒的 無(wú)任何同源序列。這 22 個(gè) 只有 經(jīng)研究過(guò)了。 通過(guò)對(duì) 篩選研究發(fā)現(xiàn) ， 毒基因 組中右端的 碼一種 30該蛋白 具有 與 其他腺病毒 似的生物學(xué)特性，即抗凋亡活性，但是與之卻沒(méi)有同源序列 （ et 1979） ； 碼一種與視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤蛋白（ 互作用的蛋白，這種蛋白與人腺病毒 白相似 （ et 1997），具有誘導(dǎo)凋亡的活性； 毒的 亡蛋白和 物能激活 徑促進(jìn)細(xì)胞從 向 S 期的轉(zhuǎn)化，從而對(duì)病毒基因組的有效復(fù)制起著至關(guān)重要的作用 （ 1999）。 除了上述兩個(gè) ，在 因組的兩端還有其他幾個(gè)頗有特色的 中最引人注目的就是 它與細(xì)小病毒 因同源，但是它的功能尚不清楚。 通過(guò)蛋白水平分析 毒基因組序列， 對(duì) 9 等十幾個(gè)讀碼框的功能作了推測(cè)（ 2003），為進(jìn)一步研究這些基因的功能有著極為重要的指導(dǎo)意義。同時(shí)，他們還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新 認(rèn)為它們 能夠編碼蛋白，為其 它 毒毒力基因 究發(fā)現(xiàn) 編碼纖突蛋白的基因區(qū)與禽腺病毒的毒力和抗原性有關(guān)（ et 1996） 。 毒的兩個(gè) 因在每個(gè)渦上表達(dá)兩個(gè) 白 ， 一個(gè)長(zhǎng) 的 ，一個(gè)短 的 ，而且這兩個(gè)蛋白的多肽圖譜是不同的 （ 1995）。 對(duì) 毒 纖突蛋白功能分析表明， 基因 對(duì)病毒增殖、組裝或擴(kuò)散的某個(gè)階段是必須的，因?yàn)槿笔?基因 不能產(chǎn)生病毒粒子；而 基因 則對(duì) 毒的體 內(nèi)生物學(xué)的表現(xiàn)至關(guān)重要，缺失 基因 后會(huì)造成病毒產(chǎn)量下降，導(dǎo)致柯薩奇病毒和腺病毒受體（ 特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)作用消失，使毒只能感染禽類細(xì)胞，不能感染哺乳類動(dòng)物細(xì)胞 ， 失去野生型病毒表現(xiàn)出的特異性轉(zhuǎn)化作用 （ 2001） 。 在腺病毒結(jié)構(gòu)中 纖突蛋白在病毒擴(kuò)散中是重要結(jié)構(gòu)蛋白，也是病毒刺激宿主產(chǎn)生抗體的主要蛋白，能誘導(dǎo)產(chǎn)生血清中和性抗體 ，在纖突頭部還具有血凝素（ 殷震 等，1997） 。 毒 端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列 毒 端 具有末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列（ 哺 乳動(dòng)物腺病毒的 （ et 1982； et 1983）。 有資料證明 ， 腺病毒 制起始發(fā)生在末端 75 個(gè) 末端附近 （ et 1983）；對(duì) 毒來(lái)說(shuō) ，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引 言 6 其基因組兩端末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列 54是病毒 制的起始點(diǎn) ， 也是復(fù)制包裝必需的順式作用元件。 可以利用 毒兩端包裝信號(hào)、 腺聯(lián)病毒（ 末端重復(fù)序列（ 建成腺病毒微載體（ 這是一種新型的無(wú)病毒基因的載體 （ et 2000）。 毒的 因 和 白： 毒 因序列已經(jīng)報(bào)道（ et 1986）， 重要的 翻譯調(diào)控因子 ， 它通過(guò)封閉細(xì)胞 內(nèi)的由 干擾素誘導(dǎo)的蛋白 激 酶 （ 性 來(lái) 中和干擾素抗病毒 作用 （ et 1996） 。 毒的 白在病毒 裝過(guò)程中起到重要作用 ， 并且這種作用是型特異性的 （ 2001）。 近年來(lái)，腺病毒載體成為基因治療和重組疫苗研究方面的熱點(diǎn)。隨著分 子生物學(xué)的進(jìn)一步深入，腺病毒基因組結(jié)構(gòu)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的特征也已研究得相當(dāng)清楚，一些人腺病毒特別是 為載體的研究表明在腺病毒基因組特定區(qū)域插入外源基因，不影響病毒復(fù)制而能使外源基因良好表達(dá)，腺病毒作為活載體應(yīng)用較為安全。已經(jīng)發(fā)展為基因免疫和基因治療的轉(zhuǎn)移載體（ et 1999； et 2000； et 2000）。動(dòng)物腺病毒如牛、綿羊、豬、犬和禽類等腺病毒已開(kāi)始進(jìn)行深入研究，并取得較大進(jìn)展（ et 1999； et 999； et 2000）。禽腺病毒 基因組結(jié)構(gòu)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的特征大部分也已經(jīng)研究清楚（ et 1996 ； et 1998）。 隨著對(duì) 毒的生活周期、分子生物學(xué)、與疾病發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系等的認(rèn)識(shí)的不斷深化， 對(duì) 該病毒 的研究 逐漸 轉(zhuǎn) 向?qū)嵱?型 載體 開(kāi)發(fā)工作上。 腺病毒載體研究過(guò)程中存在的問(wèn)題是載體的安全性、靶向性和有效性 。 毒的 與 柯薩奇病毒和腺病毒受體（ 特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 的關(guān)系表明，可構(gòu)建 具有靶向特異性的載體，使疫苗具有更好的安全性和靶向特性；而較大的基因組確?？梢圆迦胼^長(zhǎng)的外源目的片段。病毒及載體可在雞胚中增殖，這樣在臨床應(yīng)用的過(guò)程當(dāng)中更簡(jiǎn)便節(jié)省。 毒 作為基因工程載體在基因水平上的研究： 重組腺病毒的構(gòu)建方法通常有三種，第一種方法是于真核細(xì)胞內(nèi)在兩段重疊的病毒 段之間同源重組，這個(gè)過(guò)程較難，且重組病毒 量稀少。第二種方法是在真核細(xì)胞中兩個(gè)質(zhì)粒之間應(yīng)用同源重組，一個(gè)含有完整的病毒基因組，并且有足夠的外源 止它包裝；另一個(gè)帶有經(jīng)過(guò)預(yù)期的修飾（插入、缺失）的同源序列經(jīng)兩 側(cè)到病毒基因組必須修飾的區(qū)段。第三種方法是直接通過(guò)體外分子克隆的方法構(gòu)建嵌合病毒。 毒載體的構(gòu)建策略可以按照第二種方法，先構(gòu)建帶有多克隆位點(diǎn)（ 報(bào)告基因和 毒基因組某段早期序列的穿梭質(zhì)粒，將外源基因的表達(dá)盒插入右側(cè) 之間；再構(gòu)建含非必需區(qū)基因缺失后的環(huán)狀腺病毒 粒；最后外源基因的穿梭質(zhì)粒與帶有環(huán)狀腺病毒 粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，同源重組獲得重組腺病毒。 大腸桿菌內(nèi)同源重組法獲得 的 毒的基因缺失重組突變體 的研究發(fā)現(xiàn) ，缺失 基因組左端 938可 從輔助菌中得到復(fù)制所需的多種調(diào)節(jié)因子；右端 40065（ et 1999） ；帶有熒光表達(dá)單位 （如達(dá)單位 ） 具有復(fù)制能力的 體已經(jīng)研制成功， 首次在鼠腫瘤細(xì)胞中表達(dá)攜帶在 毒載體上的 因，并且首次在 體感染的雞胚尿囊液中檢測(cè)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引 言 7 到人的 因的表達(dá)及該蛋白的富集 （ et 2002） 。有人利用柯斯質(zhì)粒構(gòu)建腺病毒載體的方法構(gòu)建的重組病毒也 具有產(chǎn)生感染性粒子的能力，并且估計(jì)其基因組在 胞中是穩(wěn)定的。缺失 毒右端 間 3620片段，插入約5外源 影響 毒載體的復(fù)制。將 兩段基因分別插入 毒的右端 D 片段，并且使該基因與 合 ， 由 動(dòng)子調(diào)控感染 胞，結(jié)果證明重組 重組蛋白也能從 體中表達(dá)并且具有完全的功能 （ et 2001）。 毒作為基因工程載體的應(yīng)用前景： 利 用 毒載體重組表達(dá)腫瘤抑制因子 測(cè)其在體外人的腫瘤細(xì)胞內(nèi)和體內(nèi)異種移植物內(nèi)的活性，結(jié)果顯示該載體可以攜帶外源基因進(jìn)入各種器官，而這些器官往往對(duì)人的腺病毒產(chǎn)生免疫反應(yīng)。同時(shí)重組腺病毒 然保存了 腫瘤抑制活性（ et 2004） 。 毒能插入的外源基因是有限的，而構(gòu)建只含有腺病毒末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列、包裝信號(hào)及中間的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的重組腺病毒載體的產(chǎn)生 ， 對(duì)發(fā)展新的基因治療方法的載體有極其重要的意義。 禽類疾病防治中，基因工程載體疫苗的制備可以應(yīng)用 制型 病毒 或復(fù)制缺陷性病毒作為載體，該病毒可感染禽源性細(xì)胞并在其中增 殖 ，研究表明 毒及突變載體能夠在來(lái)源于禽類細(xì)胞的 胞系上復(fù)制增殖 ，最新的研究表明利用 毒重組表達(dá)感染性法氏囊病病毒的 白可以在雞體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)傳染性法氏囊病病毒的保護(hù)（ et 2004）。因?yàn)?毒右端區(qū)段 （ 40 06584允許插入較大的外源片 段，已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一 ， 利用這一區(qū)域構(gòu)建 毒基因轉(zhuǎn)移載體，為 毒作為基因轉(zhuǎn)移工具提供 了 條件，毒及 其 載體可在廉價(jià)的雞胚中得到大量復(fù)制，因此， 可以預(yù) 料 毒 載