不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)流行性乙型腦炎病毒感染的影響.doc

不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)流行性乙型腦炎病毒感染的影響 研究論文中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)流行性乙型腦炎病毒感染的影響徐曉偉1,2，魏建超2，劉珂2，邵東華2，李蓓蓓2，曹瑞兵3，陳溥言3，馬志永2，胡敬東1,邱亞峰2（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安271018；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海xx41；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京210095）摘要為了研究不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)流行性乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）感染的影響，并明確NO的產(chǎn)生在此過程中的作用，利用細(xì)胞因子將小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7誘導(dǎo)成不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)細(xì)胞，通過TCID 50、免疫熒光技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法比較JEV強(qiáng)毒株NJxx在不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞上的感染情況，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析了調(diào)控NO產(chǎn)生的關(guān)鍵分子（iNOS和Agr1）的變化。 結(jié)果顯示，相對(duì)于PBS處理組，M1型巨噬細(xì)胞顯著地抑制JEV的感染并伴隨明顯增加的iNOS/Arg1比值；而M2型巨噬細(xì)胞雖伴隨有顯著降低的iNOS/Arg1比值，但JEV在M2型巨噬細(xì)胞上的感染與PBS組差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果表明NO的上調(diào)表達(dá)在M1型巨噬細(xì)胞抑制JEV感染中起著主導(dǎo)作用。 本研究為進(jìn)一步揭示巨噬細(xì)胞在JEV感染中作用奠定基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞流行性乙型腦炎病毒；巨噬細(xì)胞；M1型巨噬細(xì)胞；M2型巨噬細(xì)胞S852.659.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼A1674-6422 （2019）02-0001-05PARATIVE ANALYSISOF JAPANESEENCEPHALITIS VIRUSINFECTION INMACROPHAGES WITHDIFFERENT POLARIZEDPHENOTYPESXU Xiao-wei1,2,WEI Jian-chao2,LIU Ke2,SHAO Dong-hua2,LI Bei-bei2,CAO Rui-bing3CHEN Pu-yan3,MA Zhi-yong2,HU Jing-dong1,QIU Ya-feng2(1.College ofAnimal Scienceand Technology,Shandong AgriculturalUniversity,Taian271018,China;2.Shanghai VeterinaryResearch Institute,CAAS,Shanghaixx41,China;3.College ofVeterinary Medicine,Nanjing AgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)2018-06-08基金項(xiàng)目上海市自然基金（15ZR1449800）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（xxYFD0500404）；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才項(xiàng)目（CAASQNYC-KYYJ-26）作者簡(jiǎn)介徐曉偉，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)通信作者胡敬東，E-mailhjd1968163.；邱亞峰，E-mailyafengqshvri.ac.2019,27 (2):1-5Abstract:The effectof macrophages with different activated phenotypeson Japanese encephalitis virus(JEV)infection wasstudied withtitration(TCID50),immunof luorescence assayand real-time qPCR.Mouse macrophageswere polarizedby differentcytokines includingIFN-or IL-4and the role ofNO productionduring JEV infection wasanalyzed interms ofexpression of iNOS and Arg1by usingreal-time qPCR.The resultsshowed thatM1macrophages withincreased ratioof iNOS/Arg1clearly inhibitedJEV infectionas paredwith PBS-treated macrophages.In contrast,M2macrophages withdecreased ratioof iNOS/Arg1showed noeffect onJEV infection in22019年4月中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)parison ofPBS-treated controls.These resultsdemonstrated thatmacrophageswithdifferent polarizedphenotypes playeddifferent roles in JEVinfection.Furthermore,the up-regulation ofNO inM1macrophages mainlycontributed toinhibition of JEVinfection.Thus,this studyprovided thebasis ofbetter understandingtheroleof macrophagesin JEVinfection.Key words:Japanese encephalitis virus;macrophage;M1macrophage;M2macrophage流行性乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是一種神經(jīng)嗜性的黃病毒1。 該病毒通過蚊子傳播，可感染水鳥、豬、犬等多種宿主，表現(xiàn)為病毒性腦炎，又稱日本乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE）。 人和馬是JEV的終末宿主。 JE的分布具有一定的區(qū)域性，主要分布在南亞和東南亞地區(qū)。 根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，JEV感染每年可導(dǎo)致1000015000人死亡2-3。 JEV感染具有重要的公共衛(wèi)生意義，但是，目前對(duì)JE的免疫致病機(jī)制的理解還不十分清楚。 巨噬細(xì)胞是機(jī)體的主要免疫細(xì)胞，在宿主的先天性免疫和獲得性免疫反應(yīng)中都起著重要的作用。 在蚊子叮咬過程中，巨噬細(xì)胞如朗漢斯細(xì)胞是最先識(shí)別JEV感染的免疫細(xì)胞。 研究顯示，相對(duì)于非免疫細(xì)胞如Vero細(xì)胞4、MEF細(xì)胞等5，巨噬細(xì)胞具有明顯的抑制JEV感染作用，這與巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)快速及高水平的I型干擾素相關(guān)。 另外，激活的巨噬細(xì)胞如IFN-誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞，可通過促進(jìn)NO的產(chǎn)生抑制JEV的復(fù)制6。 因此，巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)影響JEV的感染。 根據(jù)激活狀態(tài)，巨噬細(xì)胞主要分為M1型巨噬細(xì)胞（主要由Th1細(xì)胞因子如IFN-等誘導(dǎo)產(chǎn)生）、M2型巨噬細(xì)胞（主要由Th2細(xì)胞因子如IL-4等誘導(dǎo)產(chǎn)生）7-8。 雖然已有的研究顯示M1型巨噬細(xì)胞可通過促進(jìn)NO的產(chǎn)生抑制JEV的復(fù)制，但是，目前對(duì)M2型巨噬細(xì)胞是影響JEV感染的具體機(jī)制還不清楚。 為了解析不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV感染的影響，本研究利用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7作為模型，分別通過IFN-和IL-4將巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞，分析JEV強(qiáng)毒株NJxx9在巨噬細(xì)胞中的感染情況。 1材料和方法1.1細(xì)胞和病毒C6/36細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的SF9培養(yǎng)基中，置于28的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 BHK-21細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞購(gòu)置于中科院細(xì)胞庫(kù)，于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO 2、37細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 上述培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Thermo Fisher公司。 利用C6/36細(xì)胞對(duì)JEV強(qiáng)毒株NJxx進(jìn)行增殖，隨后對(duì)增殖好的病毒利用BHK-21細(xì)胞進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。 1.2試劑與抗體小鼠重組細(xì)胞因子IFN-和IL-4購(gòu)自R&D公司；TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR GreenqPCR Mix購(gòu)自TaKaRa公司；抗JEV NS3多克隆抗體10由本實(shí)驗(yàn)室保存；熒光標(biāo)記的二抗購(gòu)自Invitrogen公司。 1.3M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞的制備及病毒感染將RAW264.7細(xì)胞傳至24孔培養(yǎng)板，等長(zhǎng)到70%滿時(shí)，加入細(xì)胞因子IFN-（終濃度100ng/mL）或IL-4（終濃度200ng/mL），同時(shí)設(shè)有PBS對(duì)照組。 加入IFN-或IL-4后24h，細(xì)胞接種10MOI JEV毒株NJxx，孵育2h后，PBS洗2次，換為含有5%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)至特定感染時(shí)間時(shí)，進(jìn)行樣品的制備。 1.4間接免疫熒光分析首先，將滅菌玻片放入24孔板中，按照上述的方法分別制備不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞并接種10MOI JEV毒株NJxx。 接毒后24h，用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，進(jìn)行免疫熒光分析。 利用1%NP-40打孔后，加入封閉液，室溫孵育30min；加入一抗，室溫孵育30min，洗滌3次；加入已稀釋好的二抗，繼續(xù)孵育30min后，洗滌3次；加入DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，最后洗滌3次后，進(jìn)行封片；利用熒光顯微鏡進(jìn)行分析和拍照記錄。 1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR病毒感染24h后，利用TRIzol試劑裂解不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行總RNA的提取，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物由Invitrogen公司合成。 擴(kuò)增Arg 1、iNOS及GAPDH引物序列見文獻(xiàn)11；擴(kuò)增JEV E基因的引物序3第27卷第2期徐曉偉等不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)流行性乙型腦炎病毒感染的影響列分別為JEV E-forward5-CCTCCGTCACCA TGCCAGTCTTAG-3，JEV E-reverse5-TTCGCC ATGGTCTTTTTCCTCTC-3。 然后，根據(jù)SYBR GreenqPCR Mix的說(shuō)明書，進(jìn)行PCR反應(yīng)試劑的配置，具體的反應(yīng)條件95預(yù)變性30s；95變性5s；60退火30s,40個(gè)循環(huán)。 通過與內(nèi)標(biāo)GAPDH進(jìn)行比對(duì)獲得相對(duì)表達(dá)量。 2結(jié)果2.1JEV強(qiáng)毒株NJxx在巨噬細(xì)胞及非巨噬細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性分析研究表明，相對(duì)于非免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞顯示出明顯的抗JEV的作用。 JEV毒株NJxx在巨噬細(xì)胞上的感染特性，還不清楚。 因此，我們對(duì)毒株NJxx在BHK-21細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)特性進(jìn)行了分析。 根據(jù)前期結(jié)果，在病毒感染前12h，毒株NJxx感染維持一個(gè)較低的病毒滴度（結(jié)果未顯示）。 為此，本研究在病毒感染后 12、 24、48h取細(xì)胞上清，通過TCID50的測(cè)定比較JEV毒株NJxx在BHK-21細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞上的感染情況。 結(jié)果顯示，盡管毒株NJxx可以在巨噬細(xì)胞和非巨噬細(xì)胞上造成持續(xù)感染，但是，相對(duì)于在BHK-21細(xì)胞上感染增殖情況，毒株NJxx在巨噬細(xì)胞上的復(fù)制明顯受到了抑制，具體結(jié)果見圖1。 Hours-post infectionsL o g10T CI D50/m L12h24h48hBHK-21細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞圖1JEV毒株NJxx在BHK-21細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性分析（*P0.05）Fig.1Growth characteristicsanalysis ofJEV strain NJxxon BHK-21cells andRAW264.7cells(*P0.05)2.2不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV強(qiáng)毒株NJxx感染的影響已有的研究顯示M1型巨噬細(xì)胞即IFN-誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV具有明顯的抑制作用，而M2型巨噬細(xì)胞對(duì)JEV感染影響還不清楚。 本研究比較了毒株NJxx在不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞上的感染情況。 鑒于在JEV感染后24h，病毒滴度已達(dá)到高峰，本研究選擇病毒感染后24h進(jìn)行樣品的制備。 結(jié)果顯示，相對(duì)于PBS組，M1型巨噬細(xì)胞顯著地抑制JEV的復(fù)制，培養(yǎng)上清中檢測(cè)不到病毒；相對(duì)于PBS組，JEV對(duì)M2型巨噬細(xì)胞的感染沒有發(fā)生顯著的變化，結(jié)果詳見圖2。 利用間接免疫熒光方法檢測(cè)不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV感染的影響。 在感染JEV毒株NJxx后24h，IFN-處理組未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性感染細(xì)胞，但是，PBS處理組和IL-4處理組發(fā)現(xiàn)了很多感染細(xì)胞，結(jié)果見圖3。 Log10T CI D50/m LGroups圖2感染JEV毒株NJxx的不同激活狀態(tài)巨噬細(xì)胞上清中病毒滴度分析Fig.2Virus titeranalysis insupernatants ofdifferentactivatedmacrophages infectedwith JEV strainNJxxNS:差異不明顯;ND:沒有檢測(cè)到病毒NS:Not statisticallysignif icant;ND:No detection2.3不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞影響JEV感染的可能機(jī)制巨噬細(xì)胞抑制JEV感染的機(jī)制可能有多種，有研究顯示M1型巨噬細(xì)胞即IFN-處理的巨噬細(xì)胞主要通過誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生介導(dǎo)抗JEV的作用。 進(jìn)一步，在巨噬細(xì)胞中，NO產(chǎn)生取決于誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）和精氨酸酶1（Arg1）的表達(dá)情42019年4月中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)況，同時(shí)，iNOS和Arg1分別為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞的指示標(biāo)志。 最后，我們利用相對(duì)定量PCR對(duì)調(diào)控NO產(chǎn)生的iNOS和Arg1的表達(dá)情況以及JEV的感染情況進(jìn)行了檢測(cè)。 結(jié)果顯示，相對(duì)于PBS處理組，IL-4處理組顯著地上調(diào)Arg1的表達(dá)并抑制iNOS的表達(dá)（圖4），從而降低iNOS/Arg1的比值（ratio=0.0005）；而IFN-處理組也可上調(diào)Arg1的表達(dá)，但更顯著上調(diào)iNOS的表達(dá)（圖4），從而顯著上調(diào)iNOS/Arg1的比值（ratio=13.266）。 此外，熒光定量PCR結(jié)果顯示，相對(duì)于PBS組，IFN-處理組中的E基因的水平顯著降低，而IL-4處理組中E基因的水平?jīng)]有差異（圖5），與上述TICD50和間接免疫熒光的結(jié)果相符。 圖3間接免疫熒光法分析NJxx在不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞上的感染情況Fig.3Analysis ofJEVstrainNJxxinfectionin differential activationof macrophagesby IFA3討論巨噬細(xì)胞作為一種重要的免疫細(xì)胞，在宿主免疫防御中起著重要的作用。 本研究結(jié)果表明，相對(duì)于非免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的抑制JEV感染的作用。 進(jìn)一步的研究表明，不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV感染的作用不同相對(duì)于非激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞（PBS處理組）或M2型巨噬細(xì)胞，型巨噬細(xì)胞顯示出明顯的抑制JEV感染的作用；而M2型巨噬細(xì)胞，相對(duì)于PBS組并沒有顯示出明顯的抑制或促進(jìn)JEV感染的作用。 本研究較系統(tǒng)地比較了不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV感染的影響，為將來(lái)揭示巨噬細(xì)胞在JEV感染中作用提供參考和依據(jù)。 JEV感染巨噬細(xì)胞維持一個(gè)相對(duì)較低的病毒滴度。 首先，這與JEV感染巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)I型干擾圖4熒光定量PCR分析iNOS(A)和Arg1(B)在不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞上的表達(dá)情況（*P0.05）Fig.4Expression analysisofiNOS(A)andArg1(B)in different infected macrophagesby real-time qPCR(*P0.05)圖5實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析JEV E基因在不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞上的表達(dá)水平（*P0.05）Fig.5Quantitative analysisofJEV E geneindifferentinfected macrophagesby real-time qPCR(*P0.05)R el ativ ee xp re ssi o no fJ EVE（%G AP DH）GroupABF ol di nd uc tion5第27卷第2期徐曉偉等不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)流行性乙型腦炎病毒感染的影響素的產(chǎn)生相關(guān)。 他人研究顯示JEV感染巨噬細(xì)胞RAW264.7后12h已激活I(lǐng)型干擾素的產(chǎn)生，從而限制病毒的擴(kuò)散，抑制已感染細(xì)胞中病毒的復(fù)制4。 相對(duì)于I型干擾素，IFN-主要通過誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生抑制JEV的復(fù)制6。 在巨噬細(xì)胞中，Th1型細(xì)胞因子IFN-顯著上調(diào)iNOS的表達(dá)，繼而上調(diào)表達(dá)的iNOS可利用精氨酸促進(jìn)NO的產(chǎn)生；相對(duì)而言，Th2型細(xì)胞因子IL-4顯著上調(diào)Arg1的表達(dá)，然而Arg1僅消耗精氨酸不產(chǎn)生NO。 為此，在巨噬細(xì)胞中iNOS/Arg1的比值對(duì)巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)以及NO的產(chǎn)生具有指導(dǎo)作用。 本研究顯示IFN-誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)較高水平的iNOS，并且明顯地抑制JEV的感染，這一結(jié)果與上述結(jié)果相符。 因此，這些結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗JEV感染的作用，不僅可通過快速產(chǎn)生I型干擾素抑制病毒的感染，而且可通過誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生進(jìn)一步發(fā)揮抗JEV感染的作用。 Th2免疫反應(yīng)促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生。 有研究顯示，Th2免疫反應(yīng)對(duì)JEV感染具有保護(hù)作用，這主要是與Th2免疫反應(yīng)抑制促炎性因子的表達(dá)，同時(shí)，也與增加JEV特異的抗體滴度相關(guān)12。 然而，對(duì)Th2免疫反應(yīng)誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞在JEV感染中的作用還不清楚。 我們研究結(jié)果顯示，盡管Th2細(xì)胞因子抑制促炎性因子的產(chǎn)生（結(jié)果未顯示），促進(jìn)Arg1的產(chǎn)生，但有意思的是，與PBS組相比，M2型巨噬細(xì)胞并未抑制JEV的復(fù)制。 這一結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了Th2免疫反應(yīng)介導(dǎo)的抗JEV作用，主要與抑制促炎性因子的產(chǎn)生及增加病毒特異的體液免疫反應(yīng)相關(guān)。 總之，本研究通過體外試驗(yàn)明確了M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞對(duì)JEV感染的影響，不僅豐富JEV與巨噬細(xì)胞相互作用的知識(shí)，而且為將來(lái)進(jìn)一步揭示巨噬細(xì)胞作為一種抗原提呈細(xì)胞在JEV感染中的作用奠定基礎(chǔ)。 參考文獻(xiàn)1Ghosh D,Basu A.Japanese encephalitis-a pathologicaland clinicalperspectiveJ.PLoS NeglTrop Dis,xx,3 (9):e437.2Solomon T.Flavivirus encephalitisJ.N EnglJ Med,xx,351 (4):370-378.3Erlanger TE,Weiss S,Keiser J,et al.Past,present,and futureof Japanese encephalitisJ.Emerg InfectDis,xx,15 (1):1-7.4Adhya D,Dutta K,Kundu K,et al.Histone deacetylaseinhibition byJapanese encephalitisvirus inmonocyte/macrophages:a novelviral immuneevasion strategyJ.Immunobiology,xx,218 (10):1235-1247.5Wang Kai,Deubel V.Mice withdifferent susceptibilityto Japaneseencephalitisvirus infection showselective neutralizingantibody response and myeloidcell infectivityJ.PLoS One,xx,6 (9):e24744.6Lin YL,Huang YL,Ma SH,et al.Inhibition 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