膠體金文獻(xiàn)翻譯第一輯.pdf

丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 膠體金文獻(xiàn)翻譯活動(dòng)論文集 第一輯 僅供內(nèi)部交流 請勿外傳 二 OO 七年九月二十日 免疫金文獻(xiàn)翻譯活動(dòng)參譯人員名單 免疫金文獻(xiàn)翻譯活動(dòng)參譯人員名單 策劃 策劃 waynepionnet lzsgxl 翻譯 翻譯 20021108 backtoheart fengzhizi33 jevens lee joni keling2006 liu903 liu wei lone king lurenquan phy128 Rainlylily rapidtest ruimufang Tombacon 幾凡木木 校對(duì) 校對(duì) waynepionnet lzsgxl Tombacon Rapidtest lone king 編輯 編輯 quatrefoil dayu1979 byd123 聲明聲明 本論文集僅供丁香園戰(zhàn)友內(nèi)部交流學(xué)習(xí)使用 雖然我們對(duì)譯文 作了反復(fù)校對(duì) 但由于譯者水平有限 譯文中疏漏 錯(cuò)誤在所難免 因此 對(duì)有爭議的地方以原文為準(zhǔn) 也歡迎大家在論壇中討論交流您 的意見 目 錄 目 錄 綜述篇 綜述篇 1 膠體金在快速檢測中的地位 1 檢測技術(shù)開發(fā)篇 檢測技術(shù)開發(fā)篇 2 膠體金在快速檢測中當(dāng)前及未來的應(yīng)用 3 加工工藝 加工工藝 3 開發(fā)靈敏度高 重復(fù)性好的側(cè)向?qū)游鲈\斷產(chǎn)品 第一部分 對(duì)于老問題的新方法 21 4 開發(fā)靈敏度高 重復(fù)性好的側(cè)向?qū)游鲈\斷產(chǎn)品 第二部分 新方法帶來的新挑戰(zhàn) 29 5 核酸膜免疫 第三部分 共價(jià)連接及生產(chǎn) 38 6 膠粘劑遷移對(duì)層析檢測的影響 44 7 基于蛋白質(zhì)原料的體外診斷產(chǎn)品的穩(wěn)定性問題 54 8 濕氣處理 62 9 硝酸纖維素膜吸附蛋白的常見問題處理 第一部分 基本原理 69 法規(guī)與標(biāo)準(zhǔn)篇 法規(guī)與標(biāo)準(zhǔn)篇 10 出口管理?xiàng)l例 體外診斷產(chǎn)品的相關(guān)問題 81 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 綜述篇 膠體金在快速檢測中的地位 膠體金在快速檢測中的地位 John Chandler Tracey Gurmin and Nicola Robinson 文 rainylily 戰(zhàn)友 譯 聲明 本文僅供丁香園戰(zhàn)友內(nèi)部交流使用 著作權(quán)屬原文作者 優(yōu)良的穩(wěn)定性 靈敏度 精確度及制造過程中的可重復(fù)性 使得膠體金適合基于膜 的檢測技術(shù) 快速膜檢測需求廣泛 可應(yīng)用于諸多領(lǐng)域 見下表 隨著靈敏度和特異性 的提升 大量的潛在應(yīng)用可能是作為替代昂貴儀器檢測方法的低成本選擇 快速檢測的應(yīng)用快速檢測的應(yīng)用 臨床醫(yī)用 變態(tài)反應(yīng) 心梗標(biāo)志物 退行性病變 藥物濫用 生殖 法醫(yī) 免疫分型 感染性疾病 血清學(xué)試驗(yàn) 性傳播疾病 應(yīng)激反應(yīng) 毒理學(xué) 腫瘤標(biāo)記 農(nóng)業(yè)應(yīng)用 食品安全 植物及農(nóng)作物疾病 環(huán)境應(yīng)用 生物學(xué)污染 環(huán)境污染 獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用 與多數(shù)人類臨床應(yīng)用領(lǐng)域相似 這篇文章重點(diǎn)講述此種檢測方法中極為重要的組成部分 檢測標(biāo)記物的生 產(chǎn)制造對(duì)整個(gè)檢測系統(tǒng)的性能及可靠性的影響 尤其是強(qiáng)調(diào)了膠體金標(biāo)記物在此 檢測功能中的優(yōu)勢 什么是快速檢測 什么是快速檢測 快速檢測是一種廉價(jià)的 一次性的 基于膜的檢測方法 它能提供分析物存 在于液體樣品的視覺證據(jù) 這種檢測可以以獨(dú)立的試紙條 也可以以裝在塑料盒 中的形式進(jìn)行 總的來說 做此項(xiàng)檢測至少需要 200ul 的液體標(biāo)本 可在 2 至 5 1 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 分鐘內(nèi)完成 在臨床檢測中 樣品可能有尿 血液 血清 唾液或其他體液 在非臨床檢測中 樣本可能是由土壤 粉塵 植物或者食品制備的微量溶液 它們同樣可以直接應(yīng)用膜試紙條檢測 這種檢測方法無需儀 器操作 可應(yīng)用于臨床 實(shí)驗(yàn)室 室外或者家庭 通常為 無操作經(jīng)驗(yàn)人員使用 快速檢測法有兩種形式 層析和滲濾 層析是最普通 的形式因?yàn)槠渲圃旒笆褂枚急容^簡易 這兩種形式所涉及的 原理雖然相同 但我們這里將要討論的是層析檢測法 一個(gè)快速檢測的底層一般是硝酸纖維素膜 在它上面固 定了檢測蛋白 通常是抗體或抗原 圖 1 連接著膜的是包含有干燥金標(biāo)的金標(biāo)墊 通常是玻璃 纖維 對(duì)于目前大多數(shù)可做的檢測項(xiàng)目 這種結(jié)合墊含有吸附了針對(duì)待檢分析 品的特異性抗體或抗原的 金粒子 樣品墊通常為紙 質(zhì) 附著著結(jié)合墊 當(dāng)使用 樣品墊時(shí) 液體樣品通過 毛 細(xì)擴(kuò)散作用穿移過結(jié)合 墊 再水化金交聯(lián)物 使待 分析樣品與交聯(lián)物相互作 用 然后金交聯(lián)物與待分析 樣品復(fù)合物轉(zhuǎn)移至膜條帶上再移向蛋白結(jié)合物 復(fù)合物在此處被固定后以一條細(xì) 細(xì)的紅線的形式產(chǎn)生明顯的信號(hào) 第二條線是控制線 由余下的金交聯(lián)物形成于 膜上 表明測試完成 燒瓶中的金標(biāo)液 Hugh Burden攝 courtesy BB International 圖 1 側(cè)向?qū)游隹焖贆z測試紙條的結(jié)構(gòu)圖 顧名思義 快速檢測應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)提供結(jié)果 準(zhǔn)確的說是在幾分鐘內(nèi) 這 種檢測法必須方便 精確 可靠 廉價(jià) 是一次性的而且操作簡易的 它們也必 須容易和清楚的說明書 甚至是沒有經(jīng)驗(yàn)的使用者也能操作 從生產(chǎn)廠家的觀點(diǎn) 來看 這種快速檢測將會(huì)帶來巨大的附加值 且容易向世界各地的使用者推廣 而無論使用者其有無此項(xiàng)檢測的經(jīng)驗(yàn) 見文后附言 快速檢測功能廣泛 改變抗體或者對(duì)條帶的化學(xué)配方作微小的變動(dòng) 同樣的 設(shè)計(jì)應(yīng)能用于多種檢測 2 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 為何使用金標(biāo)記 為何使用金標(biāo)記 早期的快速檢測使用有色膠乳形成可視信號(hào) 目前的某些檢測仍使用此手 段 過去和現(xiàn)在 乳膠法一直是凝集反應(yīng)主要的標(biāo)記方法 這是因?yàn)樗诮Y(jié)合 成分的存在下易于凝集 對(duì)于快速檢測而言 交聯(lián)物的穩(wěn)定性是避免假陽性的關(guān) 鍵 而易于凝集可能就是其產(chǎn)生假陽性的主要問題 因?yàn)榫哂懈玫臐撛诜€(wěn)定性 20 世紀(jì) 80 年代末 金標(biāo)記被引入膜快速檢測 中 在適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)條件下 任何被精確大小的金顆粒都可以被重現(xiàn)性制造出來 不同的大小可用于不同的用途 其優(yōu)良的穩(wěn)定性 敏感性 精確性及可重復(fù)生產(chǎn) 性等特點(diǎn)使得金適合于在快速檢測中的應(yīng)用 金本性屬惰性元素 被適當(dāng)加工可 形成完整的球形顆粒 當(dāng)正確連接時(shí) 蛋白質(zhì)能牢固地結(jié)合在金顆粒表面 無論 是液態(tài)或固態(tài)都能保持長久的穩(wěn)定性 而且 若是在制造過程中蛋白被精確固定 其與金交聯(lián)物的非特異性結(jié)合可被減至零 標(biāo)記抗體和抗原的不同標(biāo)記物優(yōu)缺點(diǎn)的比較如表 1 所示 表 1 快速檢測中常用標(biāo)記物的特征比較 特征 金 銀 碳 乳膠 燃料 酶 重復(fù)性 放大性 一步 敏感性 多重分析檢測 穩(wěn)定性 結(jié)果清晰 易于制備 使用簡單 適應(yīng)性 低成本 應(yīng)用受限 適于部分檢測 效果顯著適于大部分檢測 膠體金的制造膠體金的制造 當(dāng)膠體金被大量生產(chǎn)時(shí) 為保證批間重復(fù)性及避免不穩(wěn)定性 成熟的工藝方 法是必須的 為獲得最終穩(wěn)定敏感的產(chǎn)品 生產(chǎn) 100 升高質(zhì)量的膠體金就需要極 度的細(xì)心與仔細(xì)以獲得最終穩(wěn)定及高靈敏度的產(chǎn)品 在生產(chǎn)過程中的每一步都需 要使用電鏡檢查來進(jìn)行質(zhì)量控制 3 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 在過去的 20 年里 生產(chǎn)商們引進(jìn)了各種不同的方法來合成膠體金 目的就是為 了獲得直徑一定且均一的單分散性的膠體 盡管所有的生產(chǎn)方法都是依賴于還原 HAuCl4 來形成金原子 但其物理?xiàng)l件還是有相當(dāng)大的差異 如反應(yīng)物添加的次 序 還原劑使用的多寡 以及最終生產(chǎn)出的膠體的質(zhì)量 大小 形狀 變異系數(shù) 等 大體來說 所有的生產(chǎn)方法 都是使用還原劑提供電子給溶 液中帶正電荷的金離子而產(chǎn)生 金原子 如下所示 圖 金離子還原形成金顆粒 氯金酸 還原劑 膠體金 HAuCl4 e Au0 通常使用的還原劑包括檸 檬酸鈉 黃磷 硼氫化鈉 硫氰 酸鈉 圖 所示為不同離子水平 還原過程 在加入還原劑之前 溶液中所含為 100 金離子 曲線的縱坐標(biāo)代表在加入還 原劑時(shí)金離子轉(zhuǎn)變?yōu)榻鹪拥倪M(jìn)程 加入還原劑之后 溶液中金原子的含量立即 出現(xiàn)急劇的上升 直到其達(dá)到過飽和 緊接著在一個(gè)被稱作核化的過程中發(fā)生凝 集作用 在核化位點(diǎn)形成由 11 個(gè)金原子構(gòu)成的中央的二十面體金核心 核化位 點(diǎn)的形成是為了減少溶液中金原子的過度飽和 其形成極其迅速 此過程一旦完 成 溶液中剩余的金原子在遞減的能量梯度下繼續(xù)結(jié)合核化位點(diǎn)直到所有的原子 從溶液中移除 最初形成的核數(shù)目決定了最終將有多少顆粒形成于溶液中 而這個(gè)數(shù)目又反 過來取決于所加入的還原劑的量 還原劑越多產(chǎn)生的晶核越多從而產(chǎn)生的金顆粒 也越多 顯而易見 在一個(gè)含既定數(shù)目氯化金的溶液中 形成的核化位點(diǎn)的數(shù)目 越多 最終形成的每個(gè)金顆粒的尺寸就越小 因而微粒的大小可通過所加入的還 原劑的量來精細(xì)調(diào)控 如果生產(chǎn)條件經(jīng)過優(yōu)化 所有的核化位點(diǎn)都可以在瞬間同 時(shí)發(fā)生 使得所形成的金顆粒大小都完全一致 即單分散型 要做到這一點(diǎn)是 很困難的 大多數(shù)的生產(chǎn)方法都無法使所有金離子于瞬間同時(shí)得到還原并形成核 化位點(diǎn) 從而造成核化過程的不均一及多分散性膠體的產(chǎn)生 最終導(dǎo)致產(chǎn)品的重 4 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 復(fù)性低下 交聯(lián)物不穩(wěn)定 每個(gè)膠體金粒周圍都包繞著來源于溶液中殘留陰離子的負(fù)電荷層的金顆粒 懸液構(gòu)成 見圖 3 這種被稱作 zeta 電位 的電子層使得金顆粒之間相互排斥并在懸 浮液中任意分布 zeta 電位可以通過改變 周圍溶液中離子的濃度而被壓縮或擴(kuò)張 圖 3 被包繞雙電子層的膠體金顆粒 高質(zhì)量的膠體金和定制加工完好的交 聯(lián)物方便用于商業(yè)用途 通過從信譽(yù)度較好 的供應(yīng)商購買這些成分而非試圖自己加工 大批量的金不僅可以節(jié)省生產(chǎn)廠家的時(shí)間 還可以減少他們的制作風(fēng)險(xiǎn) 好膠體金和不好的膠體金好膠體金和不好的膠體金 膠體金及交聯(lián)物的生產(chǎn)制造表面看似簡易 若掉以輕心則可導(dǎo)致生產(chǎn)出劣 質(zhì) 性能差及重現(xiàn)性極差的產(chǎn)品進(jìn)而影響其商業(yè)用途 將這樣的產(chǎn)品應(yīng)用于快速 檢測中可能導(dǎo)致結(jié)果的低穩(wěn)定性 低敏感性及低特異性 為防止這樣的結(jié)果出現(xiàn) 應(yīng)使用透射電子顯微鏡 TEM 來評(píng)價(jià)膠體金的超細(xì)微結(jié)構(gòu) 這種檢測能使生產(chǎn) 者對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)比較膠體的直徑 得到顆粒球狀 顆粒不規(guī)則性和顆粒直徑的變化 如果還原過程中核化作用及形成速度沒有得到很好控制 粒子的形成就會(huì)不 均一 見圖 所見的粒子可能具有不同的大小及形狀 如橢圓形 三角形 長方形 菱形等等 這樣的粒子在與蛋白的結(jié)合過程中將無法被均勻包被 也 不能在溶液中均勻分布 最終將影響產(chǎn)品的顏色 敏感性 特異性及穩(wěn)定性 僅 僅 5 形狀不均一的粒子都會(huì)影響測試的 結(jié)果 使其完全不具重現(xiàn)性 與代表著 制作精良的 40nm 的單分散性膠體粒子的 櫻桃紅色相比 由 劣質(zhì)金 所形成的 信號(hào)常可見到淡藍(lán)色或紫色 雖然在檢 測系統(tǒng)中白色背景膜上較暗的顏色更容 易辨別 但暗示著潛在的不穩(wěn)定性 而這種不穩(wěn)定性更容易造成錯(cuò)誤的結(jié)果 更 嚴(yán)重的是 粒子形狀及尺寸的不均一會(huì)導(dǎo)致蛋白包被的不均一 這樣會(huì)導(dǎo)致交聯(lián) 圖 4 優(yōu)質(zhì)膠體金與劣質(zhì) 不穩(wěn)定 膠體金 5 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 物長時(shí)間的積聚與凝集 儲(chǔ)存于溶液中的交聯(lián)物可能于幾天甚至幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就出 現(xiàn)這樣的變化 即使立即將交聯(lián)物干燥于固相基質(zhì)上也無法完全克服這個(gè)問題 在干燥過程 中 由于粒子形狀而未穩(wěn)定結(jié)合的表面蛋白很容易分離 造成假陽性及高背景 快速檢測操作過程中一個(gè)最常見的問題就是金交聯(lián)物不能以適當(dāng)?shù)乃俣燃?完整形式從玻璃纖維結(jié)合墊上釋放 這個(gè)問題常常是因?yàn)槲赐耆坏慕痤w粒直 接暴露在玻璃纖維材料上而不能釋放 這必然意味著表面蛋白或者永久地附著在 纖維基質(zhì)上或離開金顆粒自由飄浮 開始就具備包被均一的單分散性球形粒子再 加上制備完好的金交聯(lián)物 可大大減少這種危險(xiǎn)問題的發(fā)生 盡管 TEM 檢測是決定膠體質(zhì)量的唯一正確方法 但鑒定膠體或交聯(lián)物是否包 含融合的 凝集的或者不均一粒子亦或含有不同大小粒子群體的快速方法就是目 測它的顏色 優(yōu)質(zhì)的 40nm 診斷應(yīng)用中最常使用的粒子大小 的膠體應(yīng)該顯示 櫻桃紅色 如果膠體或交聯(lián)物出現(xiàn)紫色 很有可能說明其質(zhì)量低劣且不穩(wěn)定 金顆粒大小的選擇金顆粒大小的選擇 檢測信號(hào)是由金顆粒聚集于測試線或控制線而出現(xiàn)的信號(hào) 這些粒子必須足 夠大到能被看見 粒子的尺寸越大 這 些粒子聚集后就越容易被看見 例如1nm 直徑的粒子 無論其聚集數(shù)量多少幾乎 都是不可能被看見的 因?yàn)?1nm 的粒子 沒有更大粒子所具有的亮紅色 只有直 徑達(dá)到 20nm 的粒子才會(huì)出現(xiàn)可見的信 號(hào) 隨著粒子尺寸的增大 位阻現(xiàn)象又 成了一個(gè)問題 見圖 5 例如 如果 IgG 160 000 道爾頓 分子僅僅 8nm 長 大約 4nm 從金顆粒表面伸展開 那么 100nm 的粒子將會(huì)使這些小的表面分子顯 得更小而很難與特異性的蛋白相互作用 此外 這些粒子的尺寸越大 它們在既 定體積溶液中存在的數(shù)量越小 圖 5 因優(yōu)化信號(hào)選擇金粒子的大小 這種可見度的需要與位阻現(xiàn)象之間的矛盾現(xiàn)象表明 對(duì)于大多數(shù)的免疫檢測 應(yīng)用而言 最適的粒子大小是 40nm 在某些情況下當(dāng)位阻現(xiàn)象成為較大問題時(shí) 如針對(duì)較小的抗原 20nm 的粒子則更為合適 當(dāng)希望出現(xiàn)更深顏色或當(dāng)分子 6 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 表面較低的曲率提高了抗原抗體分子間的交互作用 較大一點(diǎn)的粒子則更為可 取 應(yīng)該由實(shí)驗(yàn)決定確定多少顆粒大小能帶來高靈敏度 淺背景色和高穩(wěn)定性 膠體金的制造膠體金的制造 制造者必須了解讓他們的蛋白與膠體金持久結(jié)合的物理及化學(xué)進(jìn)程 具備了 這些知識(shí)之后 要進(jìn)行從小批量制造到大規(guī)模生產(chǎn)就變得輕而易舉 而無須以犧 牲產(chǎn)品的敏感性 穩(wěn)定性 特異性或重現(xiàn)性為代價(jià)了 僅僅把交聯(lián)物揉合到一起 雖然成本低廉且簡易 卻通常會(huì)導(dǎo)致聚集體的形成 通過 TEM 可以觀察到 每一 個(gè)聚集體都是由 4 個(gè)或更多金交聯(lián)物分子組成的群體 這種聚集體的存在通常預(yù) 示著產(chǎn)品的不穩(wěn)定性 其性能會(huì)隨著時(shí)間而改變 雖然比較未聚集的產(chǎn)品剛開始 具有更高的靈敏度 但這些產(chǎn)品很快會(huì)出現(xiàn)穩(wěn)定性和特異性的問題 一種好的交聯(lián)物表現(xiàn)為蛋白吸附于金的表面上 與膠乳不同的是 蛋白是被 動(dòng)地吸附于交聯(lián)物表面 因而不會(huì)出現(xiàn)共價(jià)結(jié)合 然而 由于某些小分子與金表 面沒有足夠的結(jié)合位點(diǎn) 像激素 藥物及其他小分子 10KD 在被動(dòng)交聯(lián)之前 必須先結(jié)合到大分子載體上 多為 BSA 在任何情況下 位阻現(xiàn)象都會(huì)阻礙小分 子升至 zeta 電位 載體應(yīng)該是惰性的 這樣就不會(huì)影響檢測蛋白質(zhì)的活性 抗體的 Fc 片段緊緊吸附在金顆粒表面上 這樣圍繞著金顆粒的雙電子層表 面的 Fab 片段就突出在外面 這樣 Fab 就能吸附分析物 見圖 6 膠體金上標(biāo) 記抗體時(shí) 不能有過量的待標(biāo)記抗體存在 因?yàn)檫^量的游離的抗體會(huì)跟膠體金上 的抗體與抗原發(fā)生競爭反應(yīng) 導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性 而且過量的抗體蛋白會(huì)影響到標(biāo) 記物的穩(wěn)定性 蛋白質(zhì)和膠體金結(jié)合的最佳條件在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近 蛋白通過以下機(jī)制于幾秒之 內(nèi)吸附于金表面 金粒子所帶負(fù)電荷與蛋 白內(nèi)氨基酸 如賴氨酸 所帶陽性電荷的最初的 相互吸引 蛋白通過某些氨基酸殘 基包括色氨酸與金粒子 表面之間的疏水吸附作用 圖 6 抗體與金粒子的結(jié)合力 7 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 蛋白中的半胱氨酸的硫基與金粒子間的配價(jià)結(jié)合 交聯(lián)物的穩(wěn)定交聯(lián)物的穩(wěn)定 隨著特異蛋白的結(jié)合 交聯(lián)物必須用適當(dāng)?shù)脑噭┻M(jìn)行穩(wěn)定 通常使用 BSA 明膠 PEG 聚乙二醇 或酪蛋白 使用穩(wěn)定劑有雙重功能 一是它可通過封閉 膠體表面未和特異性蛋白結(jié)合的位點(diǎn)而減少了非特異性反應(yīng) 二是它可有助于更 穩(wěn)定的懸液的形成 一旦結(jié)合 金即被調(diào)整至預(yù)期的濃度 并混懸于相應(yīng)的緩沖液中 這種緩沖 液應(yīng)可使液體交聯(lián)物穩(wěn)定 商業(yè)生產(chǎn)者常會(huì)使用低摩爾濃度緩沖液以使得工業(yè)客 戶能簡單重懸交聯(lián)物于自己所選的緩沖液中 總的來說 最終的儲(chǔ)存緩沖液不應(yīng) 含有高鹽緩沖液和表面活性劑 因?yàn)樗鼈冇锌赡芡ㄟ^水解或置換抗體造成損傷 含有硫基或汞的防腐劑會(huì)造成交聯(lián)物的完全毀壞 膠體金最常用的防腐劑為 0 1 疊氮化合物 專業(yè)制作出的膠體金的儲(chǔ)藏幾乎是無限期的 通過計(jì)算有多少結(jié)合劑可吸附 到金粒子的表面 可能會(huì)減少批間差 其形成的交聯(lián)物比單獨(dú)的抗體可更長久的 儲(chǔ)存 恰當(dāng)干燥于固相組分的金標(biāo)蛋白則可保存數(shù)年之久 膠體金的大規(guī)模制造膠體金的大規(guī)模制造 盡管已經(jīng)有技術(shù)及科學(xué)的資料來描述出簡單的小量膠體金和交聯(lián)物的生產(chǎn) 過程 但應(yīng)用于大批量商業(yè)生產(chǎn) 譬如 100 升的量 時(shí)的方法仍舊存在著所有權(quán) 的問題 假設(shè)從氯金酸至膠體金的還原過程必須于微秒之內(nèi)完成 那么 100 升或 更大量產(chǎn)品的生產(chǎn)則需要非常精細(xì)的技術(shù)而不是僅僅遵循著小量產(chǎn)品生產(chǎn)的同 一原則 由于這些技術(shù)僅僅為用于商業(yè)生產(chǎn)的金交聯(lián)物企業(yè)中的專家所熟知 所以大 多數(shù)生產(chǎn)者不會(huì)試圖在企業(yè)內(nèi)部選擇這種艱巨的任務(wù)生產(chǎn)大批量的膠體金 相 反 快速檢測試劑的生產(chǎn)商會(huì)與膠體金專家合作 籍此來減少費(fèi)用的成本和失敗 的危險(xiǎn) 同時(shí)也可以使得他們的產(chǎn)品盡快走向市場 這樣的合作安排通常由生產(chǎn)商進(jìn)行內(nèi)部的實(shí)驗(yàn)開始 這些實(shí)驗(yàn)使用小量商業(yè) 用途的膠體來決定何種抗體最適于其應(yīng)用 隨后 一些企業(yè)內(nèi)部進(jìn)行更大量的膠 體交聯(lián)實(shí)驗(yàn)來決定按比例放大 10 倍或 100 倍的產(chǎn)品是否能生產(chǎn)出相同質(zhì)量的交 聯(lián)物 在提高溫度和應(yīng)用不同緩沖液以及干燥狀態(tài)下進(jìn)行此階段的嚴(yán)格的金交聯(lián) 8 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)操作是尤其重要的 質(zhì)量控制應(yīng)包括使用 TEM 檢查有關(guān)聚集產(chǎn)生的 情況 光密度 敏感性及特異性 在進(jìn)行大批量快速檢測產(chǎn)品的生產(chǎn)之前 多批 次地進(jìn)行這種大量的實(shí)驗(yàn)來決定生產(chǎn)的重現(xiàn)性是很有必要的 定量的可能性定量的可能性 大多數(shù)的快速檢測只是定性的 只能用于檢測臨床樣本中是否含有超過檢測 濃度的特定生物成分存在 然而 有許多的檢測則需要一種定量的元素 例如監(jiān) 控臨床指標(biāo)的變化或確定特定分析物的相對(duì)或絕對(duì)濃度 這樣的檢測包括三種形式 第一種形式是 當(dāng)進(jìn)行測試時(shí) 許多內(nèi)在的信號(hào) 可出現(xiàn)測試結(jié)果在視覺上的對(duì)比 這種測試僅僅能提供半定量的結(jié)果 結(jié)果可分 為陰性 弱陽性 中陽性和強(qiáng)陽性 第二種類型 檢測線的反應(yīng)劑設(shè)計(jì)成只能結(jié) 合已知一定量的分析物 任何過量的分析物將會(huì)和下一條檢測線結(jié)合 產(chǎn)生一個(gè) 溫度計(jì)式的條帶梯度 在第三種測試類型中 測試樣品所產(chǎn)生的信號(hào)由一個(gè)小型的 便攜式的分析 儀讀取 并由分析儀將有色的測試線轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào) 許多這樣一般的條帶測試 讀取儀將于近期應(yīng)用于商業(yè)用途 金標(biāo)記尤其適合于這種定量或半定量的測試 因?yàn)闇y試產(chǎn)生的信號(hào)既精確又 具有高度可重復(fù)性 大多數(shù)的信號(hào)是利用光電二極管通過反射標(biāo)定的刻度尺產(chǎn)生 數(shù)字 精確度取決于可被讀取得測試結(jié)果的準(zhǔn)確程度以及測試條帶產(chǎn)生的可重現(xiàn) 性信號(hào)的可靠程度 由于金標(biāo)記的精確度 相對(duì)于許多其他類型的標(biāo)記 其可產(chǎn) 生的可重現(xiàn)性信號(hào)具備更高的可靠性 金標(biāo)信號(hào)的銀增強(qiáng)作用金標(biāo)信號(hào)的銀增強(qiáng)作用 無論以層析還是滲濾模的形式 快速檢測法通常都可提供與 ELISA 試劑盒相 似或更高的敏感性 對(duì)大多數(shù)的待分析物而言 檢測水平達(dá)到 1ng ml 或更小的 量是可能的 然而 也有許多待分析物對(duì)這種直接標(biāo)記系統(tǒng)無法達(dá)到足夠的敏感 度 要用肉眼在清晰背景的白色膜條上發(fā)現(xiàn)金產(chǎn)生的信號(hào) 其敏感度則要受到使 用者能力的局限 使用光反射技術(shù)的定量方法常常無法達(dá)到人類肉眼視覺更大的 敏感性 使用銀來增強(qiáng)金標(biāo)記強(qiáng)度是一種有價(jià)值和前途的技術(shù) 它可獲得增加 100 倍的檢測敏感性 用這種方法將銀溶液應(yīng)用到測試線 來源于金標(biāo)記的初期 9 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 信號(hào) 有時(shí)候是肉眼可見的 即可被增強(qiáng) 在應(yīng)用較小粒子 約 5nm 的金交聯(lián) 物的位置 使用這種間接方法可獲得更大的總體敏感性 通過在一步測試法中摻 入銀試劑就有可能無需任何其它步驟就使信號(hào)得到增強(qiáng) 這樣液體樣品的應(yīng)用便 能推進(jìn)整個(gè)反應(yīng)的進(jìn)程 見圖 7 所有的反應(yīng)物 包括金交聯(lián)物及增強(qiáng)劑銀鹽 都被干燥于測試條帶上僅 由樣品溶開 這種間接的增強(qiáng)技術(shù) 有望在 pg ml 的范圍內(nèi)對(duì) 待分析物進(jìn)行檢測 被干燥 后的反應(yīng)物是穩(wěn)定的并有 可能在聚集之前被引入測 試裝置中 由于敏感性的增強(qiáng) 比目前用于直接標(biāo)記的測試系統(tǒng)中更小量的樣品 也可被檢測出 鑒于銀的增強(qiáng)效果 使得為從前的交聯(lián)檢測法無法檢測出的待分 析物而研究開發(fā)出基于金的一步檢測法成為可能 圖 7 層析快速檢測中銀對(duì)金標(biāo) 附言附言 快速測試要求快速測試要求 基于膜上的快速檢測法可廣泛的應(yīng)用于臨床 雖然在臨床環(huán)境中大多數(shù)檢測是 由專業(yè)的醫(yī)療保健人士操作 但越來越多的檢測方法被批準(zhǔn)由相對(duì)無經(jīng)驗(yàn)的家庭使 用者操作使用 為創(chuàng)造可成功應(yīng)用于這個(gè)特殊市場的快速檢測法 生產(chǎn)商必須為這 些有或無經(jīng)驗(yàn)的使用者周全考慮 除此之外 生產(chǎn)商為了獲得加工處理的效率而控 制成本必須有自己的一套需求 以下是目前快速檢測產(chǎn)生的關(guān)鍵要求 操作簡易操作簡易 或許操作上的簡易是使得快速檢測在商業(yè)上可行的最重要特色 一般而 言 這種檢測都是應(yīng)用多功能且簡單的生化技術(shù)而無需或僅需極小的操作經(jīng)驗(yàn)即可 完成的 面向使用者 提高操作性簡易性的特色包括一步操作法及測試結(jié)果易識(shí)別 的特色 樣品量小樣品量小 臨床醫(yī)生和家庭使用者都鐘愛測試中僅需極少量樣品這一點(diǎn) 此特色具 有眾多優(yōu)點(diǎn) 收集樣品時(shí)無需較多經(jīng)驗(yàn) 通常操作速度較快 給患者造成的潛在傷 害及疼痛也會(huì)較少 同時(shí)還能減少浪費(fèi) 10 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 快速快速 快速檢測正因這一點(diǎn)而得名 在許多臨床檢測應(yīng)用中會(huì)使用到快速檢測 速 度是其根本 根據(jù)臨床醫(yī)生需求 這種檢測的理想目標(biāo)就是在 3 分鐘內(nèi)提供結(jié)果 而許多快速檢測都可滿足這種要求 靈活靈活 對(duì)大多數(shù)的檢測而言 若要滿足臨床醫(yī)生需要即時(shí)出結(jié)果就可能要以犧牲檢 測結(jié)果的質(zhì)量為代價(jià) 對(duì)生產(chǎn)商而言 應(yīng)為快速檢測選擇那些可獲得定性 半定量 或者定量結(jié)果而無需大幅置換基底物或反應(yīng)物的理想的原材料 臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用 要使得快速檢能在臨床環(huán)境中得到廣泛應(yīng)用 它取得的結(jié)果必須可與臨 床實(shí)驗(yàn)室儀器檢測所提供的相媲美 快速檢測的理想特征包括高敏感性 的假陰 性 高特異性 的假陽性 及長期穩(wěn)定性 12 個(gè)月以上 結(jié)合良好的檢測設(shè) 計(jì) 既有助于減少金交聯(lián)物的應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生的假陽性和假陰性 又能增加測試 交聯(lián) 物 的長期穩(wěn)定性 商業(yè)用途的金交聯(lián)物可達(dá)到長達(dá) 個(gè)月的穩(wěn)定性 可靠性可靠性 快速檢測的發(fā)展造就了大量多樣化的測試片或試劑盒式檢測模式的產(chǎn)生 適用的環(huán)境范圍從緊急車輛到家庭環(huán)境不等 快速檢測除了對(duì)物理?xiàng)l件不能苛刻 外 更要求其能提供變異系數(shù)在 5 或更小范圍內(nèi)的可靠結(jié)果 若嚴(yán)格地控制生產(chǎn) 條件 金交聯(lián)物將有助于通過最小化批量生產(chǎn)中的變異提升測試的可靠性 低廉低廉 欲用于臨床檢測的快速檢測遭到同臨床實(shí)驗(yàn)室檢測一樣全面降價(jià)的定價(jià)壓 力 欲用于家庭使用的快速檢測又遭到同其他廠商相同產(chǎn)品的價(jià)格競爭 面對(duì)這兩 種情形 廠家必須面對(duì)每種測試結(jié)果都達(dá)到低成本的市場需求 高附加值高附加值 為了能在以低價(jià)出售的一次性快速檢測中獲利 生產(chǎn)商必須不斷生產(chǎn)以 降低產(chǎn)品成本 理想的測試應(yīng)使用易獲取的高質(zhì)量的原材料 部件易于大量組裝 這樣才能達(dá)到原料及勞動(dòng)力成本均低廉 要取得這種平衡 原料和試劑則適于使用 比手工操作優(yōu)勢大得多的自動(dòng)加工處理 商業(yè)接受度商業(yè)接受度 無論是由臨床中受過訓(xùn)練的專業(yè)醫(yī)療人士還是毫無經(jīng)驗(yàn)的家庭使用 者使用 快速檢測的設(shè)計(jì)必須關(guān)注消費(fèi)者的可接受度 相比令操作者毫不費(fèi)力操作 的產(chǎn)品 令人棘手的儲(chǔ)存及操作形式 難以識(shí)別的顏色都是產(chǎn)品難在商業(yè)上取得成 功的弊端 11 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 結(jié)語結(jié)語 當(dāng)乳膠普遍用于結(jié)合物時(shí) 快速檢測從 20 世紀(jì) 80 年代中期開始沒有太大的 變化 但自那以后 由于在大量快速檢測法設(shè)計(jì)中對(duì)更高敏感性 可靠性及重現(xiàn) 性要求的增加使得金作為交聯(lián)物的首選 制作精良的金試劑無論以液體還是干燥形式存在都具有極大的穩(wěn)定性 如果 繼續(xù)有對(duì)基于金的快速檢測有更大敏感性和特異性的需求 唯有對(duì)膠體金的生產(chǎn) 和使用進(jìn)行嚴(yán)格的操作才有可能取得成功 參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn) 1 J Chandler Assay device and method 96901447 1 European patent application British Biocell International 2 John Chandler PhD is the managing director and Tracey Gurmin and Nicola Robinson are part of the custom consultancy team at BBInternational Cardiff Wales UK 12 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 檢測技術(shù)開發(fā)篇 膠體金在快速檢測中當(dāng)前及未來的應(yīng)用 膠體金在快速檢測中當(dāng)前及未來的應(yīng)用 James Carney Helen Braven Joanna Seal and Emma Whitworth 文 Rainylily 戰(zhàn)友 譯 聲明 本文僅供丁香園戰(zhàn)友內(nèi)部交流使用 著作權(quán)屬原文作者 在過去的 5 年中 應(yīng)用金顆粒及層析的檢測法日益確立了其在床旁檢測中的 地位 針對(duì)不同分析物的簡易層析檢測法的出現(xiàn)簡化并 加速了檢測體系 也對(duì)諸多企業(yè)產(chǎn)生重大影響 例如 可以在臨床問診過程中利用病人的一滴血液 尿液或者 唾液做出精確的診斷結(jié)果 這樣當(dāng)病人仍在場時(shí)就可以 立即開始治療了 同樣地 食品生產(chǎn)公司可以在食品加 工的不同階段運(yùn)用質(zhì)控檢測而無需專門的實(shí)驗(yàn)室人員也 無需中斷生產(chǎn)加工過程 另外 層析檢測還可應(yīng)用于獸 醫(yī)行醫(yī) 食品貯藏和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域 而無需專門德操 作設(shè)備和培訓(xùn)以及結(jié)果的闡釋 再加上反應(yīng)的快速 使得層析成為一種理想的自 我檢測手段 用于制作膠體金的溶液成分 穩(wěn)定性 靈敏度及大批量重復(fù)性使得膠體金成為快速檢測中一種理想的檢 測標(biāo)記物 但它的應(yīng)用并不僅僅局限于層析檢測 用于制造層析檢測的材質(zhì)在不斷改進(jìn) 也伴隨著試驗(yàn)設(shè)計(jì)的不斷改善 這些 進(jìn)步使得更多可產(chǎn)生定量結(jié)果的層析檢測使用量的需求有所增加 隨著數(shù)十億元 全球性的體外診斷檢驗(yàn)市場的不斷增加 這些促進(jìn)因素同樣可以導(dǎo)致快速檢測手 段的多樣化和實(shí)驗(yàn)室分析的便利 這篇文章討論了這種多樣化的起因 并概括了 一些膠體金可適用于各種診斷應(yīng)用的特性 膠體金在層析檢測中的使用膠體金在層析檢測中的使用 層析檢測常采用兩種顆粒 染色乳膠和膠體金 許多最近開發(fā)的層析檢測 包括 Phadia AB 公司 瑞典 Uppsala 的 Immunocap Rapid 快速試驗(yàn)和 Merck KgGA 公司 德國 Darmstadt 為檢測食源性病原體開發(fā)的Singlepath和Duopath試驗(yàn) 都選用納米金作為標(biāo)記物 13 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 顆粒大小顆粒大小 用于層析檢測中納米金顆粒要比膠乳顆粒小 用于檢測中硝酸 纖維素膜的孔徑為 8 10 微米 可一次容納大量納米顆粒 這種檢測形式的敏感 性取決于顆粒和被分析物在沿著膜向吸附線移動(dòng)時(shí)的混合程度 見圖 1 而另 一個(gè)重要的因素就是小顆粒在吸附線上緊密堆集從而更易識(shí)辨 IDV 制造商必須從聲譽(yù)良好的供應(yīng)商處購買膠體金以確保滿足嚴(yán)格的質(zhì)控標(biāo) 準(zhǔn)使得顆粒的大小和尺寸均一 這些也是保持診斷產(chǎn)品能自由凝集及穩(wěn)定儲(chǔ)存的 主要因素 膠體金是一種均質(zhì)的顆粒溶液 顆粒具有均一的表面積和電荷 滿足 了蛋白附著的兩個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn) 顆粒大小范圍顆粒大小范圍 用于層析檢 測的膠體金顆粒的大小范圍為 5 200nm 顆粒尺寸的范圍使得其 可應(yīng)用于不同領(lǐng)域 較小的顆粒 可應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域 為了利用層析檢測應(yīng)用中大 顆粒的強(qiáng)可識(shí)辨特征 顆粒的均 一性是關(guān)鍵的 優(yōu)質(zhì)的膠體金顆 粒必須是單分散性的 球形的 而且形狀不均一的粒子數(shù)應(yīng)少于 5 其他規(guī)格的膠體金會(huì)使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果不佳 并造成時(shí)間和資源的浪費(fèi) 而優(yōu)質(zhì)的膠體金每升可以產(chǎn)生更多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 圖 1 層析快速檢測示意圖 可辨識(shí)性可辨識(shí)性 范圍在 20 120nm 的膠體金可散發(fā)綠光因而可出現(xiàn)鮮紅色 即使 顆粒小于透射光波長由于表面等離子共振作用它仍可以發(fā)光 被散發(fā)出的可視光 波長因顆粒尺寸的大小而異 蛋白結(jié)蛋白結(jié) 不同于用于膠乳中的共價(jià)結(jié)合 蛋白質(zhì)如抗體是被動(dòng)結(jié)合于膠體金 上的 這種結(jié)合是一種相對(duì)簡單的過程無需使用其他試劑 有三種常用的金顆粒 結(jié)合模式存在 標(biāo)準(zhǔn)的膠體金顆粒被一層負(fù)電離子包被著 在離子結(jié)合過程中 所有蛋白質(zhì) 上的正離子可以牢牢結(jié)合在顆粒的表面 當(dāng)使用檸檬酸制作金顆粒時(shí) 顆粒會(huì)與 氨基酸如賴氨酸結(jié)合 14 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 具有高度疏水性的氨基酸 如酪氨酸和色氨酸 通過疏水作用結(jié)合到金等顆 粒的表面 對(duì)于疏水性氨基酸含量很高的蛋白質(zhì) 如免疫球蛋白 來說 疏水結(jié)合 起著重要的作用 這也是結(jié)合顆粒長時(shí)間接觸含有洗滌劑的緩沖液后反應(yīng)性降低 的原因 金硫鍵是由金和硫共用一個(gè)電子對(duì)而形成的牢固連接 金微粒與蛋白內(nèi)的半 胱氨酸殘基的連接可能是吸附于顆粒上抗體或抗原的最重要部分 因此 應(yīng)避免 使用硫柳汞等含硫緩沖液或防腐劑 可調(diào)控性可調(diào)控性 經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)控程序可持續(xù)生產(chǎn)出尺寸符合要求的均一圓形膠 體金顆粒 多年的發(fā)展經(jīng)驗(yàn)已經(jīng)消除了批量生產(chǎn)中的變異因素及大批量供應(yīng)的難 題 如圖 膠體金的連接方式簡單 僅僅涉及到蛋白 稀釋液及微粒而無需 反應(yīng)劑 根據(jù)規(guī)定的原材料 生產(chǎn)者可以計(jì) 算出每粒膠體金所需要的能做出最佳檢測結(jié)果的精 確的抗體數(shù)量 從而節(jié)約成本減少原材料的浪費(fèi) 層析檢測中原材料的改進(jìn)層析檢測中原材料的改進(jìn) 用于層析檢測的原 材料質(zhì)量的改進(jìn)已經(jīng)提高了檢測的性能 顆粒顆粒 工藝上的改進(jìn)可以不斷生產(chǎn)出大量大尺 寸 圓形膠體金顆粒 可作為市場上 多種標(biāo)記物 40nm 大小的顆粒被認(rèn)為是最適于層析檢測的 這種大小的尺寸既 足夠大到易于識(shí)辨又足夠小到不會(huì)對(duì)蛋白結(jié)合到膠體金表面產(chǎn)生空間位阻從而 優(yōu)化標(biāo)記原材料的性能 隨著顆粒尺寸的增加 其辨識(shí)性也有所增加 最初的研 究表明 應(yīng)用 60nm 的膠體金可以增加某些檢測中末端信號(hào)的辨識(shí)性 從而有可 能提高測試的敏感性 圖 2 優(yōu)質(zhì)的圓形納米金變異系數(shù) 低 形態(tài)一致 具有最佳的抗體吸 附力和靈敏度 硝酸纖維素膜 硝酸纖維素膜 這種硝 酸纖維素膜的一個(gè)重要特征 就是其孔徑的大小可以控制 蛋白結(jié)合的有效表面積及樣 品通過測試條帶的毛細(xì)管流 速 劣質(zhì)膠體金易于聚集 不 能自由通過纖維素膜 因而膠 體金顆粒的大小必須均一 IDV 制造商還必須保證膠體金尺寸的規(guī)格 尺寸分布 圖 3 尺寸分布對(duì)比數(shù)據(jù)表明標(biāo)記 40 nm 的膠體金平均直 徑達(dá) 143nm 15 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 比較顯示 生產(chǎn)粗劣的膠體金標(biāo)記為 40nm 可能包含不同尺寸的顆粒 其平均 直徑可以達(dá)到 143nm 而導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果 如圖 新型硝酸纖維素膜被制成 可濕水的 不影響蛋白質(zhì)吸收和測試功能 利用表面活性劑和某些阻滯劑進(jìn)行產(chǎn) 品的后期處理可提高顆粒的流動(dòng)性 消除測試組份間的非特異性相互作用 樣本墊樣本墊 樣本墊可以被化學(xué)藥品浸漬減少樣品成分差異 提高檢測靈敏度 去污劑 增稠劑 阻滯劑和鹽通?？梢越?jīng)干燥后加入樣本墊 此工藝可以避免使 用復(fù)雜的顯影 追蹤緩沖液 實(shí)現(xiàn)真正的一步檢測 其他膜其他膜 如今的血液分離膜可以有效地分離靜脈或毛細(xì)血管中未溶血的血紅 細(xì)胞及血漿 直流膜和測流膜均已上市 可以分離 10 110ml 全血樣品 這樣可 以對(duì)血清或血漿進(jìn)行直接檢測而無需進(jìn)行樣品處理和 離心 核苷酸層析檢測核苷酸層析檢測 層析檢測法已經(jīng)發(fā)展至可以用多 種形式檢測核苷酸 該測 法可以檢測出如聚合酶鏈反應(yīng) PCR 及結(jié)螺旋霉依賴 性擴(kuò)增等擴(kuò)增技術(shù)的產(chǎn)物 結(jié)螺旋霉依賴性擴(kuò)增是一 種類似于 PCR 的等溫?cái)U(kuò)增法 其 DNA 鏈的分離是通過 酶作用而不是加熱來完成 這些技術(shù)無需昂貴的設(shè)備就可以進(jìn)行檢測 圖4 劣質(zhì)40nm膠體金形態(tài)非圓 形 不均一 易聚集 顆粒間變 異系數(shù)高 非序列特異性檢測非序列特異性檢測 這是一種以層析形式并應(yīng)用抗體或半抗原標(biāo)記的核苷酸檢測核苷酸分析物 的存在或缺失 應(yīng)用這種檢測方法 兩種半抗原 DNP 和生物素 通過與 固定于 層析帶上的 抗 DNP 抗體和 結(jié) 合于納米金顆粒上的 抗生物素 抗體結(jié)合捕獲并檢測分析物 半 抗原具有在高溫下穩(wěn)定的 圖 5 a 作為PCR擴(kuò)增引物 檢測雙鏈PCR或tHDA產(chǎn)物 b 以 固定的吸附抗體 抗體 膠體金結(jié)合物及半抗原標(biāo)記的序列特 異性寡核苷酸探針 檢測未標(biāo)記的單鏈核酸靶標(biāo) c 使用固 定的寡核苷酸吸附探針和寡核苷酸結(jié)合膠體金 進(jìn)行無抗體檢 測 優(yōu)勢 并且不會(huì)影響核苷酸 修飾酶的活性 半抗原還可以通 過商業(yè)方式獲得合成的寡核苷 酸 該方法適合于使用生物素和 DNP 標(biāo)記的試劑檢測雙鏈擴(kuò)增產(chǎn) 物 如圖 5a 序列特異檢測 序列特異檢測 許多分子診斷應(yīng)用需要應(yīng)用序列特異性檢測 這種檢測法可 16 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 以了解核苷酸分析物的序列從而區(qū)別于其他分析物和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物 通過使 用寡核苷酸探針與目的序列的退火復(fù)性完成序列的特異性 有多種方法可以確保 信號(hào)的產(chǎn)生是依賴于通過使用探針固定靶標(biāo)或者通過標(biāo)記納米金的探針 靶標(biāo)退 火來實(shí)現(xiàn) 如圖 5b 和 5c 無抗體核苷酸層無抗體核苷酸層 無需抗 體的檢測系統(tǒng)可以減少成本并 增加檢測的重復(fù)性 靈敏度及 特異性 無抗體的核苷酸層析 檢測系統(tǒng)是基于通過固定寡核 苷酸探針的靶標(biāo)捕獲和通過直 接結(jié)合到納米金的探針的檢測 如圖 5c 序列特異性寡核 苷酸探針可以利用斑點(diǎn)印記檢 測法原理類似的方法固定于層 析條帶上 捕獲探針的靈敏度和特異性與使用抗體的方法相當(dāng) 并且在多重分析 如在每個(gè)條帶上使用多條吸附線 方面有明顯的優(yōu)勢 如圖 6 人們使用多 種技術(shù)開發(fā)將核苷酸結(jié)合到納米金的方法以得到穩(wěn)定堅(jiān)固的結(jié)合物 圖 6 以固定的寡核苷酸吸附探針和寡核苷酸 膠體金結(jié)合物檢測 多核苷酸序列 檢測不同序列的固定探針在硝酸纖維素膜上形成 測試條 含有各個(gè)序列的核酸物吸附在各個(gè)位置 然后以另一與 膠體金結(jié)合的探針進(jìn)行檢測 產(chǎn)生一組譜線 膠體金的其他應(yīng)用膠體金的其他應(yīng)用 膠體金在那些需要儀器辨別最終結(jié)果的快速檢測中同樣 有效 這些檢測利用的是膠體金的光散射特性 盡管 20 120nm 的膠體金比可見 光波長小 但由于具有表面等離子共振特性其在光散射方面仍有效 表面等離子 共振是特定波長的投射光和存在于納米金中傳導(dǎo)電子交互作用的結(jié)果 光散射的 強(qiáng)度取決于投射光的波長和粒子的大小 這種表面等離子共振特性可以作為檢測 用于標(biāo)記的粒子的方法而被開發(fā) 由于其具有的表面等離子共振特性 膠體金還可用作微陳列中的熒光標(biāo)記替 代物 與熒光標(biāo)記測定相比 利用共振光散射檢測納米金顆粒測定細(xì)菌 RNA 靈 敏度要高 50 倍 使用金顆粒還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn) 它不會(huì)發(fā)生光致漂白 光散射的強(qiáng)度和最大波長與納米金顆粒的大小成正相關(guān) 通過混合不同直徑 的膠體金顆粒 選擇出不同的顆粒用于不同的分析物 將可能開發(fā)出多重檢測法 若再加上對(duì)不同尺寸粒子等離子共振峰加以區(qū)分的話 這樣就可以擴(kuò)大應(yīng)用于層 析或者其他檢測形式的測試范圍 17 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 納米金顆粒的使用使得 Pointcare Technologies 公司 美國麻省 Marlborough 應(yīng)用簡化電流細(xì)胞計(jì)數(shù)原理開發(fā)出一種 CD4 檢測法 這種開發(fā)的檢 測法免除了各種不同的熒光標(biāo)記和錯(cuò)綜復(fù)雜的檢測衡量手段 這種 CD4 淋巴細(xì)胞 計(jì)數(shù)法使用可特異性結(jié)合到這些淋巴細(xì)胞表面的膠體金抗 CD4 抗體結(jié)合物 它可 以在特定的方向散發(fā)出光從而區(qū)別于其他類型的細(xì)胞 例如表達(dá) CD4 的單核細(xì) 胞 這種簡易 小巧 輕便的細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)備還可以計(jì)數(shù)白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞 它還 可以用來監(jiān)測 HIV 和 AIDS 病人的療效 膠體金在光散射診斷中的應(yīng)用膠體金在光散射診斷中的應(yīng)用 人們對(duì)開發(fā)涉及到膠體金和納米銀的其他光散射技術(shù)一直有著濃厚的興趣 表面強(qiáng)化拉曼光譜技術(shù) SERS 中的目前已應(yīng)用于多種領(lǐng)域 納米金在 SERS 檢測 方面的應(yīng)用也日益廣泛尤其是在生物分析領(lǐng)域 拉曼光譜技術(shù) SERS 方法 拉曼光譜技術(shù) SERS 方法 拉曼散射指的是對(duì)投射光在不同波長處的光散 射 由于每一種物質(zhì)都有其獨(dú)特的拉曼光譜 使得 SERS 成為一項(xiàng)極好的鑒別工 具 然而 拉曼信號(hào)也有其特有的弱點(diǎn) 約 107 個(gè)入射光子中就有 1 個(gè)在出現(xiàn) 散射時(shí)波長偏差 這些信號(hào)可以通過兩種方式來增強(qiáng) 其中一種方法是共振拉曼 散射 即將激光調(diào)至檢測物質(zhì)的吸收波長 另一種方法就是 SERS 它要求檢測 物質(zhì)緊密靠近金屬 金或銀納米顆粒 的表面 等離子共振特性可使信號(hào)增強(qiáng)放大 至 105 106 倍 將兩種方法融合后即稱作表面強(qiáng)化共振拉曼散射技術(shù) surface enhanced resonance Raman scattering 它是一種十分靈敏的技術(shù) 可將信號(hào)放大 1014 倍 并能夠進(jìn)行單個(gè)分子的檢測 應(yīng)用納米金屬作為 SERS 基質(zhì) 應(yīng)用納米金屬作為 SERS 基質(zhì) 膠體金和納米銀的光學(xué)特性使得它們成為 SERS 檢測的良好表面和基質(zhì) 納米金屬適于液相檢測 并且在現(xiàn)有的多種生物 檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛 顆粒的大小 形態(tài) 間隙等因素對(duì)信號(hào)的增強(qiáng)非常關(guān)鍵 因 而必須使用優(yōu)質(zhì)顆粒 開發(fā)一種穩(wěn)定的檢測系統(tǒng)依賴于優(yōu)質(zhì)納米顆粒生產(chǎn)出的能 與生物分子相互作用的穩(wěn)定產(chǎn)物 生產(chǎn)出球形顆粒的替代物 如三角形或桿狀 與未來 SERS 的應(yīng)用密切相關(guān) 并有利于其應(yīng)用 SERS 標(biāo)簽 SERS 標(biāo)簽 盡管 SERS 可用于無標(biāo)簽檢測 但某些情況下 也需要在檢測系 統(tǒng)中引入一個(gè) SERS 活性標(biāo)記或報(bào)告基團(tuán) 從而產(chǎn)生出強(qiáng)大的 易于檢測的特征 18 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 性拉曼信號(hào) 每個(gè)樣本 可以檢測不同的標(biāo)記物 而且 SERS 光譜特征在多重分析方 面比熒光技術(shù)潛能更大 該標(biāo) 記可以只需將部分納米顆粒 例如 Nanoplex Technologies 公司 美國加州 Mountain View 生產(chǎn)的 SERS 納米標(biāo)記 物 包括一個(gè)包被著一層 SERS 活性標(biāo)記分子和玻璃的金屬 納米顆粒 這些顆?？梢源?zhèn)鹘y(tǒng)的基于顆粒的檢測以及具有金屬標(biāo)記復(fù)合物的 定量 SERS 檢測 用于聯(lián)合 SERS 檢測和免疫測定形式的診斷領(lǐng)域 如圖 7 圖 7 在免疫夾心測定法中通過檢測結(jié)合在金屬納米顆粒上的 SERS 活性標(biāo)記物運(yùn)用 SERS 方法 均相測定均相測定 類似于 SERS 的檢測方法也可以應(yīng)用于分子診斷領(lǐng)域 由于核酸 可以用多種可購買到的熒光基團(tuán)標(biāo)記 這種標(biāo)記無需被引入為納米顆粒的一部 分 但相反卻可以用來標(biāo)記核酸分析物 例如 將一個(gè)寡核苷酸吸附探針固定于 金屬表面 與標(biāo)記的靶 DNA 一起 退火反應(yīng) 將染料引至金屬表 面 造成熒光淬滅 產(chǎn)生 SERS 信號(hào) 如圖 8 此外 應(yīng)用結(jié) 合納米基質(zhì)和染料標(biāo)記的分析 物具有均相檢測形式的優(yōu)勢 通 過控制膠體銀的凝集 以氨基酸 基團(tuán)和熒光基團(tuán)修飾的核苷酸 已被應(yīng)用于 DNA 的定量檢測 通 過擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)等位基因 特異 PCR 多重檢測 明確樣本的基因類型 尤其具有臨床診斷價(jià)值 圖 8 SERS 法檢測熒光標(biāo)記的核甘酸退火靶標(biāo)通過巰基基團(tuán)結(jié)合 到金屬的表面 結(jié)論結(jié)論 由于其能滿足快速檢測中靈敏度 穩(wěn)定性 可靠性的增加需求 優(yōu)質(zhì)的成品 膠體金依然是快速檢測發(fā)展和生產(chǎn)中的常用標(biāo)記 膠體金的尺寸范圍使得其在多 19 丁香園免疫學(xué)技術(shù)討論版 IVDT 翻譯活動(dòng)文獻(xiàn)集 第一輯 種領(lǐng)域中具有廣泛的用途 如果生產(chǎn)得當(dāng) 它可以帶來精確 穩(wěn)定的結(jié)果 產(chǎn)生 成本效益和可靠的快速檢測 可運(yùn)用多種方法來開發(fā)膠體金在快速檢測中的應(yīng) 用 甚至可以加速新的應(yīng)用領(lǐng)域的開發(fā) 由于市場對(duì)更加精密和使用簡易的快速 檢測法的需求 加上診斷工具需要和特定治療相配合 因此膠體金的多功能性將 有助于促進(jìn)未來快速測定的開發(fā) 展望未來 隨著目前基質(zhì)開發(fā)和新的標(biāo)記物的設(shè)計(jì)合成等領(lǐng)域研究的深入 SERS 作為一種檢測手段將受到更多的關(guān)注 同時(shí) 與此相匹配的儀器設(shè)備的發(fā) 展將會(huì)增加其在診斷領(lǐng)域的實(shí)用性 金納米顆粒在 SERS 這個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域中會(huì) 發(fā)揮更大的作用 參考文獻(xiàn) 參考文獻(xiàn) 1 J Alter One Step Separation of Plasma from Whole Blood for In Vitro Diagnostics Genetic Engineering News 16 no 5 1996 28 2 J Alter Single Step Vertical Plasma Separation of Whole Blood for Tests and Sample Prep Genetic Engineering News 16 no 20 1996 30 3 M Vincent X Yan and H Kong Helicase Dependent Isothermal DNA Amplification EMBO Reports 5 no 8 2004 795 800 4 P Francois et al Comparison of Fluorescence and Resonance Light Scattering for Highly Sensitive Microarray Detection of Bacterial Pathogens Journal of Microbiological Methods 55 no 3 2003 755 762 5 CL Haynes et al Surface Enhanced Raman Spectroscopy Analytical Chemistry 77 no 17 2005 338A 6 LR Allain and T Vo Dinh Surface Enhanced Raman Scattering Detection of the Breast Cancer Susceptibility Gene BRCA1 Using a Silver Coated Microarray Platform Analytica Chimica Acta 469 no 1 2002 149 154 7 K Faulds et al Quantitative Detection of Dye Labelled DNA Using Surface Enhanced Resonance Raman Scattering SERRS from Silver Nanoparticles Talanta 67 2005 667 671 從左至右 James Carney博士 技術(shù)總監(jiān) Helen Braven博士 核酸研究的主要科學(xué)家 Joanna Seal博士 核酸研究小組 的主要項(xiàng)目負(fù)責(zé)人 Emma Whitworth博士 研發(fā)部的主要科學(xué)家 他們都工作于英國biocell國際公司 位于英國加地夫 聯(lián)系方式分別為 jimcarney britishbiocell co uk helenbraven britishbiocell