項目名稱：生姜蛋白酶的提純與固定化及肉類嫩化技術(shù).doc

項目名稱：生姜蛋白酶的提純與固定化及肉類嫩化技術(shù)申報獎種：山東省科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎項目簡介：本項目是在多個“生姜蛋白酶”課題資助的基礎(chǔ)上，由山東省科技攻關(guān)項目、山東省自然科學(xué)基金資助的研究成果，利用我省特色生姜資源進(jìn)行生姜蛋白酶的提純、固定化、應(yīng)用研究，擁有自主知識產(chǎn)權(quán)，達(dá)到國內(nèi)領(lǐng)先水平。包括以下主要內(nèi)容：（1）生姜蛋白酶的提取純化技術(shù)：確定了生姜蛋白酶的最佳提取、純化配套方案為無水乙醇沉淀法提取后采用Sephadex G-50 Medium尺寸排阻層析（SEC）純化和Cellulose DE-52與Sepharose DE-52兩種離子交換層析（IEC）聯(lián)合純化法。以姜汁酶活力為基準(zhǔn)，SEC純化倍數(shù)達(dá)到4.19倍，是粗酶的2.11倍。并確定了生姜蛋白酶由兩個等電點不同的組分組成，且都是酸性蛋白質(zhì)。（2）雙水相萃取法：確定了生姜蛋白酶的三步雙水相萃取方法中聚乙二醇最佳分子量和濃度、硫酸銨和NaCl電解質(zhì)的最佳濃度以及雙水相的配比和最佳pH，確定了第二、三步硫酸銨鹽溶液的添加量和濃度。第一步雙水相萃取得到的生姜蛋白酶酶活力分配系數(shù)為6.17，酶活力回收率為393.77%，上相酶純化倍數(shù)為1.85，酶的得率為1.20%；第二步分別為8.03， 131.26%， 2.81， 1.07%；第三步為2.04，80.63%，2.91，0.72%。（3）確定了乳化-交聯(lián)法制備活性殼聚糖微球的最佳制備條件，及以其為載體采用吸附-交聯(lián)法固定生姜蛋白酶的最佳固定化條件，所得固定化酶的酶活力為672.6U/g，酶活回收率達(dá)到了69.3%。同時比較了固定化酶與游離酶的酶學(xué)性質(zhì)差異。（4）研究了生姜蛋白酶對肉類嫩化的最佳工藝條件是：酶用量為0.06%，pH為7.0，預(yù)處理溫度為50，預(yù)處理時間是2h，嫩化效果顯著。并通過測定牛肉肌纖維的小片化指數(shù)和牛肉肌纖維直徑、全肌肉蛋白SDS-PAGE電泳等牛肉超微結(jié)構(gòu)的變化，推斷其嫩化機(jī)理可能是：生姜蛋白酶將牛肉肌纖維軟化、分解，使牛肉肌纖維直徑減小，促進(jìn)牛肉肌纖維的小片化，同時促進(jìn)了牛肉蛋白質(zhì)降解成更小的物質(zhì)，使牛肉成分整體上分解為更細(xì)、更小的成分，使其食用時變得細(xì)嫩、松軟，從而達(dá)到嫩化的效果。（5）收集到全國38種不同品種的生姜，比較了不同品種生姜中蛋白酶含量差異，發(fā)現(xiàn)不同品種生姜中蛋白酶含量從0.03（黃山老姜）到5.62（丹東姜），差異很大，從而分析出了國內(nèi)外專家學(xué)者關(guān)于生姜蛋白酶的許多分歧點的可能原因是不同品種間的差異，這是造成生姜中蛋白酶含量差異較大的主要原因，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不同提取方法造成的生姜蛋白酶含量差異。授權(quán)專利情況：專利“生姜蛋白酶的三步雙水相萃取方法”已經(jīng)授權(quán)。應(yīng)用推廣情況：生姜蛋白酶可廣泛應(yīng)用于食品、藥品、紡織等領(lǐng)域，投資少，前景廣闊，尤其發(fā)達(dá)國家，如歐美市場有大量需求。該項目已經(jīng)在山東萊蕪東興源食品有限公司、山東日照賽普食品有限公司等4家單位進(jìn)行了生產(chǎn)，三年新增利潤10283.3萬元，這主要是因為市場上該類產(chǎn)品很少，滿足不了市場需求，價格昂貴，利潤豐厚。我單位與日照賽普食品科技有限公司于2010年正式合作，通過國家農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化項目（2011GB2C600022）進(jìn)行該成果的推廣和大規(guī)模、專業(yè)化生產(chǎn)；2011年與山東萊蕪東興源食品有限公司合作，成功啟動了國家科技支撐計劃子課題“生姜功能成分高效分離關(guān)鍵技術(shù)研究與功能食品開發(fā)”。全部完成人排序及對項目的貢獻(xiàn)和工作量全部完成人排序：唐曉珍、張平平、王玉民、位思清、姜媛、喬旭光、馬明、趙冬艷、申江濤全部完成人對項目的貢獻(xiàn)和工作量：唐曉珍負(fù)責(zé)項目的申報書撰寫，實驗內(nèi)容、技術(shù)路線、實驗方案的設(shè)計；各年度實施計劃制定和年度總結(jié)、鑒定材料的撰寫，對項目各項創(chuàng)新都做出了不同的貢獻(xiàn)，對本項目各項創(chuàng)新的具體貢獻(xiàn)分別是（1）有4篇通訊作者的文章；（2）有1項第一位發(fā)明專利和2篇通訊作者的文章；（4）有2篇第一位、2篇通訊作者的文章；（3）、（5）是相關(guān)研究生論文的導(dǎo)師。投入的工作量占本人工作總量的80%左右。張平平參與完成了創(chuàng)新（1）、（2）、（3）、（5），具體負(fù)責(zé)生姜蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)的整個研究的實驗內(nèi)容、技術(shù)路線、實驗方案的設(shè)計；各年度實施計劃制定和年度總結(jié)、鑒定材料的撰寫，在本項技術(shù)研發(fā)工作中投入的工作量占本人工作總量的70%。王玉民：參與完成了創(chuàng)新點（1）、（2）、（3）、（5），具體負(fù)責(zé)生姜蛋白酶的純化試驗等技術(shù)路線和試驗方案的設(shè)計以及部分實驗，在本項技術(shù)研發(fā)工作中投入的工作量占本人工作總量的70%。位思清：參與完成了創(chuàng)新點（1）、（2）、（3）、（5），具體負(fù)責(zé)生姜蛋白酶的純化試驗等技術(shù)路線和試驗方案的設(shè)計以及部分實驗。負(fù)責(zé)整個項目的設(shè)備選型、維修，數(shù)據(jù)處理以及38種生姜中姜酶含量差異試驗的設(shè)計與試驗。在本項技術(shù)研發(fā)工作中投入的工作量占本人工作總量的60%。姜媛：參與完成了創(chuàng)新點（1）、（2）、（3）、（4）、（5），具體負(fù)責(zé)各個創(chuàng)新點的資料收集、查新、數(shù)據(jù)處理以及部分生姜蛋白酶的固定化技術(shù)試驗的實施，在本項技術(shù)研發(fā)工作中投入的工作量占本人工作總量的60%。喬旭光：參與完成了創(chuàng)新點（1）、（2）、（3）、（4）、（5），具體負(fù)責(zé)各個創(chuàng)新點的實驗設(shè)計與技術(shù)路線，負(fù)責(zé)整個項目的組織實施和生姜蛋白酶的固定化技術(shù)路線和試驗方案的設(shè)計和工作報告的撰寫。在本項技術(shù)研發(fā)工作中投入的工作量占本人工作總量的60%。馬明：參與完成了創(chuàng)新點（1）、（2）、（3）、（4）、（5）的各種實驗指標(biāo)測試，重點參與了創(chuàng)新點（5）38種生姜的收集、調(diào)研以及提取試驗的設(shè)計與試驗。在本項技術(shù)研發(fā)工作中投入的工作量占本人工作總量的60%。趙冬艷：參與完成了創(chuàng)新點（1）、（2）、（3）、（4）、（5），具體負(fù)責(zé)生姜蛋白酶固定化的實驗內(nèi)容、技術(shù)路線、實驗方案的設(shè)計及其各年度實施計劃制定和年度總結(jié)、鑒定材料的撰寫，在本項技術(shù)研發(fā)工作中投入的工作量占本人工作總量的40%。申江濤：參與完成了創(chuàng)新點（1）、（2）、（3）、（4）、（5），具體負(fù)責(zé)整個項目技術(shù)在其單位推廣方案設(shè)計，組織生產(chǎn)的實施；推廣技術(shù)在其單位應(yīng)用效果的統(tǒng)計和經(jīng)濟(jì)效果的核算以及相關(guān)資料的撰寫。在本項技術(shù)研發(fā)工作中投入的工作量占本人工作總量的30%。全部完成單位及排序：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、日照賽普食品科技有限公司五、推廣應(yīng)用情況、經(jīng)濟(jì)效益和社會效益1推廣應(yīng)用情況（限1頁） 單位：萬元應(yīng)用單位名稱應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用起止時間應(yīng)用單位聯(lián)系人/電話經(jīng)濟(jì)效益日照賽普食品科技有限公司生姜蛋白酶提純和固定化技術(shù)2009-2011丁華/135619271553153.3萊蕪東興源食品有限公司生姜蛋白酶提純技術(shù)2009-2011王波/ 158634068663500萊蕪市曄霖農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口有限公司生姜蛋白酶提純和固定化技術(shù)2010-2011魏春華/158634069662070萊蕪壹統(tǒng)姜山食品有限公司生姜蛋白酶提取技術(shù)2010-2011郭冬菊/136763499601560應(yīng)用情況概述：日照賽普食品科技有限公司和萊蕪東興源食品有限公司，都于2009年利用現(xiàn)有廠房和設(shè)備，引進(jìn)該項目中生姜蛋白酶生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行試生產(chǎn)后，得到了符合商業(yè)要求的生姜蛋白酶，試投放國內(nèi)市場，出口歐美市場，受到客戶的歡迎和好評后，先后分別于2010年和2011年購置新設(shè)備，擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，新設(shè)備投入生產(chǎn)后運行良好。都已經(jīng)分別與該課題組采用多種合作方式，聯(lián)合進(jìn)一步研究、應(yīng)用、推廣該技術(shù)。其中2010年與日照賽普食品科技有限公司合作申報成功了國家農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化項目（2011GB2C600022），2011年與山東萊蕪東興源食品有限公