《發(fā)酵大題范圍》PPT課件.ppt

參數(shù)檢測(cè) 例 鳥苷生產(chǎn) 在鳥苷發(fā)酵中 發(fā)現(xiàn)發(fā)酵到40小時(shí)后鳥苷合成速率下降 但糖耗速率并未下降 而且由于耗糖 使發(fā)酵過(guò)程pH下降 補(bǔ)入氨水增多 那么糖耗到哪里去了呢 于是進(jìn)行以下一些測(cè)定與分析 什么因素導(dǎo)致pH下降 測(cè)定以下中間物 發(fā)酵后期丙酮酸積累 2 氨基酸的積累在有機(jī)酸分析的基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過(guò)HPLC測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間發(fā)酵液中氨基酸 結(jié)果發(fā)現(xiàn)總氨基酸積累并且其積累晚于有機(jī)酸和 NH4 積累 氨基酸成分分析表明 初始發(fā)酵液中谷氨酸濃度比較高 其它氨基酸濃度都較低 隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行谷氨酸很快被用于菌體合成 在8小時(shí)之前已經(jīng)降到很低水平 并始終維持在低水平 而在48小時(shí)左右丙氨酸開始出現(xiàn)明顯的積累 發(fā)酵液中積累量達(dá)到初始量的12 6倍之多 其它十余種氨基酸濃度則變化不大 并且在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中都維持在較低水平 因此 丙氨酸濃度變化可能是導(dǎo)致代謝流遷移所致 3 分析原因發(fā)酵過(guò)程中積累的氨基酸主要是丙氨酸 而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸轉(zhuǎn)化而來(lái) 因此可以推斷由于EMP途徑代謝流的增加造成了丙酮酸的積累 丙酮酸隨后轉(zhuǎn)化為丙氨酸丙氨酸本身又會(huì)對(duì)谷氨酸合成酶 GS 造成反饋抑制和阻遏 使產(chǎn)苷速率降低 惡性循環(huán) 二 代謝流遷移的酶學(xué)證明糖代謝途徑關(guān)鍵酶糖酵解途徑 EMP 在糖酵解途徑中有兩個(gè)不可逆的步驟的酶 磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶的時(shí)序分析 12小時(shí)時(shí)由于生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期 代謝活力較低 所以PFK的活力相對(duì)較低 24小時(shí)后隨著發(fā)酵過(guò)程進(jìn)入平穩(wěn)產(chǎn)物形成期和細(xì)胞生長(zhǎng)期 磷酸果糖激酶的活力也基本保持平穩(wěn) 但是到40小時(shí)以后 鳥苷形成速率減慢甚至停止 同時(shí)觀察到氨基酸和有機(jī)酸積累 PFK相對(duì)酶活增加 這表明此時(shí)通過(guò)EMP途徑的糖代謝通量已有了明顯的增加 丙酮酸激酶時(shí)序分析 丙酮酸激酶沒有表現(xiàn)出明顯的酶活增加 而是在24小時(shí)就基本上達(dá)到其最大值 隨后維持在恒定的水平 這表明在糖代謝時(shí)EMP途徑代謝流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大 不是造成代謝流遷移的主要因素 磷酸戊糖途徑 HMP 關(guān)鍵酶 磷酸戊糖途徑中主要的限速酶是6 磷酸葡萄糖脫氫酶 該酶催化6 磷酸葡萄糖脫氫生成6 磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯 6 磷酸葡萄糖脫氫酶時(shí)序分析 由圖可以看到 早期6 磷酸葡萄糖脫氫酶活力很高 這可能是前期菌體合成代謝比較活躍 通過(guò)HMP途徑合成用于細(xì)胞成分的核酸等組成物質(zhì) 隨后基本不變 從而保持EMP和HMP途徑通量的平衡 此時(shí)穩(wěn)定持續(xù)的形成產(chǎn)物 但是到40小時(shí)后 6 磷酸葡萄糖脫氫酶已經(jīng)表現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì) 并且隨著后期發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行而持續(xù)下降 根據(jù)物料平衡原則 有可能糖代謝在HMP途徑通量下降而EMP途徑通量增加 三羧酸 TCA 循環(huán)的關(guān)鍵酶 三羧酸循環(huán)是 消耗 丙酮酸的途徑 三羧酸流量大丙酮酸不會(huì)積累 三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶為檸檬酸合成酶 其催化乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合形成檸檬酸 是三羧酸循環(huán)的啟動(dòng)步驟 也是三羧酸循環(huán)中的主要控制點(diǎn) 由檸檬酸合成酶所催化的反應(yīng)是三羧酸循環(huán)中的第一個(gè)限速步驟 檸檬酸合成酶時(shí)序分析 從圖可以看到 TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶檸檬酸合成酶在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中 尤其是在后期產(chǎn)苷速率下降的過(guò)程中都維持比較平穩(wěn)的水平 這表明在發(fā)酵過(guò)程后期所發(fā)生的代謝流遷移時(shí) TCA循環(huán)的通量并沒有發(fā)生明顯的增加 即代謝流遷移發(fā)生在EMP和HMP之間 主要是由于EMP和HMP途徑之間的分配平衡被打破所造成的 EMP途徑代謝流的增加造成了一種代謝流的溢流現(xiàn)象 丙氨酸脫氫酶的時(shí)序分析 在發(fā)酵中后期 丙氨酸脫氫酶活力出現(xiàn)了明顯的增加 丙氨酸脫氫酶催化由丙酮酸生成丙氨酸 該酶活性增加與丙酮酸和丙氨酸的時(shí)序增加相吻合 這些數(shù)據(jù)表明代謝流的溢流現(xiàn)象發(fā)生在檸檬酸合成酶之前的丙酮酸節(jié)點(diǎn) 通過(guò)丙氨酸脫氫酶生成丙氨酸 從而緩解了EMP途徑代謝流增加造成的代謝不平衡 結(jié)果加入EMP途徑的抑制劑 克服了代謝流遷移的問題 提高了鳥苷的產(chǎn)量 基因工程菌 三 基因不穩(wěn)定性 生產(chǎn)的目標(biāo)是得到最大量的外源蛋白 但是大量外源蛋白的形成對(duì)宿主細(xì)胞是有損害的 通常是致死的 失去制造外源蛋白的能力的細(xì)胞一般生長(zhǎng)得快得多 從而能替代有生產(chǎn)能力的菌株 這就導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定性 基因的不穩(wěn)定性原因 分離丟失結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性宿主細(xì)胞調(diào)節(jié)突變 1 分離丟失 指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象 為什么會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒丟失呢 質(zhì)?？煞譃楦呖截愘|(zhì)粒 20拷貝 細(xì)胞 和低拷貝質(zhì)粒 有時(shí)低到每個(gè)細(xì)胞一至二個(gè)拷貝 低拷貝質(zhì)粒有專門的機(jī)制保證在子代細(xì)胞中有相等的分配 高拷貝質(zhì)粒通常很少遵循二分法分配到子代細(xì)胞 對(duì)于高拷貝質(zhì)粒 絕大多數(shù)子細(xì)胞接受一些質(zhì)粒 也有可能有的細(xì)胞沒有接受質(zhì)粒 出現(xiàn)質(zhì)粒丟失 雖然形成無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞的可能性是低的 每百萬(wàn)細(xì)胞分裂中一個(gè) 在大的反應(yīng)器中含有非常多的細(xì)胞 總會(huì)存在無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞 例如1000L發(fā)酵液 每毫升有109個(gè)細(xì)胞 總共就有1015個(gè)細(xì)胞 那么在這個(gè)反應(yīng)器中就含有109個(gè)無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞 質(zhì)粒的分離丟失受許多環(huán)境因素影響 如溶氧 溫度 培養(yǎng)基組成和恒化器中的稀釋速率 許多質(zhì)粒也會(huì)形成多聚體 它是相同質(zhì)粒附著在一起形成一個(gè)單位 分離丟失示意圖 2 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性 指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排 缺失所致工程菌性能的改變 如果質(zhì)粒發(fā)生突變 仍保留了抗生素抗性基因 但不合成外源蛋白 那么這些突變株仍能在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 而且由于不合成外源蛋白 生長(zhǎng)得比原來(lái)的工程菌更快 使得在這種培養(yǎng)物中帶有突變質(zhì)粒的菌占統(tǒng)治地位 這種培養(yǎng)情況就是結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性 3 宿主細(xì)胞突變 宿主細(xì)胞的突變也會(huì)造成生產(chǎn)能力的下降 這些突變通常改變細(xì)胞調(diào)節(jié) 結(jié)果減少目標(biāo)蛋白的合成 例如 控制外源蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子 利用宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子 如果宿主細(xì)胞啟動(dòng)子的改變 將大大改變質(zhì)粒編碼蛋白的生產(chǎn)水平 乳糖操縱子是常用是操縱子 通過(guò)加入乳糖或它的結(jié)構(gòu)類似物 如IPTG 來(lái)啟動(dòng)表達(dá) 如果乳糖操縱子編碼半乳糖苷透酶的基因發(fā)生突變就會(huì)阻止乳糖或乳糖的結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)入細(xì)胞 從而不能啟動(dòng)細(xì)胞的表達(dá) 4 生長(zhǎng)速率占優(yōu)勢(shì)的不穩(wěn)定性 所有這三種因素的關(guān)鍵是變異了的宿主載體系統(tǒng)和原宿主 載體系統(tǒng)的生長(zhǎng)速率不同 如果變異了的宿主載體系統(tǒng)比原來(lái)的宿主 載體系統(tǒng)有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì) 那么變異了的系統(tǒng)將最終占優(yōu)勢(shì) 基因不穩(wěn)定性就出現(xiàn) 四 表達(dá)的誘導(dǎo)基因工程菌的產(chǎn)物表達(dá)需要誘導(dǎo) 誘因主要有 溫度誘導(dǎo) 乳糖或乳糖結(jié)構(gòu)類似物誘導(dǎo) 氧饑餓誘導(dǎo) 葡萄糖饑餓誘導(dǎo) 甲醇誘導(dǎo)等 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1 兩階段培養(yǎng)法 第一階段使菌體生長(zhǎng)至一定密度 第二階段誘導(dǎo)外源基因的表達(dá) 在培養(yǎng)基中加入選擇性壓力如抗生素等 以抑制質(zhì)粒丟失菌的生長(zhǎng) 2 通過(guò)控制環(huán)境參數(shù) 溫度 PH 培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度 調(diào)節(jié)比生長(zhǎng)速率 使工程菌生長(zhǎng)具有優(yōu)勢(shì) 有些含質(zhì)粒的菌對(duì)發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反應(yīng)慢 因而間歇改變培養(yǎng)條件以改變這兩種菌的比生長(zhǎng)速率 可以改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性 染菌 3 不同時(shí)間染菌對(duì)發(fā)酵的影響 污染時(shí)間是指用無(wú)菌檢測(cè)方法確準(zhǔn)的污染時(shí)間 不是雜菌竄入培養(yǎng)液的時(shí)間 雜菌進(jìn)入培養(yǎng)液后 需有足夠的生長(zhǎng) 繁殖的時(shí)間才能顯現(xiàn)出來(lái) 顯現(xiàn)的時(shí)間又與污染菌量有關(guān) 污染的菌量多 顯現(xiàn)染菌所需的時(shí)間就短 污染菌量少 顯現(xiàn)染菌的時(shí)間就長(zhǎng) 1 種子培養(yǎng)期染菌 由于接種量較小 生產(chǎn)菌生長(zhǎng)一開始不占優(yōu)勢(shì) 而且培養(yǎng)液中幾乎沒有抗生素 產(chǎn)物 或只有很少抗生素 產(chǎn)物 因而它防御雜菌能力低 容易污染雜菌 如在此階段染菌 應(yīng)將培養(yǎng)液全部廢棄 2 發(fā)酵前期染菌 發(fā)酵前期最易染菌 且危害最大 原因發(fā)酵前期菌量不很多 與雜菌沒有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì) 且還未合成產(chǎn)物 抗生素 或產(chǎn)生很少 抵御雜菌能力弱 在這個(gè)時(shí)期要特別警惕以制止染菌的發(fā)生 染菌措施可以用降低培養(yǎng)溫度 調(diào)整補(bǔ)料量 用酸堿調(diào)pH值 縮短培養(yǎng)周期等措施予以補(bǔ)救 如果前期染菌 且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多 可以重新滅菌 補(bǔ)加一些營(yíng)養(yǎng) 重新接種再用 3 發(fā)酵中期染菌 發(fā)酵中期染菌會(huì)嚴(yán)重干擾產(chǎn)生菌的代謝 雜菌大量產(chǎn)酸 培養(yǎng)液pH下降 糖 氮消耗快 發(fā)酵液發(fā)粘 菌絲自溶 產(chǎn)物分泌減少或停止 有時(shí)甚至?xí)挂旬a(chǎn)生的產(chǎn)物分解 有時(shí)也會(huì)使發(fā)酵液發(fā)臭 產(chǎn)生大量泡沫 措施降溫培養(yǎng) 減少補(bǔ)料 密切注意代謝變化情況 如果發(fā)酵單位到達(dá)一定水平可以提前放罐 或者抗生素生產(chǎn)中可以將高單位的發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐 抑制雜菌 4 發(fā)酵后期染菌 發(fā)酵后期發(fā)酵液內(nèi)已積累大量的產(chǎn)物 特別是抗生素 對(duì)雜菌有一定的抑制或殺滅能力 因此如果染菌不多 對(duì)生產(chǎn)影響不大 如果染菌嚴(yán)重 又破壞性較大 可以提前放罐 帶圖題 谷氨酸正常發(fā)酵與異常發(fā)酵溶解氧變化 氧氣 實(shí)例一 對(duì)黃色短桿菌生物合成氨基酸時(shí)發(fā)現(xiàn) 菌體的臨界溶氧濃度為0 01mg L 當(dāng)溶氧濃度低于1 0時(shí) 谷氨酸和天冬氨酸族氨基酸合成受到影響 但苯丙氨酸 纈氨酸和亮氨酸最佳合成的溶氧濃度分別為0 55 0 60和0 85 從合成途徑中可知 谷氨酸和天冬氨酸族的氨基酸來(lái)自于三羧酸循環(huán) TCA 的中間體 而苯丙氨酸 纈氨酸和亮氨酸來(lái)自于糖酵解的中間體 即來(lái)自于丙酮酸和磷酸稀醇式丙酮酸 溫度 在四環(huán)素發(fā)酵中 還發(fā)現(xiàn)生物熱和菌的呼吸強(qiáng)度的變化有對(duì)應(yīng)關(guān)系 特別是在80小時(shí)以前 從此實(shí)驗(yàn)中還可看到 當(dāng)產(chǎn)生的生物熱達(dá)到高峰時(shí) 糖的利用速度也最大 另外也有人提出 可從菌體的耗氧率來(lái)衡量生物熱的大小 四環(huán)素生物合成過(guò)程中系列參數(shù)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程1 效價(jià) 2 呼吸強(qiáng)度 3 生物熱 4 糖濃度 第二題 1 微生物對(duì)溫度的要求不同與它們的膜結(jié)構(gòu)物理化學(xué)性質(zhì)有密切關(guān)系根據(jù)細(xì)胞膜的液體鑲嵌模型 細(xì)胞在正常生理?xiàng)l件下 膜中的脂質(zhì)成分應(yīng)保持液晶狀態(tài) 只有當(dāng)細(xì)胞膜處于液晶狀態(tài) 才能維持細(xì)胞的正常生理功能 使細(xì)胞處于最佳生長(zhǎng)狀態(tài)微生物的生長(zhǎng)溫度與細(xì)胞膜的液晶溫度范圍相一致 二 微生物與溫度相關(guān)性的原理 2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 人們采用二種方案來(lái)研究酶在低溫條件下的結(jié)構(gòu)完整性和催化功能 1 通過(guò)自然或誘導(dǎo)突變 將特定殘基發(fā)生改變的蛋白與其天然結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比 2 對(duì)比同屬嗜熱 嗜溫及嗜冷菌的蛋白結(jié)構(gòu) 通過(guò)對(duì)嗜冷酶的蛋白質(zhì)模型和x一射線衍射分析表明 嗜冷酶分子間的作用力減弱 與溶劑的作用加強(qiáng) 酶結(jié)構(gòu)的柔韌性增加 使酶在低溫下容易被底物誘導(dǎo)產(chǎn)生催化作用 嗜冷菌具有在0 合成蛋白質(zhì)的能力 這是由于其核糖體 酶類以及細(xì)胞中的可溶性因子等對(duì)低溫的適應(yīng) 蛋白質(zhì)翻譯的錯(cuò)誤率最低 許多中溫菌不能在O0C合成蛋白質(zhì) 一方面是由于其核糖體對(duì)低溫的不適應(yīng) 翻譯過(guò)程