葉綠素的提取實(shí)驗(yàn)報(bào)告.docVIP

植物葉中色素的提取和柱色譜分離實(shí)驗(yàn)報(bào)告一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)從植物中提取色素的方法。2、學(xué)習(xí)柱色譜(層析)的原理及其操作方法。3、掌握天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告的一般寫(xiě)法。二實(shí)驗(yàn)原理1、綠色植物葉中含有葉綠素(綠)、胡蘿卜素(橙)和葉黃素(黃)等多種天然色素。各種色素能溶解在有機(jī)溶劑（無(wú)水乙醇等）中形成溶液，使色素從生物組織中脫離出來(lái)。2、柱色譜是通過(guò)色譜柱來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。在色譜柱內(nèi)裝有固體吸附劑(固定相)如氧化鋁或硅膠。液體樣品從柱頂加入，當(dāng)液體流經(jīng)吸附劑時(shí)，由于吸附劑表面對(duì)液體中各組分吸附能力不同而按一定的順序吸附。然后從柱頂加入洗脫劑(流動(dòng)相)，樣品中的各組分隨洗脫劑按一定的順序從色譜柱下端流出，根據(jù)不同顏色分段收集。吸附劑，常用吸附劑有氧化鋁、硅膠、氧化鎂等。吸附劑對(duì)化合物的吸附能力與分子的極性有關(guān)，極性越強(qiáng)，吸附能力越大，分子中含有極性較大的基團(tuán)，其吸附能力也越強(qiáng)。溶劑，溶劑分為溶解樣品的溶劑和洗脫劑。選擇溶劑時(shí)還要考慮到被分離物各組分的極性和溶解度。通常是先將要分離的樣品溶于非極性溶劑中，從柱頂加入柱中。然后用稍大極性的溶劑使各組分在柱中形成若干譜帶。再用極性更大的溶劑洗脫被吸附的物質(zhì)。為了提高洗脫效果，有時(shí)也使用混合溶劑。在本實(shí)驗(yàn)中色素成分在不同比例混合洗脫劑的作用下可以分離出來(lái)。三實(shí)驗(yàn)儀器及試劑儀器：燒杯、量筒、色譜柱、分液漏斗、玻璃棒 、干燥的錐形瓶、濾紙、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 、酸式滴定管、布氏漏斗、研缽、膠頭滴管、剪刀、天平試劑：50g新鮮植物葉、中性氧化鋁、甲醇 ( 9 5 ，分 析 純 ) 、乙醇、石油醚 ( 6 0 9 0 ) 、丙酮 、無(wú)水硫酸鈉 、正丁醇 、50g新鮮植物葉、四實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 綠葉色素的提取把新鮮綠葉洗凈晾干或用濾紙吸干，稱(chēng)取5g綠葉，剪碎后放入研缽，再加入10mL乙醇。研磨后用布氏漏斗抽濾，棄去濾渣。將濾液放回研缽，每次用10mL 3:2 （體積比）的石油醚 - 甲醇混合液萃取兩次，每次需加以研磨并且抽濾。把兩次濾液合并，轉(zhuǎn)入分液漏斗中。用5mL水洗滌兩次，棄去水-甲醇層, 洗滌時(shí)要輕輕旋蕩，以防止產(chǎn)生乳化。石油醚層轉(zhuǎn)入干燥的錐形瓶中用無(wú)水硫酸鈉干燥。干燥后的液體在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸除石油醚至體積約2mL左右。2.柱色譜分離色素取一支干凈的酸式滴定管，向柱內(nèi)加入石油醚至柱高約1/2處。再緩慢加入氧化鋁，并打開(kāi)活塞 ，控制流出速度約為2滴/s ，并保持液面不低于固定相。打開(kāi)下端活塞，放出溶劑，直到氧化鋁表面溶劑剩下 12mm 高時(shí)關(guān)上活塞。注意，在任何情況下，氧化鋁表面不得露出液面。色素濃溶液用滴管小心加到色譜柱頂部，并要旋轉(zhuǎn)加入。加完后打開(kāi)下部活塞，讓液面下降到柱面以下1mm左右關(guān)閉活塞。旋轉(zhuǎn)加入數(shù)滴石油醚，重新打開(kāi)活塞使液面下降，重復(fù)幾次使有色物質(zhì)全部進(jìn)入柱體內(nèi)，待色素全部進(jìn)入柱體后，觀察并記錄下此時(shí)實(shí)驗(yàn)的現(xiàn)象。在柱頂小心加洗脫劑石油醚 - 丙酮溶液 9:1 （體積比）。打開(kāi)活塞，讓洗脫劑逐滴放出，層析即開(kāi)始進(jìn)行，用試管收集。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)有色成分即將滴出時(shí)，取另一試管收集，得橙黃色溶液，它就是胡蘿卜素。用石油醚 - 丙酮 7:3 （體積比）作洗脫劑，分出第二個(gè)黃色帶，它是葉黃素 （1）。再用丁醇 - 乙醇 - 水 3:1:1 （體積比）洗脫葉綠素a（藍(lán)綠色）和葉綠素b（黃綠色）。五實(shí)驗(yàn)結(jié)論與分析1、本次實(shí)驗(yàn)總共重復(fù)了三次，第一次采用的是蠶豆葉，提取的色素濃液很少所以色素帶分層現(xiàn)象不明顯；第二次采用的是野草的嫩葉，提取出來(lái)的主要是淡黃色的色素，葉綠素較少；第三次因?yàn)闀r(shí)間關(guān)系采用了少量的是萵苣葉比較前兩次實(shí)驗(yàn)，很遺憾實(shí)驗(yàn)分層現(xiàn)象還是不明顯。通過(guò)不同品種的原材料的選取，以及用量的多少對(duì)實(shí)驗(yàn)很關(guān)鍵，總的來(lái)說(shuō)還是用適當(dāng)?shù)倪^(guò)量的綠葉較好，可以避免轉(zhuǎn)移過(guò)程中的損失，而且綠葉最好是深綠色的肉質(zhì)植物。2、研磨時(shí)加入適量的乙醇有助于打開(kāi)植物細(xì)胞壁，有利于色素的流出，第一次采用的是甲醇，第二次是石油醚，第三次是乙醇，實(shí)驗(yàn)結(jié)果從提取的汁液來(lái)看第三次的汁液明顯是深綠色，第一次是淺綠，第二次是淡黃色。通過(guò)查閱文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)比較，提取色素過(guò)程中，由于抽濾時(shí)不好控制，非極性溶劑難免會(huì)被抽去，且在幾次轉(zhuǎn)移中損失較多，程序繁雜。用浸泡法操作簡(jiǎn)便易行，損失少，產(chǎn)率高。因甲醇與乙醇的極性相近，乙醇易得，無(wú)毒，用95乙醇通過(guò)浸泡的方法提取菠菜色素為此實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件 。3、固定相的選擇也是一個(gè)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵，此次試驗(yàn)我們組并未將氧化鋁和硅膠兩種固定相一起作比較，但從別組兩種比較的結(jié)果來(lái)看，通過(guò)比較，中性氧化鋁雖用量比硅膠稍大，但其裝柱 較容易，只要保持比較均勻的速度從 漏斗中加入，且輕輕敲打柱身，柱內(nèi)氣泡就較少，柱子裝的也比較實(shí)，色帶的分離效果比硅膠明顯。使用硅膠做固定相時(shí)，雖用量較少，但在裝柱過(guò)程中，容易 出現(xiàn)大量泡，會(huì)影響色帶的分離。為消除氣泡，采用吸耳球?qū)χ蛹訅?，將氣泡擠出柱體。但這種方法容易導(dǎo)致柱子的堵塞，而且在加壓過(guò)程中，脫脂棉上層的少許沙子常會(huì)堵在滴定管的尖嘴處，導(dǎo)致色帶分離時(shí)溶劑不易滴出，延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，還影響了色帶分離效果。但采用硅膠做固定相時(shí)，第一個(gè)胡蘿卜素的橙黃色帶分離效果很好。同時(shí)用兩種固定相分離時(shí)，葉黃素的黃色色帶都分離不夠明顯，經(jīng)查閱資料認(rèn)為葉黃素易溶于醇而在石油醚中溶解度較小，從嫩綠菠菜得到 的提 取液中，葉黃素含量很少，所以柱色譜中不易分出黃色帶。但比較兩者，采用硅膠分離時(shí)，黃色色帶幾乎看不出來(lái)。因此采取氧化鋁做實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象更明顯。用中性氧化鋁作為固定相裝柱效果最好。裝柱的時(shí)候采取干法裝柱效果較好。 同時(shí)需注意在柱的底部要鋪少許的脫脂棉以防止氧化鋁堵塞柱子尖嘴處 。裝 完柱后還要在柱的頂部鋪一層細(xì)沙，當(dāng)溶劑下降到沙層時(shí)要及時(shí)添加，以防柱 身干裂。色譜柱頂部的氧化鋁和沙層注意不要傾斜，如果傾斜會(huì)影響色帶的分離效果。同時(shí)保持2 滴/s 的速度放出溶液(使色帶均勻下移)，所加壓力不要太大。六實(shí)驗(yàn)思考1、植物的綠葉在研磨時(shí)不要太爛而成糊狀導(dǎo)致不容易分離。2、葉綠素色素對(duì)光，溫度，氧氣，酸，堿及其它氧化劑都非常敏感，故色素的提取和分離應(yīng)避光。3、在洗脫過(guò)程中，不要大量放出溶液，以免固定相表面暴露導(dǎo)致柱子干裂。4、固定相的頂部保持水平，并且柱內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有氣