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Southern blot1. 提取植物總DNA (CTAB法)試劑：1) 2CTAB提取緩沖液0.1 mol/LTris-Cl (pH 8.0)1.4 mol/LNaCl20 mmol/LEDTA (pH 8.0)20 g/LCTAB 使用前加入2% (體積比) 的巰基乙醇。步驟：1) 提取前將植物材料在暗處放置24小時(shí)，以降低材料的淀粉含量。2) 剪取大約1g 葉片，置于研缽中，倒入液氮研成粉末，分裝入內(nèi)盛600 ml CTAB提取緩沖液（加2%巰基乙醇）的1.5 ml離心管中，混勻。3) 65水浴保溫1-1.5小時(shí)。4) 冷至室溫后加600ul 24:1的氯仿：異戊醇，混勻直到葉片粉末由綠轉(zhuǎn)白。5) 室溫下13,000 rpm離心10 min，吸取上層水相。6) 將上清再用等體積24:1的氯仿：異戊醇再抽提一次。13,000 rpm離心6 min。7) 取上層水相，加入2倍體積無(wú)水乙醇沉淀DNA。將絮狀的DNA沉淀挑出，用70%乙醇洗滌，晾干。8) 加適量滅菌的含RNase的去離子水，65保溫10min溶解沉淀。9) 取1ul走0.7%的瓊脂糖凝膠，檢測(cè)所提DNA的質(zhì)量。2. 制備探針（地高辛標(biāo)記）試劑：1) 5標(biāo)記緩沖液(5labeling buffer)：隨機(jī)6核苷酸 0.78mg/mlTris-Cl (pH 7.2) 0.25MMgCl2 50mM 二硫赤蘚糖醇(DTE) 0.5mMBSA 1mg/ml2) dNTP標(biāo)記混合物(dNTP labeling mixture):1mM dATP, 1mM dCTP, 1mM dGTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP; pH7.5A. Marker探針標(biāo)記 (隨機(jī)引物法)：1) 取3ug lDNA/HindIII Marker，用無(wú)菌水將體積補(bǔ)到13ul，沸水浴中煮10min，立即放入冰中。2) 冷卻后依次加入： 5labeling buffer 4ul BSA (10mg/ml) 0.4ul dNTP labeling mix 1ul Klenow 酶 1.6ul 3) 在37反應(yīng)20小時(shí)。 4) 加2ul EDTA(200mM, pH8.0)終止反應(yīng)。5) 加入1/10體積的4M LiCl (或者3M NaAC), 2.5-3倍體積的無(wú)水乙醇，20沉淀至少1小時(shí)。6) 13000rpm, 離心15min, 沉淀用70乙醇洗，吹干，50ul TE融解，20保存。*上述20ul標(biāo)記體系的探針產(chǎn)量約為890ng, 如果需要的探針量較大，可將模板量及其他成分相應(yīng)擴(kuò)大。B. 目的基因探針標(biāo)記(PCR法)： 以目的基因?yàn)槟０?，dNTP 采用dNTP labelling mix, 通過(guò)PCR反應(yīng)得到地高辛標(biāo)記的目的基因探針。3. 酶切 植物總DNA的用量一般為5-15 mg （例如水稻約為5ug, 蘭花和煙草約為12-15ug），選用在目的基因內(nèi)無(wú)切點(diǎn)或有單一切點(diǎn)的酶進(jìn)行酶切。同時(shí)切質(zhì)粒作為正對(duì)照，切未轉(zhuǎn)基因的植物材料的總DNA作為負(fù)對(duì)照。1) 酶切體系(以Hind切為例)：切200ul體系 總DNA 150ul (5-15ug) H2O 26ul buffer E 20ul Hind 2ul BSA 2ul 37酶切過(guò)夜。2) 取2ul電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。酶切完全的DNA應(yīng)呈均勻的彌散狀。3) 酶切完全后加水，將體積補(bǔ)充到600ul，加600ul 24:1的氯仿:異戊醇抽提，13,000 rpm 離心5 min，取上層水相。4) 加入1/25體積 的5M NaCl，2倍體積無(wú)水乙醇，20沉淀兩小時(shí)以上。5) 13,000 rpm 離心10 min，70% 乙醇洗滌沉淀，抽干。4. 電泳、轉(zhuǎn)膜試劑：溶液成分配方1M HClHCl17.24ml 濃HCl + 182.76ml H2O2M NaOHNaOH400ml H2O + 40g NaOH定容到500ml5M NaClNaCl400ml H2O +146.1g NaCl 加熱助溶 定容到500ml 滅菌1M Tris-Cl, pH7.5Tris, HCl800ml H2O +121.1g Tris + 濃HCl 65ml 1M HCl調(diào)pH至7.5 定容到1L 滅菌變性液(Denaturation solution)0.5M NaOH1.5M NaCl2M NaOH 100ml5M NaCl 120mlH2O 180ml中和液(Neutralization solution）0.5M Tris-Cl, pH7.53M NaClNaCl 70.13g1M Tris-Cl, pH7.5 200mlH2O 定容至 400ml20SSC3M NaCl0.3M 檸檬酸鈉pH7.0800ml H2O +175.3g NaCl + 88.2g檸檬酸鈉 用NaOH調(diào)pH至7.0 定容到1L 滅菌步驟：1) 用30 ml 水溶解酶切后沉淀的DNA，65水浴保溫10min，立即放到冰上。2) 冷卻后上樣品，走0.8% 瓊脂糖凝膠（進(jìn)口瓊脂糖），恒壓60V電泳34小時(shí)，電泳槽周圍加冰。樣品lDNA/HindIII Marker質(zhì)粒正對(duì)照未轉(zhuǎn)基因負(fù)對(duì)照轉(zhuǎn)基因材料上樣量35ng5ng5-15ug5-15ug3) 溴酚蘭距加樣孔6-8 cm左右時(shí)停止電泳。切掉加樣孔及多余的膠，切掉左下角作標(biāo)記。4） 將凝膠浸入200ml, 0.25 M HCl中進(jìn)行脫嘌呤處理約5-10 min (若檢測(cè)條帶都小于10kb，可省此步) 。5） 將凝膠取出在去離子水中漂洗一下后，浸入變性液中, 215 min6） 將凝膠取出，在去離子水中漂洗一下，然后浸入中和液中, 215min。7） 將凝膠取出在去離子水中漂洗一下后，進(jìn)行毛細(xì)轉(zhuǎn)移。8） DNA的毛細(xì)轉(zhuǎn)移：大培養(yǎng)皿中盛20SSC 上架玻璃板 玻璃板上鋪厚濾紙 趕氣泡 將凝膠加樣孔朝下放在濾紙橋上 周圍用Parafilm膜蓋住 膠上放等大的尼龍膜 趕氣泡 膜上放四層與膜等大的濾紙 趕氣泡 上放10 cm厚的紙巾 放玻璃板 上壓500 g重物。 9） 毛細(xì)轉(zhuǎn)移24 h，取出膜在2SSC中洗一下，夾于濾紙中，80烤膜2 h。5. 雜交:探針使用濃度雜交液雜交溫度DNA5-25ng/ml標(biāo)準(zhǔn)雜交液68標(biāo)準(zhǔn)雜交液50%甲酰胺37-42RNA100ng/ml標(biāo)準(zhǔn)雜交液50%甲酰胺50試劑：溶液成分配方10BR 10% Blocking Reagent (BR)2g BR+ 20ml buffer1 65水浴助溶，大約1h (或用微波爐低火力加熱，但不能沸騰) 完全溶解后，滅菌 -20儲(chǔ)存10% SDSSDS80ml H2O + 10g SDS 加熱助溶 定容到100ml2 % 十二烷基肌氨酸鈉十二烷基肌氨酸鈉(N-lauroylsarcosine)1g 十二烷基肌氨酸鈉+50ml H2O 完全溶解后，過(guò)濾除菌標(biāo)準(zhǔn)雜交液5SSC1% BR0.1%十二烷基肌氨酸鈉0.02% SDS20SSC 5ml10 BR 2ml2%十二烷基肌氨酸鈉 1ml10% SDS 40ulH2O 12ml標(biāo)準(zhǔn)雜交液50%甲酰胺50%甲酰胺5SSC1% BR0.1%十二烷基肌氨酸鈉0.02% SDS50%甲酰胺 10ml20SSC 5ml10 BR 2ml2%十二烷基肌氨酸鈉 1ml10% SDS 40ulH2O 2ml步驟：1）將膜浸入10 ml 雜交液中(標(biāo)準(zhǔn)雜交液50%甲酰胺)（20ml雜交液/100cm2膜），42 ，60 rpm預(yù)雜交，至少1小時(shí)。2) 倒掉雜交液，將DNA探針在100變性10 min后，立即放到冰上，冷卻2 min后加入10 ml雜交液中，然后倒入雜交瓶中，42， 60 rpm雜交1216小時(shí)。3) 雜交結(jié)束，回收雜交液，20可保存1年，再用時(shí)95加熱10min，有甲酰胺時(shí)，68 10min。6. 洗膜：1）2SSC0.1% SDS，室溫 60 rpm 洗滌25 min2）0.1SSC0.1% SDS，60 rpm 洗滌215 min。探針長(zhǎng)度大于100bp時(shí)，68洗；短于100bp時(shí)，洗滌溫度同雜交溫度。7. 檢測(cè)：應(yīng)用顯色法，所有操作都在室溫進(jìn)行試劑：溶液成分配方1M馬來(lái)酸馬來(lái)酸（maleic acid）400ml H2O +58.04g maleic acid 定容到500mlBuffer 10.1M maleic acid0.15M NaClpH7.51M maleic acid 100ml5M NaCl 30mlH2O 870ml用固體NaOH調(diào)pH至7.5Buffer 2Buffer 11BR現(xiàn)用現(xiàn)配10BR 2mlBuffer 1 18ml1M Tris-Cl, pH9.5Tris, HCl400ml H2O + 60.5g Tris HCl調(diào)pH至9.5 定容到500ml 滅菌1M MgCl2MgCl2200ml H2O + 50.83g MgCl2 6H2O定容到250ml 滅菌Buffer 3100mM Tris-Cl, pH9.5100mM NaCl50mM MgCl21M Tris-Cl, pH9.5 50ml5M NaCl 10ml1M MgCl2 25mlH2O 415mlBuffer 410mM Tris-Cl1mM EDTApH8.01M Tris-Cl, pH8.0 5ml0.5M EDTA, pH8.0 1mlH2O 494ml步驟：1）用buffer 1浸膜1min。2）用10ml buffer 2封閉，30min，輕搖。3）用buffer 2稀釋地高辛抗體，Anti-DIG-AP: buffer 2 = 1: 5000。例如10ml buffer 2中加入2ul抗體。4)