腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù).doc

精品文檔腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)隨著干細(xì)胞生物學(xué)以及腫瘤學(xué)研究的不斷深入，腫瘤干細(xì)胞已成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)。腫瘤干細(xì)胞的體外培養(yǎng)在腫瘤干細(xì)胞研究領(lǐng)域具有不可替代的重要地位，通過(guò)分離、純化及培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞可以對(duì)其生物學(xué)特性如異質(zhì)性、腫瘤的演化、轉(zhuǎn)移和抗藥性等進(jìn)行研究，為腫瘤的早期診斷與治療提供了新的思路和策略。腫瘤干細(xì)胞的體外培養(yǎng)多采用無(wú)血清培養(yǎng)基(serum free medium, SFM)，根據(jù)不同的細(xì)胞類型加入適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子聯(lián)合培養(yǎng)以防止其分化。腫瘤細(xì)胞系或者是臨床腫瘤組織聯(lián)合采用機(jī)械和膠原酶消化腫瘤組織得到單細(xì)胞懸液，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀或者免疫磁珠分選的方法得到腫瘤干細(xì)胞使用無(wú)血清培養(yǎng)基在37，5CO2飽和濕度的條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)，但值得注意的是臨床腫瘤組織的獲取應(yīng)該越新鮮越好，最好是在外科手術(shù)后1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行處理否則將影響腫瘤干細(xì)胞細(xì)胞的活性，不利于體外培養(yǎng)。無(wú)血清培養(yǎng)基有很多種，針對(duì)不同的細(xì)胞類型有專門的無(wú)血清營(yíng)養(yǎng)液出售。無(wú)血清培養(yǎng)基具有以下的優(yōu)點(diǎn)：各批產(chǎn)品之間成分相對(duì)明確、質(zhì)量相對(duì)一致；便于控制培養(yǎng)的生理環(huán)境；特殊細(xì)胞類型的優(yōu)化配方有利于提高細(xì)胞的穩(wěn)定性，使不同類型的細(xì)胞能在最有利于各自生長(zhǎng)的環(huán)境中持續(xù)傳代培養(yǎng)；依據(jù)不同類型的細(xì)胞、甚至不同的細(xì)胞系(株)都可能有各自的無(wú)血清培養(yǎng)基?？偟膩?lái)說(shuō)可以分為基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)基及附加成分兩大部分1?；A(chǔ)培養(yǎng)基一般采用人工合成的培養(yǎng)基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神經(jīng)干細(xì)胞專用無(wú)血清培養(yǎng)基、黑色素瘤專用培養(yǎng)基等其中以DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最為常用。附加成分是指在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入各種不同細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分，包括營(yíng)養(yǎng)因子：胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉、牛血清白蛋白、B27、L谷氨酰胺；細(xì)胞因子：白血病抑制因子、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板衍化生長(zhǎng)因子等。使用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化傳代后不使用血清終止胰酶的作用，可使用0.10.5%大豆胰酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor)。一、腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)中幾種常見(jiàn)的細(xì)胞因子 (一)白血病抑制因子LIF(leukemin inhibitory factor,LIF) 是白介素6(IL-6)細(xì)胞因子家族中的一員，是典型的多功能生長(zhǎng)因子，具有多種生物學(xué)功能：對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖與分化有著廣泛的作用，抑制分化促進(jìn)干細(xì)胞增殖。胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)需要添加LIF以抑制其分化，維持其多能性。LIF可抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast Growth Factor ,FGF)、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(-transforming Growth Factor ,TGF)和葉酸(Retinoic Acid ,RA)誘導(dǎo)的細(xì)胞分化。(二)干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF) 又稱肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子(MGF)，Kit配體(KL)及Steel因子(SLF)，SCF可以誘導(dǎo)干和祖細(xì)胞增生。SCF主要由腦、肝臟、骨髓、胎盤(pán)等組織(尤其骨髓)中的基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞產(chǎn)生。SCF是一種作用于最早期造血干祖細(xì)胞的造血細(xì)胞因子，在維持造血及肥大細(xì)胞存活、促進(jìn)造血細(xì)胞增殖和分化、調(diào)控各系造血細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。(三)表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF) 是含有53個(gè)氨基酸的多肽, 早期研究中發(fā)現(xiàn)其有剌激表皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,是表皮細(xì)胞培養(yǎng)的最常用的添加因子之一。EGF可顯著促使細(xì)胞分裂、增殖，在一定濃度范圍內(nèi)(520ng/ml),隨EGF濃度提高,效應(yīng)加強(qiáng)。(四)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF) 1975年Gospodarowicz 及其同事從牛大腦和垂體中分離純化出一種分子量為16-18kD由146個(gè)氨基酸組成的陽(yáng)離子多肽，并將其命名為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。bFGF具有多種生物學(xué)功能，可以促進(jìn)和調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等多種起源于中胚層、神經(jīng)外胚層源性的許多種細(xì)胞的增殖和分化。二、腫瘤干細(xì)胞目前腫瘤干細(xì)胞已經(jīng)在多種腫瘤細(xì)胞系以及白血病、腦瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等多種腫瘤組織中分離鑒定和培養(yǎng)。不同組織來(lái)源的腫瘤特性不同的，培養(yǎng)條件也不完全相同，本章就已有報(bào)道的從不同腫瘤細(xì)胞系或者腫瘤組織分離的腫瘤干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系加以闡述，在實(shí)際操作中讀者需要經(jīng)過(guò)摸索才能針對(duì)不同的腫瘤干細(xì)胞建立穩(wěn)定的體外培養(yǎng)條件。(一)白血病干細(xì)胞 ALL急性淋巴細(xì)胞白血病干細(xì)胞(CD34+/CD10/CD19)采用懸浮培養(yǎng)體系培養(yǎng)2。ALL急性淋巴細(xì)胞白血病患者來(lái)源的骨髓用Ficoll分離得到單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，使用IMDM(Gibco)添加50% FCS(Gibco)和10% DMSO二甲基亞砜(Manor Park Pharmaceuticals)凍存液將分離得到的MNC在液氮中備用。培養(yǎng)時(shí)以5105個(gè)/mL密度接種在IMDM無(wú)血清培養(yǎng)基中，添加了10g/mL人胰島素，200g/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白( Sigma-Aldrich)和2% HAS。使用時(shí)以下兩組生長(zhǎng)因子任選其一：20ng/mL重組人Fms樣酪氨酸激酶3 (rhFlt3) 配體、20ng/mL 重組人白介素3 (rhIL-3)、20ng/mL rhIL-6、20ng/mL rhGM-CSF、20ng/mL rhG-CSF和50ng/mL SCF。20ng/mL rhIL-3、10ng/mL rhIL-7和50ng/mL SCF (R&D Systems)。每周半量換液一次，培養(yǎng)6周后收集細(xì)胞用于細(xì)胞遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)分析。(二)乳腺癌干細(xì)胞 乳腺癌干細(xì)胞培養(yǎng)多參考Max Wicha及其同事建立的人乳腺上皮干/祖細(xì)胞體外懸浮培養(yǎng)體系3，在無(wú)血清培養(yǎng)基中乳腺上皮干細(xì)胞呈懸浮非分化形式生長(zhǎng)，我們稱之為乳腺干細(xì)胞球。原代培養(yǎng)時(shí)在超低粘附板(Corning)以20000個(gè)/mL活性細(xì)胞傳代時(shí)以1000個(gè)/mL密度進(jìn)行培養(yǎng)。無(wú)血清培養(yǎng)基選擇無(wú)血清乳腺上皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基MEGM(BioWhittaker)，添加了B27 (Invitrogen)、20ng/ml EGF、20ng/mLbFGF(BD Biosciences)和4g/mL肝磷脂(Sigma)，不添加牛垂體浸膏。乳腺干細(xì)胞球培養(yǎng)710天后用0.05%胰酶和0.53mM EDTA-4Na消化10分鐘(Invitrogen)，收集細(xì)胞到離心管中800rpm離心。離心后得到的細(xì)胞需通過(guò)40m 濾膜并且在顯微鏡下觀察是否為單個(gè)細(xì)胞。10000個(gè)單細(xì)胞懸液中兩個(gè)相連、三個(gè)相連、多個(gè)細(xì)胞相連的團(tuán)塊數(shù)量應(yīng)該在30到150之間，如果細(xì)胞團(tuán)大于100需要重復(fù)進(jìn)行消化和過(guò)濾的步驟。外科手術(shù)得到乳腺癌實(shí)體瘤中乳腺癌干細(xì)胞(CD44 + / CD24 /low)的培養(yǎng)需要在手術(shù)后30分鐘內(nèi)對(duì)乳腺癌標(biāo)本進(jìn)行處理，在膠原酶(Roche)和透明質(zhì)酸(Sigma)按1:1比例配成的消化液中37消化2小時(shí)后通過(guò)30m濾膜后得到單細(xì)胞懸液。以1000個(gè)/mL無(wú)血清DMEM-F12 (Cambrex), 添加10ng/mL bFGF、 20ng/mL EGF、5g/mL胰島素和0.4%牛血清白蛋白(Sigma)。細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中呈懸浮球狀細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)，每隔3天使用胰酶EDTA消化2分鐘后傳代4。乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231中分離得到乳腺癌干細(xì)胞(CD24 /low /CD44 +)，收集細(xì)胞500g離心5分鐘,使用Hanks緩沖鹽溶液洗滌后以1000個(gè)/mL重懸于無(wú)酚磺酞的DMEM F12 (Cellgro) 添加0.4%牛血清白蛋白BSA(Sigma)、 5g/mL牛胰島素(Sigma)、20ng/mL bFGF ( Sigma)和10ng/mL EGF (Sigma) ，每三天換液一次5。(三)腦膠質(zhì)瘤 臨床獲得的腫瘤標(biāo)本使用lympholyte-M (Cedarlane)去除紅細(xì)胞，在充氧的人工腦脊液中使用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，總的來(lái)說(shuō)，每份腫瘤標(biāo)本大概可以獲得25106個(gè)細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞使用TSM(tumor sphere medium)腫瘤細(xì)胞球培養(yǎng)基，添加20 ng/ml重組人EGF (Sigma)、20ng/ml bFGF (Upstate)、10ng/ml LIF(Chemicon)、1神經(jīng)元存活因子NSF(Clonetics)和60g/ml N乙酰半胱氨酸(Sigma), 使用60-mm細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)確?；罴?xì)胞數(shù)量為3 106。原代培養(yǎng)三天后免疫磁珠分選得到CD133+腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，使用上述細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)6。也有學(xué)者從臨床腫瘤組織獲得的單個(gè)腫瘤細(xì)胞懸液在Neurobasal培養(yǎng)基(Invitrogen)，添加2mM L-谷氨酰胺、N2 (Invitrogen)、B27 (Invitrogen)、20ng/ml hrEGF (Invitrogen)、20ng/ml hrbFGF (Invitrogen)和50mg/ml BSA。實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞應(yīng)該在4代之內(nèi)，分選得到的Nestin+/CD133+細(xì)胞即為腦腫瘤干細(xì)胞7。大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6采用SP分選的方法得到腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞8, 在100-mm培養(yǎng)盤(pán)中(Nunc)使用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)，添加了10g/ml牛胰島素、100g/ml人轉(zhuǎn)鐵蛋白、100g/ml BSA、60ng/ml黃體激素、16g/ml四甲烯二胺、40ng/ml亞硒酸鈉、63g/ml N乙酰半胱氨酸、5M血小板凝集抑制劑forskolin、50units/ml青霉素、50g/ml鏈霉素(GIBCO)、10ng/mlbFGF和10ng/ml PDGF。大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系9L，無(wú)血清NSC增殖培養(yǎng)基采用DMEM/F12添加20ng/ml EGF(Peprotech)和bFGF(Peprotech)、50ng/ml肝磷脂、1B27 (Gibco)。每隔兩天換液一次。當(dāng)腫瘤細(xì)胞球達(dá)到100200個(gè)時(shí)使用0.1%胰酶和1EDTA (Gibco) 37C消化10分鐘。通過(guò)25m細(xì)胞濾膜(BD Biosciences) 以1000個(gè)/ml 密度接種在添加促有絲分裂劑的NSC培養(yǎng)基中每隔兩天換液一次，18天后可以進(jìn)行細(xì)胞的傳代，培養(yǎng)的細(xì)胞球即為具有化療抵抗和侵襲能力的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞9。(四)黑色素瘤 原代培養(yǎng)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞，外科手術(shù)獲得的腫瘤組織在12小時(shí)內(nèi)處理，沖洗腫瘤組織去除表面壞死組織后1 mg/mL IV型膠原酶(Invitrogen ) DMEM中4消化46小時(shí)，得到的單細(xì)胞懸液用HBSS洗滌后種在非粘附性的培養(yǎng)板中，使用以下兩種培養(yǎng)基小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)人胚胎干細(xì)胞(hESC)營(yíng)養(yǎng)液，并且添加4ng/mLbFGF。使用黑色素瘤培養(yǎng)液建立黑色素瘤細(xì)胞系由以下成分組成MCDB 153培養(yǎng)基(Sigma)、L15 (Invitrogen)、2% FCS、5g/mL胰島素(Sigma)、15g/mL牛垂體浸膏(Cambrex)、1.68mmol/L氯化鈣和5ng/mL EGF (Sigma)。建立的WM115 and WM239A 黑色素瘤細(xì)胞系使用Mel 2%培養(yǎng)液不加垂體浸膏和EGF。在hESC培養(yǎng)基采用有限稀釋的方法從原代培養(yǎng)的細(xì)胞中培養(yǎng)黑色素瘤細(xì)胞10，盡管單個(gè)細(xì)胞增殖能力有限，兩個(gè)單個(gè)原代培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)可以形成新的腫瘤細(xì)胞球，710天后以1000個(gè)/mL密度消化傳代。黑色素瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記為CD20+。分離自小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16F10中CD44+CD133+CD24+腫瘤干細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加20g/L EGF 、20g/LbFGF和100U/ml青霉素G和100g/ml 鏈霉素11。(五)結(jié)腸癌干細(xì)胞 臨床結(jié)腸癌標(biāo)本使用機(jī)械和酶消化得到單細(xì)胞懸液，流式或免疫磁珠分選的CD133+細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞并使用無(wú)血清營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)培養(yǎng)12，添加20ng/ml EGF和10 ng/mlFGF-2。為了獲得原代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞在酶消化后將細(xì)胞種到膠原包被的培養(yǎng)板種營(yíng)養(yǎng)液為添加了10% FCS的DMEM。(六)前列腺癌干細(xì)胞 前列腺癌組織中分離腫瘤干細(xì)胞：人前列腺癌組織在征得病人的同意下從40個(gè)病人根治性前列腺切除術(shù)中獲得腫瘤標(biāo)本。前列腺癌通過(guò)組織學(xué)檢查而確認(rèn)，有些使用的標(biāo)本是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。從腫瘤組織中分離得到的CD44/21hi/CD133+ (同時(shí)也是正常前列腺上皮細(xì)胞的標(biāo)志)細(xì)胞并且在四個(gè)標(biāo)本中進(jìn)行了長(zhǎng)期培養(yǎng)一個(gè)活組織檢查為良性腫瘤。完全角(質(zhì))化細(xì)胞生長(zhǎng)介質(zhì)培養(yǎng)基 角質(zhì)化細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基添加EGF和牛垂體浸膏(Invitrogen)，此外還添加了2ng/mL LIF(Sigma)、2ng/mL SCF(Sigma)和100ng/mL霍亂毒素(Sigma) 13。(七)肺癌干細(xì)胞 外科手術(shù)獲得肺癌腫瘤組織塊，沖洗去除表面血細(xì)胞后置于含有青霉素/鏈霉素和兩性霉素B的DMEMF12中過(guò)夜以避免污染。20 mg/ml II型膠原酶(Gibco-Invitrogen) 37消化2小時(shí)。得到的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中包括DMEMF12(Gibco-Invitrogen) 中添加50 mg/ml 胰島素,100 mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白, 10 mg/ml四甲烯二胺，0.03mM亞硒酸鈉，2mM 黃體激素，0.6%葡萄糖，5mM HEPES, 0.1%碳酸氫鈉，0.4% BSA，谷氨酰胺和抗生素，20 mg/ml EGF和10 mg/ml bFGF。用未經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞培養(yǎng)皿降低細(xì)胞的貼壁性來(lái)支持未分化的腫瘤細(xì)胞球的生長(zhǎng)14。營(yíng)養(yǎng)液每周換兩次直到形成懸浮細(xì)胞球。擴(kuò)增培養(yǎng)是經(jīng)過(guò)機(jī)械地消化細(xì)胞球在完全新鮮的培養(yǎng)液中傳代單個(gè)活小的聚集物。CD133為肺癌干細(xì)胞標(biāo)記。(八)卵巢癌 小鼠乳腺癌細(xì)胞系MOVCAR 7和4306在含有4% FBS (MIS-free) DMEM 并添加了L-谷氨酰胺，1%青霉素/鏈霉素，1%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒ITS(GIBCO)37C, 5% CO2, 在T175培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)15。臨床標(biāo)本去除紅細(xì)胞后，10% FBS RPMI ，1%青霉素/鏈霉素和1% 兩性霉素。(九)肝癌干細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞系HuH7 細(xì)胞系中分選得到的SP細(xì)胞使用無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM/Hams F-12 (Invitrogen)中，作者16嘗試了添加干細(xì)胞因子SCF(Chemicon), 血小板衍生的生長(zhǎng)因PDGF(Pepro Tech),堿性成纖維生長(zhǎng)因子bFGF(R&D Systems)和白血病抑制因子LIF(Chemicon)，最終確立了添加 20ng/ml 重組人LIF, 可以有效的培養(yǎng)HuH7細(xì)胞系中的腫瘤干細(xì)胞。(十)鼻咽癌干細(xì)胞 人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-1、CNE2等分選SP細(xì)胞即為鼻咽癌細(xì)胞干細(xì)胞，將分選后的細(xì)鼻咽癌干細(xì)胞ultraMEM培養(yǎng)基(cambrex)添加5FBS，10ng/ml bFGF(sigma) 和10ng/ml EGF(sigma) 1mmol/L L谷氨酰胺(sigma)50U/ml 青霉素G和50g/ml鏈霉素17。干細(xì)胞培養(yǎng)最初用飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)，其缺點(diǎn)為操作復(fù)雜，有多種交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，目前較少采用。實(shí)際上飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)揮著關(guān)鍵作用的是飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，因此，使用無(wú)血清培養(yǎng)基中添加一定量的LIF、EGF、bFGF等細(xì)胞因子完全可以取代飼養(yǎng)層細(xì)胞, 抑制干細(xì)胞分化并維持其增殖。但是，由于干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中存在自發(fā)分化趨勢(shì)，通常認(rèn)為干細(xì)胞包括胚胎、骨髓血、臍帶血干細(xì)胞以及腫瘤干細(xì)胞只能做短期培養(yǎng)，從而限制了干細(xì)胞的擴(kuò)增和研究。Akio Soeda18等從臨床腦腫瘤組織中原代培養(yǎng)并建立了一個(gè)腦腫瘤干細(xì)胞系，腦腫瘤細(xì)胞在有血清培養(yǎng)基中貼壁單層培養(yǎng)后換無(wú)血清培養(yǎng)基仍可以形成新的細(xì)胞球并且移植到免疫缺陷鼠中有致瘤能力。重新形成的細(xì)胞球保持了干細(xì)胞特性，而且從中分離得到的單個(gè)腫瘤干細(xì)胞可以形成新的細(xì)胞球和腫瘤甚至可以在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)超過(guò)2年時(shí)間。這說(shuō)明了腫瘤干細(xì)胞中有部分細(xì)胞在非貼壁或貼壁條件下傳代多次后仍然保持了干細(xì)胞的特性。胰腺癌、食管癌、頭頸部皮膚癌中腫瘤干細(xì)胞也已經(jīng)分離和鑒定但是到目前為止還未見(jiàn)有體外培養(yǎng)的報(bào)道。因此，如何建立穩(wěn)定的干細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件，防止腫瘤干細(xì)胞的分化仍然是一個(gè)急需解決的問(wèn)題。(江蘇大學(xué) 徐學(xué)靜，錢暉)參考文獻(xiàn)：1 司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正主編。細(xì)胞培養(yǎng)。西安：世界圖書(shū)出版公司，2004. 2 Cox CV, Evely RS, Oakhill A, Pamphilon DH, Goulden NJ, Blair A.Characterization of acute lymphoblastic leukemia progenitor cells. 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