誘導痰在氣道炎癥評價中的應用.doc

誘導痰檢測的方法學及其在氣道炎癥評價中的應用 羅煒 綜述 賴克方 鐘南山 審校 【摘要】 氣道炎癥在哮喘、慢性支氣管炎和間質(zhì)性肺炎等一系列疾病中扮演著重要的角色，而且被認為是導致氣道結(jié)構(gòu)改變的主要因素之一。誘導痰檢測作為一種無創(chuàng)、安全和可靠的氣道炎癥評價方法正日益受到重視和利用。關(guān)鍵詞? 誘導痰；氣道炎癥；哮喘；慢性阻塞性肺部疾病氣道炎癥在哮喘、慢性支氣管炎和間質(zhì)性肺炎等一系列疾病中扮演著重要的角色，而且是導致氣道結(jié)構(gòu)改變的主要因素之一。氣道炎癥的評估對于研究氣道疾病的發(fā)病機制起著重要作用。而且，能發(fā)現(xiàn)無臨床癥狀、無氣道高反應性和肺功能正常的早期氣道疾病1。以往，氣道炎癥通常用纖維支氣管鏡取材進行評價，但由于其屬于有創(chuàng)檢查，難以重復進行，使其應用受到限制2。 痰液檢查已經(jīng)有100多年的歷史，最初主要用于肺結(jié)核和肺腫瘤的診斷。未經(jīng)處理的痰液涂片，細胞分布不均，而且混在粘液中不易識別，使痰細胞學檢查的準確性受到影響。1958年Bickerman 等3首次建立了誘導痰檢測方法，對不能自然咳痰的患者進行高滲鹽水霧化獲得痰液，利用二硫蘇糖醇（DTT）等粘液溶解劑對痰進行處理，消除粘液的影響。1992年P(guān)in等4 首先開始用誘導痰分析哮喘患者的氣道炎癥狀況。近年來，誘導痰檢測作為一種無創(chuàng)、安全和可靠的氣道炎癥評價方法正日益受到重視。下面就誘導痰檢測的方法學及其在氣道炎癥評價的應用作一綜述。 1? 方法學 在Pin和Fahy兩種方案4，5 的基礎(chǔ)上，誘導痰檢測方法經(jīng)過多年的發(fā)展和改進，現(xiàn)已基本成熟，但各家報導的方案稍有不同。下面就目前常用的痰液誘導和處理程序作一簡介。 1.1? 痰液的誘導? 誘導前10分鐘讓病人吸入喘樂寧（沙丁胺醇氣霧劑），隨后檢測一秒最大呼氣量（FEV1），當FEV170%，對病人進行自然咳痰或等滲鹽水誘導處理，反之使用高滲鹽水誘導。常用的鹽水霧化程序有兩種：單一濃度高滲鹽水進行長時間的誘導；梯度高滲鹽水從低濃度到高濃度間斷的短時間誘導，兩種方法總的誘導時間都小于30分鐘。單一法的鹽水濃度常采用4%或4.5%，該方法具有操作簡便、鹽水對痰中細胞和可溶成分的影響可估量等優(yōu)點。梯度法常采用3%、4%、5%作為誘導濃度，此方法雖然操作繁復，較難估量鹽水對痰中細胞和可溶成分的影響，但能通過誘導間隔進行FEV1檢測，選擇是維持相同濃度還是采用下一個梯度濃度繼續(xù)誘導，如果FEV1降低超過20則終止誘導，提高誘導的安全性和成功率。也有研究者選用5%、7%、9%作為梯度濃度。痰液誘導過程還要注意采用各種方法，盡量減少唾液對痰的污染和稀釋6，由于肥大細胞在高滲溶液和Ca2+存在的環(huán)境中容易被激活并釋放組胺，所以研究肥大細胞時應盡量避免采用高滲鹽水進行誘導或通過咳痰前的漱口來減少痰液中高滲鹽水的殘留量 7。痰液誘導出來后必須進行細胞分類和活力檢測，合格標準一般為上皮細胞40%。 另外據(jù)文獻報道甘露醇和5三磷酸鹽尿嘧啶也可作為誘導物8，9，但由于甘露醇具有較明顯的刺激支氣管收縮作用，對于哮喘病人不適用，臨床通常將其作為激發(fā)試驗的刺激物使用。尿嘧啶一方面能刺激氣道上皮P2Y2受體，打開Cl通道，使分泌物穿越粘膜進入氣管腔，另一方面促進粘膜下的腺體和杯狀細胞分泌粘液，同時增加氣道纖毛的清理作用，與高滲鹽水誘導相比，痰量增加了一倍，而患者的SaO2和PEF等指標的下降比高滲鹽水誘導明顯降低，同時兩種方法的痰細胞總數(shù)和分類的結(jié)果相近。由于尿嘧啶誘導法具有以上優(yōu)點，有望成為一種評價呼吸系統(tǒng)疾病特別是哮喘的氣道炎癥的手段，具有一定的應用前景。 1.2? 痰液的處理? 當前痰的處理主要有兩種方法，一種是全取法10 ，即收集患者咳出的全部痰，另一種是選取法11，即挑選痰栓或痰的粘稠部分進行處理。據(jù)Antonio報道12，選取法的細胞存活率（80.6%）、嗜酸粒細胞比例（15.3%）和嗜酸粒細胞陽離子蛋白（ECP）濃度（548ug/L）顯著高于全取法的細胞存活率（71.8%）、嗜酸粒細胞比例（8.3%）和ECP濃度（105ug/L），而選取法的中性粒細胞比例（33.3%）則顯著低于全取法（42.7%），使用上述兩種方法對正常人的痰進行處理時，亦顯示選取法優(yōu)于全取法。 由于嗜酸粒細胞主要分布在痰栓中，加入和痰等體積的0.1%DTT或其光學異構(gòu)體DTE漩渦震蕩2分鐘，37水浴15分鐘能有效地溶解粘液，使痰均勻化以便進行檢測。實驗證明13在室溫或37下，DTT都能提高細胞和可溶物質(zhì)的檢測質(zhì)量，而且不會刺激嗜酸粒細胞釋放ECP，嗜堿粒細胞和肥大細胞釋放組胺；并在不影響細胞分類計數(shù)的前提下，提高細胞的回收率；對細胞因子的檢測也無干擾。 2? 可行性和安全性 由于高滲鹽水是支氣管激發(fā)劑，對病人特別是未完全控制的哮喘或慢性氣道阻塞患者進行誘導時有一定危險性。據(jù)Vlachos-Mayer報道14，由熟練的研究人員嚴格按照操作規(guī)范對304例哮喘和25例慢阻肺患者進行痰誘導，73%的患者使用小于5%的高滲鹽水，其中又有28%的患者使用生理鹽水，成功率可達93%，只有8%的哮喘患者FEV1降低超過20%，而這些患者在誘導完成后吸入舒喘寧（200ug-400ug），F(xiàn)EV1都在30分鐘內(nèi)基本恢復到誘導前水平。另據(jù)Anneke報道15，使用0.9%、3.0%和4.5%梯度鹽水對93例重癥和難控制性哮喘患者進行痰誘導，成功率也能達到74%，只有22%的患者FEV1降低超過15%。以上報道與其他文獻16共同提示誘導痰技術(shù)對于臨床研究氣道炎癥是一種較安全和成功率較高的檢測手段。需要強調(diào)的是，誘導前必須準備好相關(guān)的搶救設(shè)備和藥物，誘導過程必須小心處理，如果病人出現(xiàn)呼吸道不適癥狀，建議馬上終止誘導。 3.? 有效性與重復性 正常人和哮喘、慢阻肺病人的痰細胞成分、炎癥介質(zhì)和細胞因子等存在明顯區(qū)別。由于PBS灌洗液對支氣管肺泡灌洗液（BALF）造成不同程度的稀釋，所以對炎性介質(zhì)和細胞因子等檢測受到限制。痰與BALF相比，含有更多的中性粒和嗜酸粒細胞，較少的單核和淋巴細胞。痰嗜酸粒細胞分類與支氣管灌洗液、BALF的嗜酸粒細胞分類相關(guān)性較好。據(jù)Pin 和 Spanavello報道，在同一誘導技術(shù)的前提下，不同時間里對癥狀穩(wěn)定的患者進行痰細胞分類和痰內(nèi)可溶性介質(zhì)檢測，其重復性除了淋巴細胞之外都非常好，相關(guān)系數(shù)分別達到0.7和0.6以上17,18。 4.? 應用 4.1? 診斷方面? 痰是呼吸道粘膜的分泌物，主要成分是粘液和細胞。據(jù)Belda報道正常痰液細胞主要是吞噬細胞(61%)和中性粒細胞(36%)，嗜酸粒細胞和淋巴細胞較少見19。細胞分類計數(shù)的異常提示不同的氣道炎癥和誘因。研究表明嗜酸粒細胞增高(3%)是支氣管哮喘、嗜酸粒細胞支氣管炎和過敏性疾病20，21的特征性標志，同時痰細胞計數(shù)是嗜酸粒細胞支氣管炎的主要診斷依據(jù)22。而且痰嗜酸粒細胞比起血清ECP，更能靈敏和準確地反映哮喘患者的氣道炎癥狀況23。它不但能反映哮喘發(fā)病的進程，并與氣道阻塞和氣道高反應性成正相關(guān)。哮喘發(fā)作時痰嗜酸粒細胞呈二至三倍的增長24,25，同時痰ECP、IL-5也伴隨有顯著的增高，隨著過敏原的消失或吸入激素治療后，痰嗜酸粒細胞和ECP也會隨之減少。痰和血清ECP的濃度并無相關(guān)性，當痰ECP伴隨癥狀改善而下降時血清ECP濃度并無改變。這些研究結(jié)果提示痰嗜酸粒細胞和其脫顆粒產(chǎn)物的水平對于描述炎癥的程度有重要作用。由于肥大細胞、嗜酸粒細胞和淋巴細胞在哮喘的氣道炎癥特征如支氣管痙攣收縮、氣道阻塞和氣道高反應上扮演重要的角色，所以檢測痰粘液中上述細胞的產(chǎn)物有助于哮喘的診斷和發(fā)病機理的研究。據(jù)Birring報道CVA和EB病人的誘導痰中組胺、白三烯、前列腺素D2、E2和白介素8與正常人相比都有顯著差異26。但由于炎癥介質(zhì)和細胞因子的檢測容易受到痰處理過程的各種因素的干擾而且費用昂貴，通常不作為疾病診斷的首選指標。另外如果利用上下班不同時段對誘導痰進行連續(xù)監(jiān)測，該技術(shù)還可應用于職業(yè)性哮喘的研究27。 COPD患者痰內(nèi)主要是中性粒細胞， Keatings和Thompson研究發(fā)現(xiàn)呼吸道內(nèi)中性粒細胞浸潤程度達到70%28,29，BALF里中性粒細胞是正常人的二至三倍29,30。中性粒細胞可以產(chǎn)生大量的彈性蛋白水解酶，導致肺實質(zhì)的彈性纖維破壞和彈性下降，最終導致肺氣腫?；加袣獾雷枞幕颊咂鋰乐爻潭扰c痰中性粒細胞的百分比成正比。小氣道和肺泡管是COPD患者氣道阻力增加的主要部位31，該部位炎癥的變化與氣道的阻塞相關(guān)聯(lián)32?？梢钥隙ㄕT導的痰液包含著下呼吸道的物質(zhì)，所以誘導痰是一種研究COPD氣道炎癥的有用工具。 目前世界衛(wèi)生組織建議將在呼吸道分泌物中找到抗酸桿菌作為診斷肺結(jié)核的首要依據(jù)，但由于該方法的敏感性不高而且有相當部分的疑似病人不能自然咳出合格的痰而局限了該方法的應用。Conde等人33發(fā)現(xiàn)通過誘導痰這種無創(chuàng)的，安全的方法能解決上述無法自然咳痰的問題，而且結(jié)果與纖維支氣管鏡取材結(jié)果相一致，從而能大大提高結(jié)核的檢出率。 對于肺癌病人，最佳的防治方案是能在早期或者癥狀出現(xiàn)前確診。Vignola發(fā)現(xiàn)34通過檢測誘導痰其特異性的致癌基因、抑癌基因表達、基因組的不穩(wěn)定性和異常甲基化等指標，有可能在患者臨床診斷肺癌前幾年即可以分子生物學方法進行診斷。 4.2? 治療方面? 由嗜酸粒細胞或中性粒細胞引起的不同炎癥，其治療方案各有不同。慢性咳嗽、哮喘或COPD患者的痰嗜酸粒細胞數(shù)量常預示其對激素治療效果的好壞35。伴有嗜酸粒細胞增多的慢性咳嗽和COPD對吸入激素治療效果顯著，足量的激素治療可使嗜酸粒細胞降低到正常水平，但非嗜酸粒細胞增多的慢性咳嗽和COPD則一般對皮質(zhì)類固醇無效36。通過觀察嗜酸粒細胞數(shù)量衡量激素治療效果的哮喘患者的要考慮幾個因素，第一，病人的依從性；第二，病人生活或工作環(huán)境中是否存在頻繁的變應原刺激；第三，激素治療劑量不足；第四，診斷錯誤，是中性粒細胞而非嗜酸粒細胞性哮喘或激素耐受型哮喘。痰細胞計數(shù)在治療由吸煙或肺氣腫引起的慢性氣道阻塞也有一定幫助37,38，痰嗜酸粒細胞的增高提示可用強的松改善癥狀，中性粒細胞的增高提示患者有感染，可施以抗菌治療。 5.? 存在問題與展望 雖然誘導痰檢測技術(shù)的優(yōu)點有目共睹，但其不足之處也不容忽視。首先目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的誘導痰標準化處理方案,不同方案處理得出的結(jié)果有一定的差異39，影響資料的可比性和該方法的廣泛利用。其二，由于處理過程中，鹽水和唾液對不同標本的稀釋度存在差異，或在測定痰液上清炎癥介質(zhì)時，DTT、蛋白酶或其它未知成分的復合物對免疫測定或其他檢測程序的潛在干擾因素都會影響結(jié)果的可靠性，而且可溶性介質(zhì)的正常范圍也沒確定，降低其對于臨床的提示作用40。其三，由于痰液存放時間較短，4只能存放2小時，標本不能留待批量處理，而痰的誘導和處理過程手工步驟多、耗時較長等都是影響該方法作為常規(guī)檢測項目的不利因素。 如何