一例規(guī)模豬場(chǎng)正常分娩產(chǎn)死胎增加的病原診斷報(bào)告.doc

一例規(guī)模豬場(chǎng)母豬正常分娩而死胎增加的病原診斷報(bào)告 夏 偉1，張宇輝1，馬迪楊1，危艷武2，劉長(zhǎng)明2（1.哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150069；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001） 吉林省某規(guī)模豬場(chǎng)母豬存欄500多頭，2012年8月份向筆者反映豬場(chǎng)最近3個(gè)月以來(lái)經(jīng)常出現(xiàn)正常分娩的母豬產(chǎn)仔死胎比例增加的現(xiàn)象，母豬未見(jiàn)任何異常癥狀，而且死亡的胎兒新鮮，體重較大，未見(jiàn)木乃伊化以及畸形；剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn)死亡胎兒肺臟充血、出血、水腫、間質(zhì)增寬；腎臟腫大,充血，臍帶出血等病理變化。為了確診該豬場(chǎng)母豬產(chǎn)仔死胎增加的病因，我們應(yīng)用PCR,RT-PCR方法對(duì)常見(jiàn)的能夠引起母豬繁殖障礙的豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、細(xì)小病毒(PPV)、日本乙型腦炎病毒（JEV)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果確診豬繁殖與呼吸綜合征變異毒株(HPPRRSV)，俗稱(chēng)高致病藍(lán)耳病病毒是引起本場(chǎng)母豬產(chǎn)死胎增加的主要原因，關(guān)于高致病藍(lán)耳病病毒(HP-PRRSV)引起豬群母豬流產(chǎn)風(fēng)暴和高熱性疾病的報(bào)道很多，但正常分娩而死胎增加為特征的病例報(bào)道較少，臨床上發(fā)病率較高而沒(méi)有引起普遍重視。因此本報(bào)告對(duì)高致病藍(lán)耳病病毒引起豬場(chǎng)群發(fā)性、持續(xù)性產(chǎn)死胎的臨床診斷具有重要的借鑒意義，我們將有關(guān)診斷報(bào)告如下。1 材料與方法1.1 病料來(lái)源采自吉林長(zhǎng)春市某豬場(chǎng)死胎病料3頭（肺、腹淋、脾），剖殺斷奶消瘦仔豬2頭（脾、淋巴結(jié)）。編號(hào)后冷凍運(yùn)送，-20 保存?zhèn)溆谩?.2 酶和其他試劑PCR和RT-PCR擴(kuò)增試劑盒、飽和酚、Taq DNA聚合酶、dNTPs、EB、DEPC水、TRIZOL(總RNA抽提試劑主要成分苯酚等）、DL 2000 Marker、TaKaRa RNA PCRKit（AMV）Ver.3.0 均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù) GenBank 發(fā)表的 PRRSV（豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異毒株）、CSFV（豬瘟病毒）、PCV2（圓環(huán)病毒2型）、PRV(偽狂犬病毒)、PPV（豬細(xì)小病毒）、JEV（豬乙型腦炎病毒）.用 Oligo6.0 軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增PRRSV的上游引物：5-ACCATGGAGGAGGATCTGCTAAAAC-3；下游引物：5-CTGGTAAGCAGACGTGTTGCG-3，擴(kuò)增缺失株（高致病性PRRSV毒株）目的片段長(zhǎng)度為843 bp；擴(kuò)增PCV2的上游引物：5-CAGCAAGAAGAATGGAAGAAGCGGA-3，下游引物：5-CCAGGACTACAATATCCGTGTAACT-3，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為1 057 bp；擴(kuò)增CSFV的上游引物：CSFV-F：5-CCTGACGCCACGATT-3，下游引物CSFV-R：5-GGGGACTCC（G） TTGCATATTTTT（T）-3，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為603 bp；擴(kuò)增PRV的上游引物：gEl：5-CCGCGGGCCGTGTTCTTTGT-3和下游引物：gE2：5-CGTGGCCGTTGTGGGTCAT-3，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度493 bp1；擴(kuò)增PPV的上游引物P1：5-CGACGAAGCCTACGACAAATAC-3和下游引物P2：5-TGCTGGTAGTGTTCCTGG GTG-3擴(kuò)增vp2基因的目的片段長(zhǎng)1 255 bp2。擴(kuò)增JEV的上游引物：5-AACAGCATGCAAATCGAAGAC-3，下游引物-CCAGAAACATCACCAGAAGG-3，引物擴(kuò)增NS1基因的目的片段500bp3；以上引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。1.4 病料處理及核酸提取 將臨床病例的組織樣品利用研磨器充分研磨，利用MEM營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)缓罄肈NA和RNA提取試劑盒進(jìn)行核酸抽提。1.5 病毒核酸檢測(cè)1.5.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒的擴(kuò)增 分別用BIOZOL總RNA提取試劑盒（博日公司）從病毒培養(yǎng)液提取總RNA為模板，采用TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件RT: 50 30 min，94 2 min；PCR：（94 30 s，58 30 s，72 1 min）35個(gè)循環(huán)，72 延伸7 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2瓊脂糖凝膠電泳鑒定。1.5.2 豬圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病毒、細(xì)小病毒的擴(kuò)增12 分別用天根生物科技有限公司DNA提取試劑盒，從病毒培養(yǎng)液提取DNA為模板，采用TaKaRa One Step DNA PCR Kit試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件94 2 min；（94 30 s，55 30 s，72 1 min）35個(gè)循環(huán)，72 延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2瓊脂糖凝膠電泳鑒定。1.5.3 豬乙型腦炎病毒的擴(kuò)增3 用提取病料總，溶于無(wú)核酸酶水，用反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系如下：， 緩沖液，反轉(zhuǎn)錄酶，。反轉(zhuǎn)錄，置于備用。以和為引物，用Taq進(jìn)行 反應(yīng)，體系如下：Taq， 和各，。反應(yīng)參數(shù)為： ； ， ， ，個(gè)循環(huán)； ， ,產(chǎn)物經(jīng)1.2瓊脂糖凝膠電泳鑒定。2 結(jié) 果：2.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)檢測(cè)結(jié)果 進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后,PCR產(chǎn)物用12瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)中觀(guān)察，可見(jiàn)到843 bp的基因條帶，大小與HP-PRRSV預(yù)期基因相符(見(jiàn)圖1)。圖1：1:1#脾；2:1#肺；3：1#腹淋；4：2#脾；5:2#肺；6:2#腹淋；7:2000bp DNA marker；8:PRRSV陽(yáng)性對(duì)照；9:3#脾；10:3#肺；11:3#腹淋；12：G1脾；13：G2脾2.2 豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)檢測(cè)結(jié)果 進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,PCR產(chǎn)物用12瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)中觀(guān)察，可見(jiàn)到1057 bp的基因條帶，大小與PCV2預(yù)期基因相符（見(jiàn)圖2）圖2：1：1#肺：2：1#腹淋；3：1#脾；4：2#肺；5：2#腹淋；6：2#脾；7：3#肺；8：3#腹淋；9：3#脾；10：G1脾；11：G2脾；12：陽(yáng)性對(duì)照；M：DNA Marker DL2000 2.3 豬瘟（CSFV)、偽狂犬（PRV)、豬細(xì)小病毒（PPV）和豬乙型腦炎（JEV)檢測(cè)結(jié)果 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果未見(jiàn)到目的基因。2.4 對(duì)死胎病料檢測(cè)結(jié)果：送檢的3頭死胎病料肺臟檢測(cè)出豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異毒株核酸呈強(qiáng)陽(yáng)性；判定引起死胎的原因主要病原為高致病性藍(lán)耳病病毒（HP-PRRSV)，結(jié)果（見(jiàn)表1）2.5 對(duì)剖殺2頭斷奶仔豬檢測(cè)結(jié)果：豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異毒株核酸均呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)（4+）；在保育豬G2脾還檢測(cè)出豬圓環(huán)病毒強(qiáng)陽(yáng)性，表明該場(chǎng)斷奶后消瘦仔豬中有豬高致病性豬藍(lán)耳病病毒與圓環(huán)病毒2型混合感染的病例（見(jiàn)表1）。 表1：病原檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如下編號(hào)樣品名稱(chēng)豬圓環(huán)病毒PCV2豬細(xì)小病毒PPV豬偽狂犬病PrV豬瘟病毒CSFV高致病性藍(lán)耳病病毒HP-PRRSV豬乙型腦炎JEV1死胎1-肺-4+2死胎1-腹淋-3死胎1-脾-4+4死胎2-肺- 5死胎2-腹淋-6死胎2-脾-4+7死胎3-肺-4+8死胎3-腹淋-9死胎3-脾-10斷奶仔豬G1-脾-4+11斷奶仔豬G2-脾4+4+注釋?zhuān)?+為強(qiáng)陽(yáng)性，2+為中陽(yáng)性，1+為陽(yáng)性；為陰性。3、防控建議：根據(jù)該豬場(chǎng)流行的病原制定免疫防控措施。3.1母豬免疫：在配種前免疫哈獸研研制的豬高致病藍(lán)耳病弱毒疫苗（HuN4F112株）2頭份、豬圓環(huán)病毒2型疫苗（LG株）2毫升預(yù)防接種。3.2仔豬免疫：2周齡哺乳仔豬免疫哈獸研研制的豬圓環(huán)病毒2型疫苗（LG株）1毫升和豬喘氣病疫苗（輝瑞研制）2毫升，間隔3周加強(qiáng)免疫一次；仔豬3-4周齡免疫高致病性藍(lán)耳病弱毒疫苗（HuN4F112株）1頭份。4、討論與分析：根據(jù)流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床癥狀、剖檢病變以及應(yīng)用RTPCR檢測(cè)確診引起本場(chǎng)母豬正常分娩而死胎增加病原為高致病藍(lán)耳病病毒。推斷母豬妊娠后期感染高致病藍(lán)耳病病毒成為陽(yáng)性帶毒者,病毒通過(guò)胎盤(pán)感染子宮內(nèi)的仔豬導(dǎo)致死胎的肺臟、脾臟能檢測(cè)出高致病藍(lán)耳病病毒核酸；斷奶消瘦仔豬同樣存在高致病性藍(lán)耳病病毒,豬圓環(huán)病毒2型混合感染。據(jù)豬場(chǎng)技術(shù)人員反映豬場(chǎng)在2009年母豬群曾經(jīng)普免過(guò)某進(jìn)口藍(lán)耳病弱毒疫苗，但疫苗免疫后妊娠后期母豬群出現(xiàn)大面積流產(chǎn)、產(chǎn)仔延遲、全窩死胎、弱仔等現(xiàn)象。疫情平息后至今從未注射過(guò)藍(lán)耳病疫苗，這期間母豬群產(chǎn)仔死胎現(xiàn)象一直存在，豬場(chǎng)經(jīng)常采用中藥保健的方式來(lái)降低死胎比例，但今年連續(xù)幾個(gè)月死胎比例顯著增加，從而引起豬場(chǎng)老板的高度重視。通過(guò)調(diào)查、檢測(cè)和分析建議豬場(chǎng)應(yīng)該避免在母豬妊娠后期注射藍(lán)耳病活疫苗，藍(lán)耳病病毒經(jīng)胎盤(pán)感染胎兒致死，以及新生仔豬帶毒已經(jīng)得到證明。哈爾濱獸醫(yī)研究所吳東來(lái)研究員4,1999年試驗(yàn)證明，3頭妊娠母豬產(chǎn)前70-90天鼻腔接種PRRSV CH-1a株105TCID50通過(guò)胎盤(pán)可感染胎兒，并在9頭死胎和2頭新生仔豬脾臟和肺臟檢測(cè)出藍(lán)耳病病毒抗原，與本診斷結(jié)果基本一致。但一些豬場(chǎng)對(duì)本病認(rèn)識(shí)不清，有許多人認(rèn)為豬場(chǎng)一旦發(fā)生高致病藍(lán)耳病就會(huì)產(chǎn)生自然免疫力，該場(chǎng)就不會(huì)有藍(lán)耳病發(fā)生。這種觀(guān)點(diǎn)已被這幾年慘痛教訓(xùn)證明是錯(cuò)誤的，近幾年有許多豬場(chǎng)因此倒閉。高致病性藍(lán)耳病之所以在國(guó)內(nèi)傳播如此迅猛，與此觀(guān)點(diǎn)造成的誤導(dǎo)關(guān)系甚大。另外豬場(chǎng)在發(fā)生產(chǎn)死胎和斷奶仔豬消瘦癥狀增多時(shí)切記不要草率診斷，應(yīng)盡早采取血清和病料到權(quán)威部門(mén)診斷，及早結(jié)合病原診斷確立防控方案，以免貽誤疫情。1張超范，劉長(zhǎng)明，危艷武，I劉霓虹等，致病性豬偽狂犬病病毒PRVJF株的分離與鑒定J.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30（3）：212-215.2張超范，崔尚金，戚亭，陳長(zhǎng)木，苗嵐