基因符號概述.ppt

二 基因符號 1966年由Demerec提出大腸桿菌命名規(guī)則 在此基礎(chǔ)上發(fā)展成為公認的基因命名規(guī)則 每個基因座位用斜體小寫的三個英文字母表示 trp tryptophan 色氨酸基因 str streptomycin 鏈霉素抗藥性基因2 產(chǎn)生同一表型的不同基因 在三個字母后用大寫英文字母表示trpA和trpB 3 同一基因不同突變位點 在基因符號后加阿拉伯數(shù)字 trpA23 trpA46 基因的表型和產(chǎn)物用三個正體英文字母表示 Ara Ara 4 某些基因特征不能用一個字表示 需要幾個字 則采用幾個字的首字母 例如 與核糖體大蛋白亞基相關(guān)基因 rpL rpS str 鏈霉素抗藥性基因 可以寫成rpsL 5 his 組氨酸野生型 his 組氨酸缺陷型 strs 鏈霉素敏感野生型strr 鏈霉素抗藥性突變型strd 鏈霉素依賴型6 當染色體上存在缺失時 缺失部分放在 后括號內(nèi) lac pro 表示從乳糖發(fā)酵基因到脯氨酸基因的染色體缺失 rfa uvrB 深度粗糙突變性基因 缺失了自外損傷修復(fù)基因 7 易位 T T 1 固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)突變率計算方法 大腸桿菌抗性突變 一個菌落代表一次抗性突變 無論該菌分裂多少次 仍然為一個抗性菌落 突變型菌落數(shù) 突變發(fā)生次數(shù)在這種情況下 突變率計算按公式計算 突變率 M2 M1 N2 N1M2 M1前后兩個時間出現(xiàn)抗性菌落數(shù)N2 N1前后兩個時間的細菌總數(shù) 考慮到細菌分裂不是同步進行的細菌世代總數(shù) N2 N1 0 69突變率 M2 M1 0 69 N2 N1 1 堿基類似物引起的誘變 堿基類似物 指分子結(jié)構(gòu)上與DNA中堿基非常相似的一類化合物 在DNA復(fù)制中可替代正常堿基參入到DNA鏈中 引起配對錯誤發(fā)生誘變 一堿基置換 一 化學(xué)誘變 1 堿基類似物 5 溴尿嘧啶 5 BU 與胸腺嘧啶 T 結(jié)構(gòu)相似5 溴尿嘧啶 5 BU 有酮式和稀醇式 為主 兩種形式5 BU可引起AT GCGC AT 為主 5 BU使細菌突變率提高萬倍 5 5 T 酮式為主5 BU 稀醇式為主 5 酮式 稀醇式 正確配對復(fù)制錯誤兩代以后還會出現(xiàn) 錯誤配對參入錯誤兩代以后不會出現(xiàn) GC AT主要 2 堿基類似物 2 氨基嘌呤 2 AP 與腺嘌呤A相似2 AP可與T 為主 和C配對2 AP可引起AT GC 為主 GC AT 圖 與A結(jié)構(gòu)相似 為主 AT GC met回復(fù)突變正確配對復(fù)制錯誤兩代以后還會出現(xiàn) GC AT arg回復(fù)突變錯誤配對參入錯誤兩代以后不會出現(xiàn) 3 烷化劑類 種類多 甲基磺酸乙酯 EMS 乙基磺酸乙酯 EES 和亞硝基胍 NTG 作用 使DNA中堿基發(fā)生烷基化例如EMS使鳥嘌呤帶有乙基 該鳥嘌呤不與C配對 而與T配對 引起GC AT的轉(zhuǎn)換亞硝基胍 NTG 超誘變劑 使基因突變率高達1 引起并發(fā)突變 圖 二 物理誘變劑的種類及作用機制 1 輻射的種類 電離輻射和非電離輻射1 電離輻射 是一切能引起物質(zhì)電離的輻射總稱 包括高速帶電粒子有 粒子 粒子 質(zhì)子 不帶電粒子有中子以及X射線 射線 射線是一種帶電粒子流 很容易引起電離 穿透能力差 射線也是一種高速帶電粒子 其電離能力比 射線小 但穿透本領(lǐng)比 射線大 X射線和 射線的穿透力極強 波長短 能量大 僅一部分被物質(zhì)所吸收 大部分經(jīng)由原子間隙而透過 這正是X射線透視和攝影的物理基礎(chǔ) 2 非電離輻射 是指波長大于100納米的電磁波 由于其能量低 不能引起水和組織電離 故稱為非電離輻射 非電離輻射包括光和電磁輻射 光包括可見光 紅外線 紫外線電磁輻射包括超聲波 頻率比人的聽頻范圍高的聲波就叫做超聲波 高于20000Hz 超聲波的頻率高 相對較少出現(xiàn)繞射現(xiàn)象 所以回聲十分清晰 超聲波掃描不涉及有害的輻射 遠比X 射線等檢驗工具安全 2 輻射的生物學(xué)效應(yīng) DNA經(jīng)過輻射處理通常發(fā)生以下變化 堿基受損 發(fā)生開環(huán) 脫氨和過氧化 脫氧核糖分子C C斷裂或 OH氧化 單核苷酸分解 釋放出磷酸酯和堿基 DNA分子斷裂 形成胸腺嘧啶二聚體 DNA分子交聯(lián) 胸腺嘧啶二聚體 1 電離輻射作用 直接作用指射線直接作用于DNA分子 通過電離和激發(fā)使DNA受到損傷 間接作用指射線與DNA周圍其它原子或分子特別是水分子作用 產(chǎn)生具有很高活性的自由基 如 OH H和eaq 進而損傷DNA 堿基變化脫氧核糖變化DNA鏈斷裂 單鏈斷裂 SSB 雙鏈斷裂 DSB 交聯(lián) DNA鏈交聯(lián)DNA 蛋白質(zhì)交聯(lián)其中DSB是輻射所致生物學(xué)效應(yīng)中最重要的原初損傷 電離輻射致DNA分子的變化 二 嵌合劑和移碼突變 移碼突變 DNA分子中一對或少數(shù)幾對核苷酸的增加或缺失 造成該位置后面的密碼意義全部發(fā)生錯誤 三對除外 ATGAAAGAG ATGGAG Deletions Oneormorebasepairsarelost Possibleresultsa aminoacidsorpolypeptidescanbelostb frameshiftscanoccur seebelow TB 二DNA損傷 修復(fù) 1DNA損傷 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生的任何改變 可以分為兩類 單個堿基改變和結(jié)構(gòu)扭曲 2自發(fā)性損傷 化學(xué)因素 物理因素3DNA修復(fù) 為了保證遺傳信息的高度穩(wěn)定性 生物細胞在進化過程中形成了一系列多步驟的修復(fù)機制 一 光修復(fù) 這是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修復(fù)方式 修復(fù)是由細菌中的DNA光解酶 photolyase 完成 此酶能特異性識別紫外線造成的核酸鏈上相鄰嘧啶共價結(jié)合的二聚體 并與其結(jié)合 這步反應(yīng)不需要光 結(jié)合后如受300 600nm波長的光照射 則此酶就被激活 將二聚體分解為兩個正常的嘧啶單體 然后酶從DNA鏈上釋放 DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu) 此酶廣泛存在 但人體只存在于淋巴細胞和皮膚成纖維細胞 且是次要修復(fù)方式 1 細胞內(nèi)有多種特異的核酸內(nèi)切酶 可識別DNA的損傷部位 在其附近將DNA單鏈切開 再由外切酶將損傷鏈切除 由聚合酶以完整鏈為模板進行修復(fù)合成 最后有連接酶封口 uvrA uvrB uvrC 編碼內(nèi)切核酸酶2 堿基脫氨形成的尿嘧啶 黃嘌呤和次黃嘌呤可被專一的N 糖苷酶切除 然后用AP核酸內(nèi)切酶打開磷酸二酯鍵 進行切除修復(fù) 二 切除修復(fù) 復(fù)制后修復(fù) post replicationrepair 因為它們在復(fù)制后起作用 也稱為 重組修復(fù) recombination repair 此系統(tǒng)在處理復(fù)制含有損傷堿基模板后產(chǎn)生的子代二倍體的缺陷中起作用重組酶 recA recB recC 染色體交換 重組修復(fù)中原損傷沒有除去 但若干代后可逐漸稀釋 消除其影響 所需要的酶包括與重組及修復(fù)合成有關(guān)的酶 如重組蛋白A B C及DNA聚合酶 連接酶等 三 重組修復(fù) 四 SOS系統(tǒng)許多損傷DNA或抑制大腸桿菌復(fù)制的手段引起一系列綜合的表現(xiàn)型改變 稱為SOS反應(yīng) 這是由RecA蛋白和LexA抑制物相互作用而引起的 SOS反應(yīng)表現(xiàn)為修復(fù)損傷DNA的能力增強 這是通過誘導(dǎo)修復(fù)系統(tǒng)和RecA重組修復(fù)系統(tǒng)組分的合成來實現(xiàn)的 Insertions ATGAAAGAG ATGGAG Possibleresultsa aminoacidsorpolypeptidescanbegained b frameshiftscanoccur seebelow Oneormorebasepairsaregained TB 嵌合劑引起移碼突變 ICR191 5 氨基吖啶 吖啶橙 原黃素 為平面三環(huán)化合物 可插入二個堿基對中間 使得原來的相鄰的堿基相互分離 這種DNA分子在復(fù)制過程中很容易插入1 2個堿基 從而引起移碼突變 吖啶橙插入到兩對堿基之間 Frameshiftmutations 移碼突變 ATGCAAGTTG onebasepairdeletion Insertionsordeletionsthatchangethetranslationalframe Twochangesinpolypeptidesarepossible 1 everyaminoaciddownstreamofthemutationischanged 2 atruncated shortened proteinisproduced TB 野生型DNA 部分單鏈消失 突環(huán)形成 修補合成 CA錯配的產(chǎn)生 營養(yǎng)缺陷型誘變篩選步驟及方法 營養(yǎng)缺陷型濃縮營養(yǎng)缺陷型檢出營養(yǎng)缺陷型鑒定 1營養(yǎng)缺陷型濃縮 1 抗生素法 野生型能在MM中生長 而缺陷型不能 于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長 處于活化階段 而缺陷型無法生長 仍處于休眠狀態(tài) 由于野生細菌或酵母對一些抗生素敏感 于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素 結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死 保存了缺陷型 一般細菌可以采用青霉素 酵母可采用制霉菌素 抗生素法原理 青霉素 制霉菌素等抗生素作用于生長著的微生物細胞 對休止態(tài)細胞無作用 方法 將菌培養(yǎng)在含抗生素的MM基中 原養(yǎng)型 營養(yǎng)缺陷型 2 菌絲過濾法 適用于進行絲狀生長的真菌和放線菌 其原理是 在基本培養(yǎng)基中 野生型菌株的孢子能發(fā)芽成菌絲 而營養(yǎng)缺陷型的孢子則不能 通過過濾就可除去大部分野生型 保留下營養(yǎng)缺陷型 菌絲過濾法 適用于 絲狀 放線菌 霉菌 原理 基本培養(yǎng)基上只有發(fā)育成菌絲 auxo孢子可通過濾膜 野生型菌絲不能通過 3 差別殺菌 芽孢桿菌 80 15min 酵母菌 58 4min4 饑餓法 胸腺嘧啶缺陷 氨基酸缺陷 2營養(yǎng)缺陷型檢出 原理 在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上 生長情況完全不同 缺陷型在CM上生長良好 而在MM上則不生長 野生型都能生長 具體方法 影印法 點種法 夾層法 逐個檢出法 把經(jīng)誘變處理的細胞群涂布在完全培養(yǎng)基的瓊脂平板上 待長成單個菌落后 用接種針或滅過菌的牙簽把這些單個菌落逐個整齊地分別接種到基本培養(yǎng)基平板和另一完全培養(yǎng)基平板上 使兩個平板上的菌落位置嚴格對應(yīng) 經(jīng)培養(yǎng)后 如果在完全培養(yǎng)基平板的某一部位上長出菌落 而在基本培養(yǎng)基的相應(yīng)位置上卻不長 說明此乃營養(yǎng)缺陷型 逐個檢出法 完全培養(yǎng)基 影印平板培養(yǎng)法 將誘變劑處理后的細胞群涂布在一完全培養(yǎng)基平板上 經(jīng)培養(yǎng)長出許多菌落 用特殊工具 印章 把此平板上的全部菌落轉(zhuǎn)印到另一基本培養(yǎng)基平板上 經(jīng)培養(yǎng)后 比較前后兩個平板上長出的菌落 如果發(fā)現(xiàn)在前一培養(yǎng)基平板上的某一部位長有菌落 而在后一平板上的相應(yīng)部位卻呈空白 說明這就是一個營養(yǎng)缺陷型突變株 影印平板培養(yǎng)法 夾層培養(yǎng)法 先在培養(yǎng)皿底部倒一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基 待凝 添加一層混有經(jīng)誘變劑處理菌液的基本培養(yǎng)基 其上再澆一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基 經(jīng)培養(yǎng)后 對首次出現(xiàn)的菌落用記號筆一一標在皿底 然后再加一層完全培養(yǎng)基 培養(yǎng)后新出現(xiàn)的小菌落多數(shù)都是營養(yǎng)缺陷型突變株 夾層培養(yǎng)法 3營養(yǎng)缺陷型鑒定 可借生長譜法進行 生長譜法是指在混有供試菌的平板表面點加微量營養(yǎng)物 視某營養(yǎng)物的周圍有否長菌來確定該供試菌的營養(yǎng)要求的一種快速 直觀的方法 用此法鑒定營養(yǎng)缺陷型的操作是 把生長在完全培養(yǎng)液里的營養(yǎng)缺陷型細胞經(jīng)離心和無菌水清洗后 配成適當濃度的懸液 如107 108個 ml 取0 1ml營養(yǎng)缺陷型細胞懸液與基本培養(yǎng)基均勻混合后 傾注在培養(yǎng)皿內(nèi) 待凝固 表面干燥后 在皿背劃幾個區(qū)然后在平板上按區(qū)加上微量待鑒定缺陷型所需的營養(yǎng)物粉末 用濾紙片法也可 例如氨基酸 維生素 嘌呤或嘧啶堿基等 經(jīng)培養(yǎng)后 如發(fā)現(xiàn)某一營養(yǎng)物的周圍有生長圈 就說明此菌就是該營養(yǎng)物的缺陷型突變株 用類似方法還可測定雙重或多重營養(yǎng)缺陷型 生長譜法方法簡便 回變和污染不影響結(jié)果測定物質(zhì)可為粉末或紙片 缺陷型的鑒定 測定一般應(yīng)分兩階段 第一階段 測定是哪類物質(zhì)的缺陷型 第二節(jié)段 根據(jù)第一階段確定的范圍 進一步確定是哪種具體化合物的缺陷型 鑒定營養(yǎng)缺陷型 含營養(yǎng)缺陷型菌株的基本培養(yǎng)基平板的制備 營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)類別的鑒定 缺陷型菌株單一營養(yǎng)因素的鑒定 第八節(jié)誘變選育 一誘變處理 1一般采用生理狀態(tài)一致 用選擇法或誘導(dǎo)法使微生物同步生長 的單細胞或孢子進行誘變處理 所處理的細胞必須是均勻而分散的單細胞懸液 分散狀態(tài)的細胞可以均勻地接觸誘變劑 又可避免長出不純菌落 由于某些微生物細胞是多核的 即使處理其單細胞 也會出現(xiàn)不純的菌落 因此用于誘變育種的細胞應(yīng)盡量選用單核細胞 如霉菌或放線菌的孢子或細菌的芽孢 2細胞的生理狀態(tài)對誘變處理也會產(chǎn)生很大的影響 細菌在對數(shù)期誘變處理效果較好 霉菌或放線菌的分生孢子一般都處于休眠狀態(tài) 所以培養(yǎng)時間的長短對孢子影響不大 但稍加萌發(fā)后的孢子則可提高誘變效率 在實際工作中 要得到均勻分散的細胞懸液 通?？捎脽o菌的玻璃珠來打散成團的細胞 一般處理真菌的孢子或酵母細胞時 其懸浮液的濃度大約為106個 ml 細菌和放線菌孢子的濃度大約為108個 ml 2劑量的選擇受處理條件 菌種情況 誘變劑的種類等多種因素的影響 劑量一般指強度與作用時間的乘積 要確定一個合適的劑量 通常要進行多次試驗 在實際工作中 突變率往往隨劑量的增高而提高 但達到一定程度后 再提高劑量反而會使突變率下降 根據(jù)對紫外線 X射線和乙烯亞胺等誘變效應(yīng)的研究結(jié)果 發(fā)現(xiàn)正變較多地出現(xiàn)在偏低的劑量中 而負變則較多地出現(xiàn)于偏高的劑量中 還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中 更容易出現(xiàn)負變 因此 在誘變育種工作中 目前比較傾向于采用較低的劑量 例如 過去在用紫外線作誘變劑時 常采用殺菌率為99 的劑量 而近年來則傾向于采用殺菌率為30 75 的劑量 3中間培養(yǎng) 讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時 以讓細胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制 讓細胞繁殖幾代 以得到純的變異細胞 若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng) 直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能 形成混雜菌落 以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化 篩選分初篩和復(fù)篩 初篩以