分子生物學實驗報告.docx

分子生物學實驗報告實驗二 從cDNA文庫中靶片斷擴增（4h）一、實驗?zāi)康?1.掌握聚合酶鏈式反應(yīng)的原理。 2. 掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。二、實驗原理：PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)。經(jīng)典的PCR過程包括：變性（denaturing step）、退火（annealing step）和延伸（extension step）三個步驟。變性過程，即在高溫9498下，模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之形成兩條單鏈ssDNA。隨后，模板DNA與引物的退火(復性)過程中，溫度降至55左右，特異序列的引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；之后，引物的延伸過程，DNA模板-引物結(jié)合物在耐熱的DNA聚合酶（如：Taq酶）的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘， 23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。PCR反應(yīng)的成分和作用：總體積：一般為25l100l （一）無Mg2+buffer：由純水、kcl、Tris組成。Tris用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值，使Taq酶在偏堿性環(huán)境中反揮活性。kcl可降低退火溫度，但不能超過50mmol/L，否則會抑制DNA聚合酶活性。（二）Mg2+:終濃度為1.52.0mmol/L，其對應(yīng)dNTP為200mol/L，注意Mg2+與dNTPs之間的濃度關(guān)系，由于dNTP與Taq酶竟爭Mg2+，當dNTP濃度達到1mmol/L時會抑制Taq酶的活性。Mg2+能影響反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率。 （三）BSA：一般用乙?；腂SA，起著減少PCR管對Taq酶的吸附作用，對Taq酶有保護作用。（四）底物（dNTPs）：dNTPs具有較強酸性，其儲存液用NaOH調(diào)pH值至7.07.5，一般存儲濃度為10mmol/L，各成份以等當量配制，反應(yīng)終濃度為20200mol/L。高濃度可加速反應(yīng)，但同時增加錯誤摻入和實驗成本；低濃度可提高精確性，而反應(yīng)速度會降低。（五）Taq酶：能耐95高溫而不失活，其最適pH值為8.38.5，最適溫度為7580，一般用72。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補原則為基礎(chǔ)，按53方向逐個將dNTP分子連接到引物的3端，合成一條與模板DNA互補的新的DNA子鏈。無35的外切酶活性，沒有校正功能。某種dNTP或Mg2+濃度過高,會增加其錯配率。用量一般為0.55個單位/100l。（六）模板：PCR對模板DNA的純度不要求很高，但應(yīng)盡量不含有對PCR反應(yīng)有抑制作用的雜質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。模板DNA的量不能太高，否則擴增可能不會成功，在此情況下可適當稀釋模板。（七）引物：引物濃度一般為0.10.5mol/L，濃度過高會引起錯配和非特異擴增，濃度過低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低。引物長度一般1530個堿基，引物過長或過短都會降低特異性。其3末端一定要與模板DNA配對，末位堿基最好選用A、C、G（因T錯配也能引發(fā) 鏈的延伸）。 引物G+C約占4555%，堿基應(yīng)盡量隨機分布，避免嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應(yīng)有互補鏈存在，不能與非目的擴增區(qū)有同源性。PCR反應(yīng)條件的選擇（影響因素）：1、溫度參數(shù)：（1）變性：模板變性完全與否是PCR成功的關(guān)鍵，一般先于94（或95）變性310min，接著94變性3060s。（2）退火：退火溫度一般低于引物本身變性溫度5。引物長度在1525bp可通過公Tm=(G+C)4+(A+T)2計算退火溫度，一般退火溫度在4060之間，時間為3045s。如果(G+C)低于50%，退火溫度應(yīng)低于55。較高的退火溫度可提高反應(yīng)的特異性。3、延伸：延伸溫度應(yīng)在Taq酶的最適溫度范圍之內(nèi)，一般在7075。延伸時間要根據(jù) DNA聚合酶的延伸速度和目的擴增片段的長度確定，通常對于1kb以內(nèi)的片段1min是夠用的。循環(huán)數(shù)：PCR的循環(huán)數(shù)主要由模板DNA的量決定，一般2030次循環(huán)數(shù)較合適，過多的循環(huán)數(shù)會增加非特異擴增產(chǎn)物，具體要多少循環(huán)數(shù)可通過預試驗確定。PCR產(chǎn)物積累規(guī)律：反應(yīng)初期產(chǎn)物以2n呈指數(shù)形式增加，至一定的循環(huán)數(shù)后，引物、模板、DNA聚合酶形成一種平衡，產(chǎn)物進入一個緩慢增長時期（“停滯效應(yīng)”），即“平臺期”。到達平臺期所需PCR循環(huán)數(shù)與模板量、PCR擴增效率、聚合酶種類、非特異產(chǎn)物竟爭有關(guān)。PCR常見問題一.沒有擴增產(chǎn)物1.循環(huán)溫度：變性溫度、退火溫度2.引物設(shè)計3.DNA聚合酶活性4.抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合酶活性的成份)5、DNA樣品二.非特異產(chǎn)物及電泳呈涂布狀1.Mg2+濃度2.調(diào)整引物、模板、聚合酶的用量3.適當減少循環(huán)數(shù)4.適當提高退火溫度，縮短退火或延伸時間三.引物二聚體的形成1.檢查引物的序列2.提高退火溫度3.調(diào)整引物與模板濃度4.增加引物長度四.假陽性結(jié)果的預防實驗原理聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction）即PCR技術(shù)是美國Cetus公司人類遺傳研究所的科學家K.B.Mullis于1983年發(fā)明的一種體外擴增特定基因或DNA序列的方法。PCR具有很高的特異性、靈敏度，在分子生物學、基因工程研究、某些疾病的診斷以及臨床標本中病原體檢測等方面具有極為重要的應(yīng)用價值。雙鏈DNA分子在接近沸點的溫度下解鏈，形成兩條單鏈DNA分子（變性），與待擴增片段兩端互補的寡核苷酸（引物）分別與兩條單鏈DNA分子兩側(cè)的序列特異性結(jié)合（退火、復性），在適宜的條件下，DNA聚合聚利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷酸（dNTP），在引物的引導下，按5-3的方向合成互補鏈，即引物的延伸。這種熱變性、復性、延伸的過程就是一個PCR循環(huán)。隨著循環(huán)的進行，前一個循環(huán)的產(chǎn)物又可以作為下一個循環(huán)的模板，使產(chǎn)物的數(shù)量按2n方式增長。從理論上講，經(jīng)過25-30個循環(huán)后DNA可擴增106-109倍。除上述典型的PCR反應(yīng)外，人們還根據(jù)各種用途設(shè)計了各種不同類型的特殊PCR。如利用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR），即利用組織mRNA進行反轉(zhuǎn)錄后合成第一鏈cDNA，以此為模板經(jīng)PCR合成特定目的基因；反向PCR，常規(guī)PCR允許擴增兩條引物之間的DNA片段，而反向PCR則可以對靶DNA區(qū)域之外的兩側(cè)未知的DNA序列進行擴增；不對稱PCR使用的引物濃度不同，兩種引物濃度相差100倍，在最初的20個循環(huán)中主要產(chǎn)物是雙鏈DNA，當?shù)蜐舛纫锉幌暮?，高濃度引物引導的PCR反應(yīng)產(chǎn)生大量單鏈DNA分子，可用于DNA的序列測定；在PCR-ELISA中，將引物用地高辛、生物素或放射性同位素標記，再進行PCR擴增，用ELISA方法檢測反應(yīng)產(chǎn)物的靈敏度可提高百倍以上；采用定量PCR，即用熒光物質(zhì)標記引物，根據(jù)反應(yīng)進程中熒光變化情況，可以確定組織中mRNA含量，從而了解不同生長發(fā)育時期組織特定基因的表達水平等。影響PCR反應(yīng)結(jié)果的因素較多，主要包括（1）模板的質(zhì)量：在制備模板DNA時通常需要使用蛋白變性劑及乙醇等有機溶劑，這些物質(zhì)可直接影響PCR反應(yīng)；另外當模板DNA分子量很高時，解鏈不易，可用限制酶消化以改善擴增效果；從理論上說，一個模板DNA分子即可獲得擴增產(chǎn)物，模板濃度過高，PCR反應(yīng)的特異性下降，實際操作中可按1ng、0.1ng、0.01ng遞減的方式設(shè)置模板濃度對照。（2）引物：引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計在PCR反應(yīng)中極為重要。要保證PCR反應(yīng)能準確、特異、有效地對模板DNA進行擴增，通常引物設(shè)計要遵循以下幾條原則：引物的長度以15-30bp為宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55Tm=4(G+C)+2(A+T)。應(yīng)盡量避免數(shù)個嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出是隨機的。引物的3端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補，避免引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)，兩個引物在3端不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3端末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。兩條引物間配對堿基數(shù)少于5個，引物自身配對若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對數(shù)不能超過3個由于影響引物設(shè)計的因素比較多，現(xiàn)常常利用計算機輔助設(shè)計。人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng)PAGE或離子交換HPLC進行純化。引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer），二是當擴增微量靶序列并且起始材料又比較粗時，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來，用低濃度引物不僅經(jīng)濟，而且反應(yīng)特異性也較好。一般用0.25-0.5pmoL/L較好。（3）Mg2+濃度：PCR反應(yīng)體系中Mg2+濃度對擴增結(jié)果影響較大，通常是1.5-4mmoL/L，必要時可調(diào)整Mg2+濃度。（4）dNTP濃度：1.25mmol/L，dNTP濃度過高，反應(yīng)的特異性下降。（5）反應(yīng)條件：PCR反應(yīng)條件中最重要的是退火溫度，退火溫度低，引物容易結(jié)合到模板的靶DNA序列，但反應(yīng)的特異性下降；反之，特異性增加，但擴增效果不佳。一些生物技術(shù)公司在合成引物時注明了Tm值，以此為依據(jù)，退火溫度比Tm值低3-5比較適宜。當然，在實際操作時可設(shè)置梯度以確定最佳退火溫度。實驗?zāi)康牧私饩酆厦告湻磻?yīng)（PCR）的基本原理及其影響因素，掌握PCR的基本操作過程。儀器PCR儀、臺式離心機、電泳儀、電泳槽、紫外檢測儀試劑1、引物：用去離子水配成10 mol /L。2、Taq聚合酶3、10PCR反應(yīng)緩沖液（加鎂離子）4、dNTPs：四種核苷酸混合物，濃度為10mM5、模板：含有R基因片段的重組cDNA的質(zhì)粒6、1%瓊脂糖凝膠7、50 TAE電泳緩沖液(1000 mL)Tris 242 g，Na2EDTA.2H2O 37.2 g， 溶于600 ml 去離子水中；加冰乙酸57.1 ml, 最后用去離子水定容至1000 mL。8、6 上樣緩沖液0.25% 溴酚藍；0.25%二甲苯睛藍，30%甘油，溶于水中，4保存?！緦嶒瀮?nèi)容】1、引物設(shè)計 2、PCR 3、瓊脂糖凝膠電泳4、PCR片斷的驗證實驗步驟1、反應(yīng)混合液的配制：在一個0.5mlPCR管中加入下列成分：正反兩種引物F/R各 2l10PCR 緩沖液10ldNTPs2lDNA模板1lTaq酶0.5lddH2O補至20l補至50l充分混勻，離心片刻，使液體沉至管底。實際操作時，先根據(jù)所需進行的反應(yīng)數(shù)，配制反應(yīng)混合物（按上述配方，不含模板）。每組進行3 個反應(yīng)，需配制76微升反應(yīng)混合物，則按上述配方的4倍進行配制。然后分裝于4個PCR管中，每管19微升。其中3管每管加入1微升模板，另一管加入1微升水，作為對照。2、PCR反應(yīng)條件循環(huán)1：94，3分鐘；循環(huán)2-31：94變性45s、52退火45s、72延伸1min；共30個循環(huán)；最后72延伸10分鐘。3、反應(yīng)結(jié)束后，取5微升反應(yīng)產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析，其余置4保存?zhèn)溆?。?）用1 x TAE緩沖液配制瓊脂糖凝膠：在電子天平上準確稱取瓊脂糖0.2g，倒入100 ml三角瓶，加入20 mL緩沖液。（2）微波爐上加熱40S。（3）待冷卻至60左右時，加入1L溴化乙啶，搖勻。（4）將凝膠倒入預先準備好的制膠板上，插入梳子，待冷卻。（5）取5微升PCR產(chǎn)物在瓊脂糖膠上電泳：80V，20min。（6）取出凝膠，在紫外燈下觀察，記錄觀察結(jié)果。3、PCR產(chǎn)物的純化（1）向PCR產(chǎn)物中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1，v/v），混勻；（2）14 000 r/m 離心5min；（3）取上清液，再加等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1，v/v），混勻；（4）14 000 r/m離心15 min；（5）取上清液，加入1/10體積的3M NaAc (pH5.2)和2.5倍體積的無水乙醇，混勻，-20放置2 h或過夜。（6）4，14 000 r/m離心15 min，棄上清液；（7）沉淀用70%乙醇洗滌1次；（8）14