KJ 201907 液體乳中三聚氰胺的快速檢測 膠體金免疫層析法

附件7液體乳中三聚氰胺的快速檢測膠體金免疫層析法(KJ201907)1 范圍本方法規(guī)定了液體乳中三聚氰胺的膠體金免疫層析快速檢測方法。本方法適用于巴氏殺菌乳、滅菌乳、調(diào)制乳和發(fā)酵乳中三聚氰胺的快速測定。2 原理本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的三聚氰胺與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條或檢測卡中檢測線（T線）上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線（C線）顏色深淺比較，對樣品中三聚氰胺進(jìn)行定性判定。3 試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級水。3.1 試劑3.1.1 甲醇。3.1.2 三羥甲基氨基甲烷（Tris）。3.1.3 1mol/L鹽酸：移取83 mL濃鹽酸，加入900mL水中，定容至1 L。3.1.4 甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取50 mL甲醇和50 mL水，混勻后備用。3.1.5 稀釋液：準(zhǔn)確稱取6.05 g Tris（3.1.2）和8.5 g 1mol/L鹽酸（3.1.3），加水定容至1 L，混勻后備用。3.2 參考物質(zhì)參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量見表1，純度99%。表1 三聚氰胺參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量中文名稱英文名稱CAS登錄號分子式相對分子質(zhì)量三聚氰胺Melamine108-78-1C3H6N6126.12注：或等同可溯源物質(zhì)。3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1000 g/mL）：精密稱取適量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（3.2），置于10 mL容量瓶中，用甲醇水溶液（3.1.4）溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1000 g/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液；或可直接購三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液。4避光保存?zhèn)溆?，有效?個月。3.4 三聚氰胺膠體金免疫層析試劑盒3.4.1 金標(biāo)微孔（含膠體金標(biāo)記的特異性抗體）。3.4.2 試紙條或檢測卡。4 儀器和設(shè)備4.1 移液器：200 L、1000 L和5 mL。4.2 渦旋混合器。4.3 電子天平：感量為 0.01 g。4.4 環(huán)境條件：溫度1535，濕度80%。5 分析步驟5.1 試樣制備取適量有代表性樣品充分混勻。5.2 試樣提取準(zhǔn)確稱取樣品0.5 g于離心管中，加入5 mL稀釋液（3.1.5），渦旋混勻提取5 min，即得待測液。注：試樣提取過程可按照試劑盒說明書，不做限定。5.3 測定步驟5.3.1 試紙條與金標(biāo)微孔測定步驟吸取150200 L樣品待測液于金標(biāo)微孔（3.4.1）中，抽吸510次使混合均勻，不要有氣泡，40溫育3 min，將檢測試紙條（3.4.2）樣品端垂直向下插入金標(biāo)微孔中，40溫育5 min，從微孔中取出試紙條，進(jìn)行結(jié)果判定。5.3.2 檢測卡測定步驟吸取150-200 L樣品待測液于檢測卡加樣孔（3.4.2）中，室溫反應(yīng)3-5 min，進(jìn)行結(jié)果判定。5.4 質(zhì)控試驗每批樣品應(yīng)同時進(jìn)行空白試驗和加標(biāo)質(zhì)控試驗。5.4.1 空白試驗稱取空白試樣，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。5.4.2 加標(biāo)質(zhì)控試驗準(zhǔn)確稱取空白試樣100 g（精確至0.01 g）置于100 mL玻璃溶液瓶中，加入250 L三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 g/mL）（3.3），使試樣中三聚氰胺濃度為2.5 mg/kg，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。注：可參考標(biāo)準(zhǔn)品的說明書配置操作。6 結(jié)果判定要求通過對比控制線（C線）和檢測線（T線）的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。目視結(jié)果判讀如圖1。6.1 無效控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試紙條/檢測卡無效。6.2 陽性結(jié)果6.2.1 消線法檢測線（T線）不顯色，控制線（C線）顯色，表明樣品中三聚氰胺含量高于方法檢測限，判定為陽性（如圖1試紙條/檢測卡目視判定示意圖 ）。6.2.2 比色法檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色淺或幾乎不顯色，表明樣品中三聚氰胺含量高于方法檢測限，判定為陽性（如圖1試紙條/檢測卡目視判定示意圖 ）。6.3 陰性結(jié)果6.3.1 消線法檢測線（T線）、控制線（C線）均顯色，表明樣品中三聚氰胺含量低于方法檢測限，判定為陰性（如圖1試紙條/檢測卡目視判定示意圖 ）。6.3.2 比色法檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或者檢測線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相當(dāng)，表明樣品中三聚氰胺含量低于方法檢測限，判定為陰性（如圖1試紙條/檢測卡目視判定示意圖 ）。試紙條手持端C線T線樣品端檢測卡加樣孔T線C線C線T線T線T線C線C線陰性陽性陽性陰性消線法比色法結(jié)果無效檢測裝置示意圖圖1 試紙條/檢測卡目視判定示意圖6.4 質(zhì)控試驗要求空白試驗測定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗測定結(jié)果應(yīng)為陽性。6.5 讀數(shù)儀測定法按讀數(shù)儀說明書要求操作直接讀取并進(jìn)行結(jié)果判定。7 結(jié)論三聚氰胺與滅蠅胺有交叉反應(yīng)，當(dāng)檢測結(jié)果為陽性時，應(yīng)對三聚氰胺結(jié)果進(jìn)行確證。8 性能指標(biāo)8.1 檢測限2.5mg/kg。8.2 靈敏度靈敏度應(yīng)99%8.3 特異性特異性應(yīng)85%。8.4 假陰性率假陰性率應(yīng)1%。8.5 假陽性率假陽性率應(yīng)15%。注：性能指標(biāo)計算方法參見附錄A。9 其他本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做限定，可根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。方法使用者應(yīng)使用經(jīng)過驗證的滿足本方法規(guī)定的各項性能指標(biāo)的試劑、試劑盒。本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法（GB/T 22388-2008）。本方法使用試劑盒可能與滅蠅胺存在交叉反應(yīng)，當(dāng)結(jié)果判定為陽性時，應(yīng)采用實驗室儀器方法食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法（GB/T 22388-2008）對三聚氰胺結(jié)果進(jìn)行確證。附錄A快速檢測方法性能指標(biāo)計算表表A.1性能指標(biāo)計算方法樣品情況a檢測結(jié)果b總數(shù)陽性陰性陽性N11N12N1.=N11+N12陰性N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N21N.2=N12+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異（2）2=（|N12-N21|-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1靈敏度（p+，%）p+=N11/N1.特異性（p-，%）p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特異性相對準(zhǔn)確度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：a由參比方法檢驗得到的結(jié)果或者樣品中實際的公議值結(jié)果；b由待確認(rèn)方法檢驗得到的結(jié)果。靈敏度的計算使用確認(rèn)后的結(jié)果。N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個下標(biāo)指行，第二個下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N1