葉綠體的提取及ATP酶活性的測定

葉綠體的提取及ATP酶活性的測定 摘要：在本實驗中通過測定常青藤葉片組織中葉綠體的含量以及ATP酶的活性，間接的探討該植物的光合作用強度。關鍵字：葉綠體 ATP酶活性 光和作用前言 葉綠體是植物細胞中由雙層膜圍成，含有葉綠素能進行光合作用的細胞器。組織中葉綠體的含量多少，能夠間接的反應植物在這一段時間內的光合作用強度，ATP是三磷酸腺苷，ATP的分子式可以簡寫成A-PPP，簡式中的A代表腺苷，P代表磷酸基團，代表一種特殊的化學鍵，叫做高能磷酸鍵。ATP的水解實際上是指ATP分子中高能磷酸鍵的水解。高能磷酸鍵水解時能夠釋放出大量的能量，ATP分子中大量的化學能就儲存在高能磷酸鍵中。試驗中通過測量ATP水解出來的P+，通過這種循環(huán)往復的電子傳遞實現(xiàn)了光能向化學能的轉化，在這一過程中葉綠體起到了至關重要的作用。1. 實驗材料與方法1.1 實驗材料 小麥幼苗 離心機 水浴鍋 分光光度計 燒杯 容量瓶 試管 移液槍 鋁紙 蒸餾水等 STN緩沖液 無機磷標準液 37水浴鍋、照光設備（光源50000Lx）、臺式低溫冷凍離心機（配套的離心管）及冰箱、研缽、移液槍全套、小漏斗、容量瓶（500ml、100ml）等。1.1.1 試劑： Tris-HCl緩沖液1mol/L（pH8.0）：稱60.57g Tris溶于400ml蒸餾水中，用濃鹽酸調至pH8.0，再加蒸餾水至500ml。10硫酸鉬酸銨溶液：稱10g鉬酸銨溶于100ml5mol/L 硫酸中5mol/L 硫酸溶液：取27.8ml（比重1.84）濃硫酸，慢慢加入到70ml蒸餾水中，冷卻后定容至100ml。STN緩沖液，將0.05mol/L Tris-HClpH7.8緩沖液（內含0.4mol/L 蔗糖、0.01mol/L NaCl)放入冰箱中預冷。硫酸亞鐵鉬酸銨試劑：稱14.2857g硫酸亞鐵，加入7.14ml硫酸鉬酸銨，再加蒸餾水稀釋到100ml，直至溶解為止（由于亞鐵極易被氧化，因此要先配現(xiàn)用）。1.1.2 材料及預處理 取新鮮的干凈植物莖葉于光照培養(yǎng)箱（光照22）處理30min，隨后移入冰箱冷處理10min，待用。1.2 試驗原理 ATP酶可催化ATP水解生成ADP及無機磷的反應，在生物學研究中，常通過測定酶促反應釋放的無機磷量或ATP的減少量以及pH變化等來測定這一生理反應中ATP酶的活力高低。本實驗通過測酶促反應過程中無機磷的釋放量來測定葉綠體偶聯(lián)因子ATP酶的活力。1.3 試驗步驟1.3.1 葉綠體的制備及葉綠素含量測定 準備好的試樣，用去除葉柄和中脈同時用剪刀剪碎，準確稱取4.17g，置于是事先在冰箱中處理的研缽中，加入10ml預冷的STN緩沖液，很快研磨或搗碎（0.5min完成，研磨的手法了力度要適當，過輕過重均會導致實驗的失敗），使之成為勻漿，以四層紗布過濾去粗渣，濾液于02下，1500g離心約5min。去除將上清液，加入少許（0.3ml）STN（pH7.8）于沉淀中配成葉綠體懸浮液（使葉綠素的含量在0.5mg/ml左右），待用。1.3.2 葉綠素含量的測定取從上述懸浮液0.1ml，加0.9ml水和4ml95%的乙醇于干凈的試管中于652nm測其吸光度（吸光度值因保證在0.34以上才有意義），吸光度事先用95%乙醇標定調零并按Arnon公式計算：葉綠素含量A65210005/(34.510000.1)A6521.45mg/ml；式中：A652652nm處的吸光值；經測定實驗的葉綠體吸光度值為0.698，因此，具有繼續(xù)測定ATP酶的意義。1.3.3 ATP酶的激活激活過程：將上述經檢驗符合要求的試液，加入一定量的STN（pH7.8）配成4ml的懸浮液（實驗在檢驗的基礎上加入STN3.8ml），震蕩并置于于照光設備（白熾光50000Lx）22下進行光激活6min。反應過程：取三支干凈的試管，編號（分別為對照、處理1、處理2）分別加入上述激活后的葉綠體懸浮液各1ml，再加入1ml的反應液，用1ml蒸餾水作對照。將三支試管置于37水浴中保溫10min，快速順次（以先放先加為原則）加入0.5mlTCA終止液。比色階段：再在上述試液中加入1ml顯色液，充分震蕩。在事先用STN標定調零的655nm波長下比色，測其吸光值，結合標準曲線，求其無機磷的含量；2.實驗結果與分析2.1葉綠素含量的測定在實驗開始時確稱取新鮮植物葉片4.17g，經葉綠素測定器吸光度值為0.750，符合實驗要求，按Arnon公式計算：葉綠素含量A65210005/(34.510000.1)A6521.45mg/ml；得葉綠素含量為1.0875mg/ml0.5mg/ml，符合實驗要求：葉綠體懸浮液中葉綠素的含量在0.5mg/ml左右，實驗具有可操作性，能夠經行下一步的測量。 試驗中取6支試管編號，1-6號管分別加入無機磷標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml及蒸餾水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml，再加入0.5ml終止液和1ml顯色液，混勻后于655nm出測定吸光值，繪制吸光值-無機磷含量標準曲線。2.2 葉綠體ATP酶活性的測定表2 在655nm下測得的吸光度的測定值編號123平均對 照0.7400.7350.7450.740處理10.8450.8460.8470.846處理20.8250.8250.8130.821在實驗中常常用單位時間單位質量無機磷物質的量的多少來間接反映ATP酶活性的高低，所以通過測定無機磷的的含量，來確定ATP酶的活性，為實際的農業(yè)生產提供理論指導。表3 ATP酶活性指數(shù)的測定數(shù)據(jù)表Table 3：The ATP enzyme vigor index measured value 吸光度值對應的Pi含量/ug測得的有效Pi含 量/ugATPase活力/umol.(mg.h)-1處理0.7453.005360.2148310對照0.6872.28503：討論ATP 酶的活性與光合磷酸化活性的關系非常密切,如果 ATP酶活性下降,則光合磷酸化活性下降,葉片中ATP含量減少,這樣勢必影響到葉片的光合作用速 率?？梢夾TP酶活性與光合作用的關系是緊密相連的。經過光照預處理的植物葉片，最終測得的葉綠體的酶活力為312umol/(mg.h)。葉綠體將光能轉化為活躍的化學能, 并貯存在ATP中,產生的ATP的數(shù)量就越多, 為光合作用的暗反應提供的“同化力”就越多, 有利于光合作用CO2的固定和同化, 產生較多的光合產物, 從而其光合效率高。參考文獻1李良壁,張正東,譚光輝等.植物葉綠體互補作用的研究.遺傳學報,1978,3: