發(fā)育期大鼠反復(fù)癇性發(fā)作后遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶障礙及海馬神經(jīng)元可塑性的研究.doc

發(fā)育期大鼠反復(fù)癇性發(fā)作后遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶障礙及海馬神經(jīng)元可塑性的研究作者：羅平香,唐洪麗單位：東南大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 兒科學(xué)教研室，江蘇 南京 210009【摘要】 目的 探討發(fā)育期大鼠反復(fù)癇性發(fā)作對(duì)大鼠成年后學(xué)習(xí)記憶及海馬神經(jīng)元可塑性的影響。方法 生后10 d SD大鼠32只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組16只和對(duì)照組16只。實(shí)驗(yàn)組用戊四氮(PTZ)反復(fù)腹腔注射5 d，制成反復(fù)癇性發(fā)作模型，對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。在生后第60天用Morris水迷宮評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，用RTPCR方法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元可塑性標(biāo)志物神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(GAP43)mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果 與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組在Morris水迷宮測(cè)試中平均逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05),原平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間明顯縮短(P<0.05);海馬組織GAP43 mRNA的表達(dá)顯著增多(P<0.05)。結(jié)論 發(fā)育期大鼠反復(fù)癇性發(fā)作可引起遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶損害及海馬神經(jīng)元激活和突觸重建等神經(jīng)元可塑性改變，而GAP43表達(dá)增多可能是學(xué)習(xí)記憶功能和可塑性變化的分子機(jī)制。 【關(guān)鍵詞】 癲癇;發(fā)育;學(xué)習(xí)記憶;神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43;可塑性 Longterm effects on learning and memory and hippocamus neuroplasticityin immature rats following recurrent seizuresLUO Pingxiang,TANG Hongli(Department of Pediatrics,School of Clinical dicine,Southeast University,Nanjing 210009,China)bstract:Objective To explore the effects of recurrent seizures in immature rats on learning and memory and hippocamus neuroplasticity when the animals were in adulthood.Methods Rats at postnatal day 10(n=32)were divided into experimental group (n=16) and control group (n=16).Rats in the experimental group were treated with pentylenetetrazol(PTZ) daily by intraperitoneal injection for 5 consecutive days to induce recurrent seizure and rats in the control group were injected with normal saline for 5 consecutive days.All rats at postnatal day 60 were tested for spatial learning and memory by Morris water maze task.The expressions of GAP43mRNA,the marker for neuroplasticity in hippocampus were detected by reverse transcription polymerase chain reaction.Results In the experimental group, the mean escape latency of searching the platform significantly prolonged (P<0.05) and swimming time in the original platform region significantly shortened (P<0.05) in Morris water maze.The expression of GAP43 mRNA in hippocampus in the experimental group was significantly increased than that in the control group(P<0.05).Conclusion These findings indicate that recurrent seizure in immature rats have longterm detrimental effects on learning and memory and changes of hippocamus plasticity, such as synaptic reoganization and the action of neuron.GAP43 increasing may be the molecular mechanisms for learning and memory and hippocamus neuroplasticity.Key words:epilepsy;development;learning and memory;neuronalgrowth associated protein43;neuroplasticity(Modern Medical Journal,2009,37:333336)對(duì)成年動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn),反復(fù)癇性發(fā)作可引起海馬神經(jīng)元壞死、代償性苔蘚纖維發(fā)芽，導(dǎo)致突觸重組,形成異常通路，造成學(xué)習(xí)、記憶和行為的長(zhǎng)期缺陷1。未成熟腦處于不斷生長(zhǎng)發(fā)育、功能逐步完善的動(dòng)態(tài)變化之中，與成熟腦有很大的區(qū)別，目前對(duì)于發(fā)育鼠的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道尚少。本研究以戊四氮(pentylenetetrazol，PTZ)誘導(dǎo)生后10 d大鼠建立反復(fù)癇性發(fā)作模型，追蹤至大鼠成年后用Morris水迷宮評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，用RTPCR方法檢測(cè)大鼠海馬組織神經(jīng)元可塑性標(biāo)志物神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(neuronalgrowth associated protein,GAP43) mRNA的表達(dá)變化，探討發(fā)育期大鼠反復(fù)癇性發(fā)作可否引起遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶損害及海馬神經(jīng)元激活和突觸重建等神經(jīng)元可塑性的改變，并探討可能的分子機(jī)制。1 材料與方法1.1 材料及儀器PTZ(美國(guó)Sigma公司);GAP43、GADPH引物由上海生物工程公司合成，序列如下：GAP43上游引物5′ATGATGCTCCCGTTGCTGAT3′,下游引物5′GCACATCGGCTTGTTTAGGC3′，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度276 bp;GADPH上游引物5′CGGGAAGCTTGTCATCAATGG3′，下游引物5′GGCAGTGATGGCATGGACTG3′，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度358 bp;RNA提取試劑Trizol(美國(guó)Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司);Taq酶(日本TaKaRa公司);大鼠Morris水迷宮(中國(guó)藥科大學(xué))。1.2 動(dòng)物分組及模型制備生后10 d健康清潔級(jí)SD大鼠32只(由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,12 h光亮/黑暗條件,2225 環(huán)境溫度,由母鼠喂養(yǎng)，每窩崽數(shù)不超過(guò)10只),隨機(jī)分為PTZ模型組16只和生理鹽水對(duì)照組16只。參照文獻(xiàn)2提供的方法，模型組首次腹腔注射驚厥閾下劑量PTZ 40 mg•kg-1，10 min后注射20 mg•kg-1，以后每10 min注射10 mg•kg-1，直至出現(xiàn)4級(jí)以上的驚厥發(fā)作(發(fā)作的嚴(yán)重程度按照Lado幼鼠癲癇發(fā)作分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)3：0級(jí)，無(wú)發(fā)作;1級(jí)，機(jī)械性咀嚼;2級(jí)，連續(xù)性點(diǎn)頭;3級(jí)，單側(cè)前肢陣攣;3.5級(jí)，前肢交替陣攣;4級(jí)，雙側(cè)前肢陣攣、后退;5級(jí)，雙側(cè)前肢陣攣、后退、摔倒;6級(jí)，狂奔嘶叫;7級(jí)，強(qiáng)直發(fā)作)，如此反復(fù)注射5 d。對(duì)照組給予腹腔注射等量的生理鹽水。1.3 Morris水迷宮測(cè)試大鼠進(jìn)入成年(第60天)后，對(duì)模型組16只和對(duì)照組16只行Morris水迷宮測(cè)試，連續(xù)5 d，以評(píng)價(jià)其空間學(xué)習(xí)和記憶能力。程序包括：(1)定位航行實(shí)驗(yàn):用于檢測(cè)大鼠對(duì)水迷宮的學(xué)習(xí)和記憶能力。歷時(shí)4 d,每天8次,將大鼠從4個(gè)入水點(diǎn)面向池壁放入水中,記錄大鼠從入水到爬上平臺(tái)所需的時(shí)間(逃避潛伏期)。如果大鼠在120 s內(nèi)不能找到平臺(tái)，就將其引至平臺(tái)，將逃避潛伏期記為120 s。每次放大鼠入水前都要將其放在平臺(tái)上停留30 s，使其熟悉水迷宮周圍的標(biāo)志物，以便記憶平臺(tái)的位置。每次訓(xùn)練間隔60 s，取8次的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。(2)空間探索實(shí)驗(yàn):用于檢測(cè)大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后對(duì)平臺(tái)空間位置的記憶能力。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤除平臺(tái),然后將大鼠任選一入水點(diǎn)放入水中,測(cè)其120 s內(nèi)在原放有平臺(tái)的象限內(nèi)停留的時(shí)間。1.4 用RTPCR檢測(cè)海馬組織GAP43mRNA的表達(dá)完成Morris水迷宮測(cè)試后，直接斷頭取雙側(cè)海馬,生理鹽水沖洗后，置-80 冰箱中保存。采用Trizol一步法提取總RNA,按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。PCR擴(kuò)增條件：94 預(yù)變性5 min;94 變性45 s，55 (以引物序列后退火溫度為主)復(fù)性45 s，72 延伸1 min，這樣反復(fù)循環(huán)35次;72 延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液10 μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。用ImageMaster VDS圖像分析處理系統(tǒng)掃描，以GAP43/GAPDH吸光度比值作為GAP43 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 11. 5軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)用x-±s表示,組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 隨著大鼠學(xué)習(xí)次數(shù)增加,兩組大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期逐漸縮短。與對(duì)照組比較,模型組大鼠平均逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。見表1。表1 兩組大鼠逃避潛伏期的比較(2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 模型組大鼠120 s內(nèi)在原放有平臺(tái)的象限內(nèi)停留的時(shí)間為(35.63±5.17) s，而對(duì)照組為(52.59±6.98) s，兩組比較有顯著性差異(t=2.543,P<0.05)。2.2 海馬組織GAP43 mRNA的表達(dá)模型組GAP43 mRNA的相對(duì)吸光度值為0.628±0.103，與對(duì)照組(0.306±0.087)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.701,P<0.05)，見圖1。M.Marker; 1.對(duì)照組; 2.模型組圖1 大鼠生后第65天海馬GAP43 mRNA表達(dá)3 討 論大量臨床研究表明，在伴有海馬硬化性顳葉癲癇的成人患者中有相當(dāng)高的比例可追問(wèn)到兒童早期有反復(fù)癇性發(fā)作史，因此，幼年早期有過(guò)癇性發(fā)作對(duì)個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育有何長(zhǎng)遠(yuǎn)影響，一直是備受關(guān)注的問(wèn)題。近年來(lái)發(fā)育腦癲癇點(diǎn)燃模型研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育腦反復(fù)點(diǎn)燃后海馬神經(jīng)元并無(wú)明顯損傷，發(fā)育鼠經(jīng)歷比成熟鼠更長(zhǎng)的驚厥發(fā)作,神經(jīng)元脫失卻明顯低于成熟鼠,提示發(fā)育鼠腦內(nèi)可能存在保護(hù)機(jī)制4。但這種保護(hù)機(jī)制并不是絕對(duì)的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在Morris水迷宮測(cè)試中,與對(duì)照組比較,模型組大鼠平均逃避潛伏期顯著延長(zhǎng),原平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間明顯縮短，可見發(fā)育期大鼠反復(fù)癇性發(fā)作可引起遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶損害。GAP43是神經(jīng)元特異性胞膜磷酸蛋白，廣泛分布在神經(jīng)元中，特別在生長(zhǎng)、分化、再生的軸突末端含量極高，在神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)、發(fā)育、軸突再生以及突觸功能的維持方面起著重要作用，是當(dāng)今研究腦損傷修復(fù)和神經(jīng)可塑性的一種首選標(biāo)志物5。研究已證實(shí)大體有兩種類型突觸可塑性變化與GAP43的表達(dá)相關(guān):(1)突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)變化可導(dǎo)致GAP43表達(dá)的升高;(2)由長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(longterm potentiation,LTP)和長(zhǎng)時(shí)程抑制(longtermdepression,LTD)所引發(fā)的突觸效能的變化,可影響GAP43的磷酸化狀態(tài)和其mRNA的表達(dá)6。動(dòng)物過(guò)度表達(dá)高水平的外源基因編碼GAP43會(huì)導(dǎo)致異常的突觸聯(lián)系形成。將GAP43基因整合到非神經(jīng)細(xì)胞中可以誘導(dǎo)形成神經(jīng)突起樣偽足。癲癇動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，在伴隨動(dòng)物點(diǎn)燃后海馬苔蘚纖維出芽的同時(shí)，GAP43有明顯的表達(dá)增高。病理研究發(fā)現(xiàn)，癲癇患者神經(jīng)元壞死后隨之將有神經(jīng)元異常的側(cè)枝出芽及反應(yīng)性突觸再生，此時(shí)，GAP43的表達(dá)也明顯增加。轉(zhuǎn)基因鼠研究發(fā)現(xiàn)GAP43過(guò)量表達(dá)可引起神經(jīng)元異常重組的自發(fā)形成。在注射海人酸致大鼠癇性發(fā)作后2個(gè)月，在齒狀回內(nèi)分子層可出現(xiàn)較強(qiáng)的GAP43染色，與用Timm染色在內(nèi)分子層檢出的苔蘚纖維出芽有關(guān)7。本研究用RTPCR檢測(cè)海馬神經(jīng)可塑性標(biāo)志物GAP43，結(jié)果顯示模型組大鼠GAP43 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組，提示海馬有苔蘚纖維出芽和新突觸的形成，說(shuō)明發(fā)育期大鼠反復(fù)癇性發(fā)作后可引起遠(yuǎn)期海馬突觸重組及神經(jīng)元可塑性的改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，未成熟腦經(jīng)過(guò)反復(fù)癇性發(fā)作后導(dǎo)致遠(yuǎn)期海馬神經(jīng)元激活和突觸重建等海馬神經(jīng)元可塑性改變，而GAP43可能是這種可塑性變化的分子基礎(chǔ)。學(xué)習(xí)記憶是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，癲癇對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能損害的確切機(jī)制還不清楚。神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶功能的基礎(chǔ)，大量研究證明，改變突觸可塑性形成機(jī)制可影響學(xué)習(xí)和記憶，且在學(xué)習(xí)記憶的相關(guān)腦區(qū)可見突觸重塑8。本實(shí)驗(yàn)發(fā)育期大鼠反復(fù)癇性發(fā)作后引起認(rèn)知功能障礙可能與海馬神經(jīng)元之間形成異常的突觸聯(lián)系，建立病理性神經(jīng)環(huán)路等神經(jīng)元可塑性的改變有關(guān)。模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能損害的同時(shí)，海馬組織GAP43過(guò)度表達(dá)，猜測(cè)GAP43可能通過(guò)改變突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的可塑性以及由LTP和LTD所引發(fā)的突觸效能的可塑性,來(lái)參與體內(nèi)學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中的一系列環(huán)節(jié),它們對(duì)于突觸可塑性的作用是一個(gè)綜合、復(fù)雜的過(guò)程,其內(nèi)在機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。研究突觸可塑性的分子機(jī)制,對(duì)揭示學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)有重要意義。總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示發(fā)育期大鼠反復(fù)癇性發(fā)作后可導(dǎo)致遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶損害及海馬神經(jīng)元激活和突觸重建等神經(jīng)可塑性改變，提醒人們應(yīng)該關(guān)注早期腦發(fā)育中反復(fù)癇性發(fā)作的長(zhǎng)期結(jié)果。嬰幼兒時(shí)期大腦處于不斷生長(zhǎng)發(fā)育、功能逐步完善的動(dòng)態(tài)變化之中，神經(jīng)元可塑性較大，是各種腦損傷康復(fù)治療的最佳時(shí)期。但海馬齒狀回神經(jīng)元的再生過(guò)程和機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為受眾多因素的調(diào)節(jié)和影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示GAP43可能參與了神經(jīng)元再生過(guò)程的調(diào)節(jié)，可能是學(xué)習(xí)記憶功能和可塑性變化的分子機(jī)制，為嬰幼兒時(shí)期癇性發(fā)作腦損傷后康復(fù)治療提供了新的思路。而GAP43具體的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，有待更深入的研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 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