實驗：細胞化學染色POX

細胞化學染色 滄州醫(yī)專醫(yī)學技術(shù)系侯振江 細胞化學染色 是一種以形態(tài)為基礎 結(jié)合運用化學或生物化學技術(shù)對血細胞內(nèi)各種化學成分作定位 定性及半定量分析的方法 用于研究血細胞生理 病理和化學結(jié)構(gòu) 臨床上為某些血液病的診斷 鑒別診斷 療效觀察 預后監(jiān)測和發(fā)病機制的探討 提供重要依據(jù) 血細胞化學染色的基本要求是在原位顯示細胞成分和結(jié)構(gòu) 反應產(chǎn)物應是有色沉淀物 具有一定的穩(wěn)定性 血細胞化學染色可顯示糖原 脂類 酶 蛋白質(zhì)等 一 固定固定有物理法與化學法 物理法為干燥和火焰固定 化學法最常用的是甲醛 乙醇 丙酮和醋酸等 血細胞化學染色流程 二 顯示1 偶氮偶聯(lián)法 利用人工合成的酶底物 在酶作用下 產(chǎn)生分解產(chǎn)物 再與重氮鹽結(jié)合引起偶氮偶聯(lián) 使其形成不溶性的偶氮色素 以此證明酶的存在 2 聯(lián)苯胺法 粒細胞和單核細胞中的過氧化物酶作用于過氧化氫 釋放新生態(tài)氧 使無色的聯(lián)苯胺形成藍色沉淀 3 普魯士藍法 細胞內(nèi) 外鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用 形成藍色亞鐵氰化鐵沉淀 4 雪夫反應 過碘酸氧化細胞內(nèi)糖類中乙二醇基形成乙醛基 醛基與雪夫試劑作用 使無色品紅形成紅色沉淀 5 金屬沉著法其他尚有物理學方法 如脂溶性染料染色 顯示脂質(zhì) 熒光顯示 放射自顯影以及體外活體染色亦常用于臨床血液細胞學診斷 三 細胞化學定量粗略估量 以染色反應的強弱 受色的深淺 人為地區(qū)別為陰性和各種程度的陽性 百分法 只能反映細胞陽性率 不能反映受色強弱 積分法 是常用的半定量法 將等級估量與百分率相結(jié)合它既反映了細胞陽性率的高低 又反映了細胞受色的強弱 下面介紹幾種常用的細胞化學染色方法這些方法學在白血病的鑒別診斷上具有重要意義 一 過氧化物酶染色 POX 一 四甲基聯(lián)苯胺法 TMB 原理 粒細胞和單核細胞的胞漿內(nèi)的髓過氧化物酶 POXorMPO 分解過氧化氫 釋放新生態(tài)氧 使無色聯(lián)苯胺氧化成藍色聯(lián)苯胺 后者進一步變成棕色化合物沉著于細胞質(zhì)內(nèi) POX 新生態(tài)氧 O 過氧化氫 基質(zhì)中 四甲基聯(lián)苯胺TMB 無色 聯(lián)苯胺藍 藍色 亞硝基鐵氰化鈉 藍色顆粒 漿內(nèi)酶部位 粒 單核細胞胞漿 原理 四甲基苯醌二胺 棕色 自我脫氫氧化 試劑 1 TMB亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液1 過氧化氫溶液稀過氧化氫溶液瑞氏染色液 操作 1 取0 1 TMB乙醇溶液lml 加亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液10 l 混合溶液呈淡棕黃色 2 在新鮮干燥的血片上 加混合溶液0 5ml 放置lmin后 再加稀過氧化氫溶液0 7ml 染色6min 3 瑞氏染液復染15 20min 4 油鏡鏡檢 結(jié)果 細胞質(zhì)內(nèi)有藍黑色顆粒者為陽性 無顆粒沉著 顆粒細小 分布稀疏 顆粒較粗 局灶分布 顆粒粗大 分布較密 占胞質(zhì)1 2 2 3 顆粒粗大 呈團塊分布 全部胞質(zhì)均部滿顆粒 可覆蓋胞核 骨髓片POX染色 臨床意義 1 粒系 POX主要分布在粒細胞和單核細胞內(nèi) 隨著粒細胞成熟的程度而逐漸增強 中性分葉核粒細胞為強陽性 嗜酸性粒細胞陽性程度最強 其陽性顆粒比中性粒細胞粗大 有折光 堿性粒細胞為陰性 2 單核細胞 原始單核細胞為陰性反應 幼稚單核細胞和成熟單核細胞呈弱陽性反應 顆粒細小 彌散分布 3 其他細胞淋巴細胞 漿細胞 幼紅細胞 組織細胞 巨核細胞均呈陰性反應 4 血小板過氧化物酶主要定位于幼稚型巨核細胞的核膜上 可作為原巨核細胞的一種標志物 有助于FABM7的識別 5 過氧化物酶染色主要用于鑒別急性白血病類型 急性髓細胞白血病多呈陽性反應 以M3和M2型反應最強 MI和M5型反應較弱 故有助于區(qū)別M3和M5型 急性淋巴細胞白血病呈POX陰性反應 故為急性髓細胞和淋巴細胞白血病鑒別的重要指標 注意事項 涂片應新鮮制作 厚薄適宜 TMB配制在85 88 的乙醇溶液中染色效果較好 勿用90 95 乙醇 否則細胞表面蛋白質(zhì)很快凝固 妨礙試劑向胞內(nèi)滲入而使顯色反應減弱或消失 過氧化氫溶液需新鮮配制 其濃度與加入量不能隨意更改 涂片中粒細胞看不見陽性顆粒 紅細胞呈棕色或綠色 即表示過氧化氫過濃 若過氧化氫加于血片上不產(chǎn)生氣泡 則示無效 染色液適宜pH值應為5 5 若pH值 5 0會出現(xiàn)假陽性結(jié)果 試劑應置于低溫暗處 防止光線照射失效 染色時加稀過氧化氫溶液之后必須與染色液充分混勻 否則同一片子上細胞染色情況不一致 AML M1 M1 POX 二 蘇丹黑B染色 原理 蘇丹黑B sudanblackB SB 是一種能溶解于脂肪中的色素染料 可使細胞內(nèi)的中性脂肪 磷脂和類固醇著色 即使細胞內(nèi)微細結(jié)構(gòu)的脂類物質(zhì)也能顯示出來 試劑 1 10 甲醛液 2 蘇丹黑B乙醇溶液 操作 1 干燥血片或骨髓片在甲醛蒸氣中固定 2 自來水沖洗 3 放人染色液中 37 染色30 60min 4 用70 乙醇脫色1 2min 水洗lmin 5 瑞氏染液復染20 30min 結(jié)果 脂類呈黑色或棕黑色顆粒 定位于細胞漿中 顆粒很小 細小 稀疏 或胞質(zhì)局部面積的1 4有致密的顆粒 顆粒較少 或胞質(zhì)面積的1 2出現(xiàn)黑色顆粒 顆粒較密 或胞質(zhì)面積的3 4出現(xiàn)黑色顆粒 顆粒極密 顆粒間無間隙 臨床意義 1 粒細胞系早幼粒及以下階段隨著細胞成熟 陽性顆粒逐漸增加 早期原粒細胞一般為陰性 少數(shù)細小點狀顆粒代表線粒體被染色晚期原粒細胞可出現(xiàn)陽性顆粒 其顆粒限于胞漿的某一區(qū)域 2 單核細胞系陽性 顆粒細小 分布彌散 形狀不規(guī)則 原單核細胞為陰性 3 紅細胞系 淋巴細胞系均呈陰性反應4 尼曼一匹克細胞和戈謝細胞均為陽性反應 5 蘇丹黑B和過氧化物酶染色臨床意義相似 主要用于急性白血病類型的鑒別 蘇丹黑B染色較過氧化物酶染色更敏感 但特異性不如過氧化物酶染色 極少數(shù)急性淋巴細胞白血病可為陽性 M1 SBB M2 SBB 三 過碘酸一雪夫 PAS 染色 原理 胞漿內(nèi)存在糖原或多糖類物質(zhì) 如粘多糖 粘蛋白 糖蛋白 糖脂等 中的乙二醇基 CHOH CHOH 經(jīng)過碘酸 periodicacid 氧化 轉(zhuǎn)變?yōu)槎┗?CHO CHO 與雪夫 Schiff 試劑中的無色品紅結(jié)合 形成紫紅色染料而沉積于胞漿中 該反應稱為過碘酸一雪夫 PAS 陽性反應 結(jié)果 1 粒細胞系 原粒細胞多呈陰性反應 也可弱陽性 自早幼粒細胞以后隨著細胞的成熟程度 陽性反應逐漸增強 嗜酸粒細胞顆粒本身不著色 但顆粒間的胞質(zhì)呈彌漫性陽性反應 嗜堿粒細胞為陽性反應 顆粒紫紅色 大小不一 中性粒細胞糖原含量參考標準 胞質(zhì)無顆粒 胞質(zhì)呈淡紅色 無顆粒 胞質(zhì)呈紅色 有少量顆粒 胞質(zhì)呈暗紅色 顆粒較密 胞質(zhì)呈紫紅色 顆粒極密 過碘酸 Schiff反應 PAS 2 淋巴細胞系 大多數(shù)淋巴細胞呈陰性反應 少數(shù)為 的陽性反應 淋巴細胞糖原含量程度參考標準 胞質(zhì)內(nèi)無顆粒 胞質(zhì)內(nèi)有顆粒 有較粗紅色顆粒 有粗大紅色顆粒 顆粒粗大并有紅色塊狀 3 紅細胞系 幼紅細胞和紅細胞呈陰性反應紅細胞系列糖原含量程度參考標準 胞質(zhì)無顆粒 有少數(shù)紅色顆粒 有較粗紅色顆?；驈浡t色 有粗大紅色顆粒或深紅色 有粗大紅色塊狀或紫紅色 4 巨核細胞 巨核細胞和血小板染色反應均為陽性巨核細胞糖原含量程度參考標準 胞質(zhì)無顆粒 少量糖原包涵體 中等量糖原包涵體 定位于核膜出或分散胞質(zhì)中 占胞質(zhì)1 3 大量糖原包涵體分散于胞質(zhì)的1 2 糖原包涵體充滿整個胞質(zhì) PAS巨核細胞 巨核細胞包涵體 5 單核細胞呈陰性或陽性 顆粒細小 往往位于胞質(zhì)邊緣 漿細胞大多呈陰性 少數(shù)為紅色顆粒陽性 組織細胞為陰性反應 巨噬細胞可呈陽性 為紅色顆粒反應 臨床意義 1 M6與巨幼貧的鑒別M6的幼紅細胞PAS可呈強陽性 積分明顯增高 巨貧 再障 溶貧時PAS反應為陰性 2 急性白血病的類型鑒別ALL PAS呈大塊狀陽性 也可是陰性 AML為陰性 急性單核細胞白血病時原單核細胞及幼單核細胞PAS陽性 積分增高 陽性顆粒小而多 呈彌散分布 ALL L1 L1PAS AML M5 M5PAS AML M6 AML M6PAS AML M7 M7PAS 3 巨核細胞和Sternberg細胞鑒別巨核細胞PAS強陽性 Sternberg細胞為陰性或弱陽性 4 戈謝氏細胞強陽性 尼曼 皮克細胞陰性或弱陽性 5 淋巴肉瘤 霍奇金病等 淋巴細胞的糖原積分增高 一般的病毒感染 糖原積分在正常范圍內(nèi) 四 中性粒細胞堿性磷酸酶染色 偶氮偶聯(lián)法 Kaplow法 原理 中性粒細胞胞漿中的堿性磷酸酶在pH9 2 9 8緩沖液中 能水解磷酸萘酚鈉 并釋放出磷酸與萘酚 再以重氮鹽與萘酚偶聯(lián)成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞漿中 結(jié)果 堅牢藍RR陽性為紫黑色顆粒 堅牢紫醬GBC陽性為棕紅色沉淀 一 陰性反應 胞漿中無陽性染色顆粒 胞漿中含有少量顆?；虺蕪浬\紅色 或彌散紫色 2 胞漿中含有中等量顆粒或彌散受色 3 胞漿中有豐富的顆?；驈浬⑸钌?胞核清晰 4 有極豐富的粗大顆粒 充滿胞漿 或彌散深色 胞核不清晰 中性粒細胞堿性磷酸酶 NAP 偶氮偶聯(lián)法 NAP積分法計數(shù)100個成熟中性粒細胞 按其反應強度分級 各級百分率與其級數(shù)乘積的總和 即為積分 例如 NAP反應結(jié)果 204020155積分 0 20 2 20 3 15 4 5 145參考值 正常人血細胞堿性磷酸酶除成熟中性粒細胞 桿狀核及分葉核 可見陽性外 其他血細胞均為陰性 中性粒細胞NAP活性積分值一般為10 50分 但有時可高達162分 臨床意義 1 生理變化 新生兒NAP增高 成人較兒童減低 老人更低 激烈運動增高 月經(jīng)期經(jīng)前增高 行經(jīng)后降低 經(jīng)后期恢復正常 妊娠期2 3月輕度增高 以后逐漸增高 分娩時達到高峰 產(chǎn)后恢復正常 2 病理變化增高 嚴重化膿性感染 類白血病反應 AA CML加速期 ALL CLL 惡性淋巴瘤 癌轉(zhuǎn)移 MM 真紅 骨髓纖維化等 減低 PNH CML 惡性組織細胞病 MDS 3 疾病鑒別診斷慢粒與類白的鑒別 CML減低 類白增高 急性白血病的鑒別 AML減低 ALL增高 PNH與AA鑒別 PNH減低 AA增高 病原微生物的鑒別 病毒感染減低 細菌感染增高 NAP CML NAP 五 骨髓鐵染色 原理 正常人骨髓中的貯存鐵主要存在于骨髓小粒和幼紅細胞中 骨髓中的鐵在酸性環(huán)境下與亞鐵氰化鉀作用 形成普魯士藍反應 形成藍色的亞鐵氰化鐵沉淀 定位于含鐵的部位 從而反映骨髓中鐵的儲存量 化學反應過程為 4Fe3 3K4 Fe CN 6 Fe4 Fe CN 6 3 12K 含鐵物質(zhì) 亞鐵氰化鉀 亞鐵氰化鐵 結(jié)果 1 細胞外鐵的觀察 細胞外鐵呈藍色的顆粒狀 小株狀或團塊狀 以油鏡觀察定級標準 無鐵粒可見 少數(shù)鐵?；蜩F小珠 較多鐵粒和鐵小珠 很多鐵粒 鐵小珠和少數(shù)小塊 極多鐵粒 鐵小珠并有很多小塊 密集成堆 正常范圍 占2 3 占1 3 細胞外鐵 2 細胞內(nèi)鐵觀察 細胞內(nèi)鐵指有核紅細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍色顆粒 以油鏡計100個中 晚幼紅細胞 記錄胞質(zhì)中含有藍色小顆粒 即鐵粒紅細胞 的比值 并根據(jù)細胞鐵顆粒的數(shù)目 大小 染色深淺和顆粒分布情況 將鐵粒幼紅細胞分為如下四型 型 僅含1 2個鐵顆粒 型 含3 4個鐵顆粒 型 含6 9個以上鐵顆粒 型 10個鐵顆粒 正常范圍 30 90 平均60 多見 型 少見 型 無 型 細胞內(nèi)鐵 3 環(huán)形鐵粒幼紅細胞 指含鐵顆粒 6個 其中2 3以上鐵顆粒圍繞核周排列成完整環(huán)形或不完整環(huán)形 正常或非鐵粒幼細貧血無環(huán)形鐵粒幼細胞 鐵粒幼細貧血中環(huán)形鐵粒幼細胞 6 環(huán)形鐵粒幼細胞 臨床意義 1 缺鐵性貧血時 骨髓細胞外鐵明顯減少 為 一 士 細胞內(nèi)鐵平