磁微球在生物學(xué)中的應(yīng)用.doc

磁性微球在生物學(xué)中的應(yīng)用一、磁性微球在核酸純化上的應(yīng)用核酸是現(xiàn)代生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究中的重要課題。核酸作為遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，除了在生物體正常的生長、發(fā)育、和繁殖等生命活動(dòng)中具有十分重要的作用外，它與生命的異常情況，如腫瘤發(fā)生、放射損傷、遺傳疾病等也有密切關(guān)系。因此核酸是現(xiàn)代生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究中的重要課題。無論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究，還是進(jìn)行基因工程、蛋白質(zhì)工程，首先需要對(duì)核酸進(jìn)行分離純化。超順磁性磁性微球是細(xì)胞分離、鑒定，基因分析，細(xì)菌和病毒的病原體診斷，核酸分離分析，蛋白質(zhì)純化的一個(gè)有效手段。通過寡聚核苷酸Oligo（dT）序列或鏈霉親和素等將DNA和RNA連接磁性微球表面已開發(fā)了許多應(yīng)用。1、DNA/RNA結(jié)合蛋白分離在基因表達(dá)中，蛋白質(zhì)也是一個(gè)重要角色，然而與DNA/RNA特異性結(jié)合得蛋白質(zhì)通常壽命都很短，且含量少，鏈霉親和素修飾的磁珠可用來提取分離DNP/RNP。結(jié)合有生物素的DNA或RNA序列與鏈霉親和素修飾的磁珠相互作用，蛋白質(zhì)識(shí)別了這些序列，就可在幾分鐘內(nèi)結(jié)合到固定化DNA/RNA上，這種方法已被用來分離轉(zhuǎn)錄因子，限制性內(nèi)切酶，復(fù)制蛋白等。2、mRNA分離在研究基因表達(dá)中，結(jié)合免疫磁性細(xì)胞分離和基于磁珠分離后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（Reverse transcription）及聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction， RT-PCR）擴(kuò)增，是一種強(qiáng)有力的手段。典型哺乳動(dòng)物一個(gè)細(xì)胞中只有大約10pg的RNA，而mRNA則僅占總RNA的15%。傳統(tǒng)的mRNA分離技術(shù)含有總RNA純化，即基于Oligo（dT）-纖維素親和色譜柱的PolyA+RNA選擇，此過程費(fèi)時(shí)并費(fèi)力。因此，Oligo（dT）25磁性微球被用于從復(fù)雜溶菌液中提取mRNA。Poly（A）-tail是mRNA序列上普遍存在的一段堿基，因此磁珠表面只需要有Oligo（dT）25序列，就可以有效地與mRNA上的Poly（A）-tail雜交，這種雜交非常迅速，在12分鐘內(nèi)就可完成，能有效地除去rRNA， tRNA以及其他RNA，且有70100的回收率。除去溶菌液的洗滌，整個(gè)提取只需耗時(shí)十五分鐘，且只用一個(gè)管，也不必前面的純化步驟。利用Oligo（dT）25磁性微球可在一小時(shí)內(nèi)從單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞等中提取出mRNA，磁珠也可以經(jīng)過改性后對(duì)血液、骨髓中的癌細(xì)胞進(jìn)行檢測或進(jìn)行單核細(xì)胞（mononuclear cell）制備。此外，磁珠還可從動(dòng)、植物組織中分離Mrna，比如，曾有人從血清、血漿、骨髓液中分理出聚腺苷酸（polyadenylated viral）RNA病毒：HIV-1RNA，從肝、脾、植入石蠟組織，以及果蠅中都提出了mRNA。利用這些磁珠從動(dòng)、植物細(xì)胞、組織等復(fù)雜樣品中提取的mRNA，可用于構(gòu)建cDNA文庫。Oligo（dT）25磁珠消除了總RNA純化，柱色譜處理，過濾，有機(jī)溶劑提取，醇沉淀等過程，酶的下游應(yīng)用也不會(huì)因?yàn)榇胖榈拇嬖诙艿揭种啤ligo（dT）25磁性微球最重要的特性還在于可定量提取mRNA，使得定量RT-PCR和環(huán)境監(jiān)測成為可行。實(shí)現(xiàn)mRNA提取高通量也已成為可能，F(xiàn)ang和Otto等已報(bào)道了96孔板和384孔板磁分離，可同時(shí)進(jìn)行96或384個(gè)樣品的提取。二、磁性微球在細(xì)胞標(biāo)記和細(xì)胞分離上的應(yīng)用細(xì)胞分離是生物細(xì)胞學(xué)研究中一種十分重要的技術(shù)，高效的細(xì)胞分離在細(xì)胞分離是生物細(xì)胞學(xué)研究中一種十分重要的技術(shù)，高效的細(xì)胞分離在臨床中是首要的、重要的步驟。這種細(xì)胞分離技術(shù)在醫(yī)療臨床診斷上有廣范的應(yīng)用，例如治療癌癥需在輻射治療前將骨髓抽出，且要將癌細(xì)胞從骨髓液中分離出來。傳統(tǒng)的細(xì)胞分離技術(shù)主要采用離心法，利用密度梯度原理進(jìn)行分離，時(shí)間長、效果差。隨著合成磁性微球的發(fā)展，免疫磁性微球在分離細(xì)胞方面已經(jīng)獲得了快速的發(fā)展，經(jīng)動(dòng)物臨床試驗(yàn)已獲成功。其中最重要的是選擇一種生物活性劑或者其他配體活性物質(zhì)（如抗體、熒光物質(zhì)、外源凝結(jié)素等），根據(jù)細(xì)胞表面糖鏈的差異，使其僅對(duì)特定細(xì)胞有親和力，從而達(dá)到分離、分類以及對(duì)其種類、數(shù)量分布進(jìn)行研究的目的。磁性微球用于細(xì)胞分離需要考慮以下幾個(gè)因素；不與非特定細(xì)胞結(jié)合、具有靈敏的磁響應(yīng)性、在細(xì)胞分離介質(zhì)中不凝結(jié)。Jhunu等人用外源凝結(jié)素分別修飾聚苯乙烯磁性微球和白蛋白磁性微球，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩者都有分離紅細(xì)胞的能力，白蛋白磁性微球效率比聚苯乙烯磁性微球的效率高得多，但是成本高。Wedemeyer N等人則將高分子磁性微球結(jié)合不同的DNA而可以達(dá)到經(jīng)濟(jì)快速分離各種不同的細(xì)胞的目的。利用磁流體或超順磁性物質(zhì)標(biāo)記細(xì)胞已是體內(nèi)細(xì)胞分離中日趨普遍的方法。多流體或超順磁性物質(zhì)標(biāo)記細(xì)胞已是體內(nèi)細(xì)胞分離中日趨普遍的方法。多數(shù)當(dāng)前用的標(biāo)記技術(shù)主要包括以下兩種方法：將磁性微球連接到細(xì)胞表面；通過液相內(nèi)吞、受體調(diào)解內(nèi)吞或噬菌作用使生物相容性磁性微球內(nèi)在化。有效而特異性的磁性微球細(xì)胞標(biāo)記策略就是用能經(jīng)過受體中介吞噬而被靶細(xì)胞吸收的配基，如單克隆抗體，對(duì)磁性納米微球進(jìn)行改性。靶向配基如：轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白、胰島素、生長因子等已被用于修飾細(xì)胞表面，且這些配基穩(wěn)定性好，并無免疫原性。而目前發(fā)展迅速的細(xì)胞磁分離技術(shù)，設(shè)備簡單，費(fèi)用低廉，儀器操作簡便，不影響細(xì)胞活性，且可實(shí)現(xiàn)連續(xù)分離，可克服熒光激活細(xì)胞分離法（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）和免疫親和柱分離法中，儀器昂貴，設(shè)備復(fù)雜，處理量小，且收集的細(xì)胞活性低的缺點(diǎn)。免疫磁性細(xì)胞分離法（Immunomagnetic cell separation methods）在細(xì)胞生物學(xué)中越來越成為專家學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。免疫磁性細(xì)胞分離依靠兩種機(jī)制實(shí)現(xiàn)靶細(xì)胞分離。直接方法就是通過將親和配基（即抗體）連接到磁性微球上，形成表面結(jié)合單克隆抗體的免疫磁性微球（immunomagnetic microspheres， IMMS），此抗體能特異性地與靶細(xì)胞結(jié)合并使之具有磁響應(yīng)性，當(dāng)此結(jié)合物受到外磁場作用時(shí)，可以使靶細(xì)胞與其它雜質(zhì)分離。間接法就是先將自由親和配基（抗體）加到細(xì)胞懸液中，孵化后沒有結(jié)合配基的細(xì)胞被洗掉，而抗體靶細(xì)胞復(fù)合物則通過標(biāo)記有另一配基（即二抗）的免疫磁性微球捕獲。三、磁性微球作為藥物載體的應(yīng)用 磁性高分子微球作為藥物載體，被注射到動(dòng)物體內(nèi)，在外加磁場下，通過納米粒子的導(dǎo)航，移向病變區(qū)，這就是磁性納米粒子在藥物中應(yīng)用的基本原理。用磁性高分子微球作為藥物載體可以提高藥效，降低藥物對(duì)正常細(xì)胞的傷害，成為磁控導(dǎo)彈，這也是當(dāng)今的熱門課題之一。Widder、Senyei、Monrimoto等人廣泛研究磁性微球，但是制得的粒徑多為13m，靶向定位效果不好。日本的Sako等制成海綿鐵顆粒（30m），治療肝癌、腎癌等后來人們發(fā)現(xiàn)將化療藥物和磁性材料一起包封于載體材料中，進(jìn)人體內(nèi)后在外磁場作用下使微球聚集于病變部位，可提高靶區(qū)內(nèi)的藥物濃度，從而提高療效，減少用藥劑量，降低全身毒副作用Morimoto Y等通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在沒有磁場的作用下，藥物主要集中在肝臟，而在磁場作用下，靜脈注射磁性微球達(dá)到外界放有磁場的肺部，動(dòng)脈注射磁性微球到達(dá)部Guph P K等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)磁性微球載有13的劑量的藥物，在靶區(qū)的濃度是自由藥物的8倍，而且在非靶向區(qū)域（肝、心臟）的藥物濃度明顯降低Iannotti J P等人報(bào)導(dǎo)在外界磁場的作用下，5080的微球定向到病變區(qū)，而無外界磁場時(shí)只有20的微球可到達(dá)病變區(qū)磁性高分子微球一般通過下面3種方式結(jié)合：1、藥物與高分子先結(jié)合成微球，磁粉再吸附其表面；2、磁粉和高分子先結(jié)合成微球再吸附藥物；3、磁粉、藥物、高分子一起混合經(jīng)均勻化后再微球化。Devineni等人合成magnetic microsphers methotrexate （MM-MTX） 藥物載體用以治療腫瘤，MTA通過2二甲胺甲基1乙基鏈接在磁性粒子的表面，通過水解可以釋放藥物但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在45min內(nèi)藥物又重新分配，導(dǎo)致小鼠的死亡此類問題有待進(jìn)一步研究解決。四、磁性微球在蛋白質(zhì)和多肽的分離與純化上的應(yīng)用傳統(tǒng)方法難以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離且保持其活性，但采用連在磁珠上的單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀富集，SDS-PAGE電泳法檢測則可達(dá)想要結(jié)果。用磁珠分離細(xì)胞溶菌液中的蛋白質(zhì)，幾乎不需要預(yù)先處理，與其他方法相比，非特異性結(jié)合也較少。要從全血，培養(yǎng)上清液，血清，腹水中分離蛋白質(zhì)，用于制備、分析，運(yùn)用磁珠作為固相載體進(jìn)行免疫測定的優(yōu)點(diǎn)在于快速的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和簡單的分離，洗滌過程。在蛋白質(zhì)純化中，為了得到高結(jié)合容量需使用大孔如粒徑為3.5um，并用鏈霉親和素修飾