「固定化酶技術及應用的研究進展【特選參考】」.doc

固定化技術研究進展摘要：固定化酶技術作為一門交叉學科技術，在生命科學、生物醫(yī)學、食品科學、化學化工及環(huán)境科學領域得到了廣泛應用。新型載體材料的合成是今后固定化酶發(fā)展的一個非常重要的研究領域。本文主要介紹了固定化酶的載體，固定化技術以及在不同行業(yè)的應用，主要介紹了在污水處理和醫(yī)療行業(yè)的應用和發(fā)展趨勢。關鍵詞：固定化 載體 污水 醫(yī)療 應用酶是重要的生物催化劑，具有專一性強、催化效率高、無污染、反應條件溫和等特點，在制藥、食品、環(huán)保、釀造、能源等領域都得到了廣泛的應用。但在實際應用中，酶也存在許多不足，如大多數的酶在高溫、強酸、強堿和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活，不夠穩(wěn)定；與底物和產物混在一起，反應結束后，即使酶仍有很高的活力，也難于回收利用，這種一次性使用酶的方式，不僅使生產成本提高，而且難于連續(xù)化生產；并且分離純化困難，也會導致生產成本的提高等。固定化酶技術(Immobilized enzyme technology)克服了酶的上述不足。酶的固定化是指采用有機或無機固體材料作為載體，將酶包埋起來或束縛、限制于載體的表面和微孔中，使其仍具有催化活性，并可回收及重復使用的酶化學方法與技術。1.傳統(tǒng)酶固定化技術傳統(tǒng)酶的固定化方法可分為吸附法、共價偶聯法、交聯法和包埋法等4 種。吸附法是指通過載體表面和酶表面間的次級鍵相互作用而達到酶固定化的方法，根據吸附劑的特點又可分為物理吸附和離子交換吸附。該法具有操作簡便、條件溫和及吸附劑可反復使用等優(yōu)點，但也存在吸附力弱，易在不適pH、高鹽濃度、高底物濃度及高溫條件下解吸脫落的缺點。共價偶聯法是將酶的活性非必須側鏈基團與載體的功能基通過共價鍵結合，故表現出良好的穩(wěn)定性，有利于酶的連續(xù)使用，是目前應用和研究最為活躍的一類酶固定化方法，但共價偶聯反應容易使酶變性而失活。交聯法是利用雙功能或多功能基團試劑在酶分子之間交聯架橋固定化酶的方法，其更易使酶失活。包埋法包括網格包埋、微囊型包埋和脂質體包埋等，包埋法中因酶本身不參與化學結合反應，故可獲得較高的酶活力回收，其缺點是不適用于高分子量底物的傳質和用于柱反應系統(tǒng)，且常有擴散限制等問題。上述各種固定化酶的方法所表現出的不足之處限制了其廣泛應用，因此，設計和合成性能優(yōu)異的新型酶固定化材料，研制開發(fā)簡便、實用的固定化方法是目前固定化酶研究的重點之一。2.新型載體材料及固定化技術傳統(tǒng)酶的固定化方法雖在一定程度上可以增強生物催化劑的穩(wěn)定性，但增強幅度有待進一步提高，并且在此過程中，生物催化劑酶催化活力通常損失嚴重。運用當代高新技術設計合成新型載體以及兩者的有機結合是引人注目的研究動向。因此目前不斷地有新的載體和技術引入酶的固定化領域，如：無載體固定化、微波/超聲輔助的固定化、微膠囊固定化、電輔助固定化等，且固定化生物催化劑也越來越廣泛地應用于醫(yī)療、生物醫(yī)藥、環(huán)境保護、食品工業(yè)、化學工業(yè)、能源等領域。2.1 酶固定化過程中的新載體2.1.1介孔材料孔道的結構和尺寸對酶活力及穩(wěn)定性有著明顯的影響，在合適的孔道中酶固定化后其活力提高到游離酶的2倍，大孔道有利于固定化與催化過程中酶蛋白和底物、產物的傳輸，從而能提高酶的固定化和催化效果。目前，大孔道、高比表面積和孔容的新型介孔材料不斷被引入酶固定化領域，因為在大孔道、高比表面積、高孔容的介孔材料中酶的負載量大。2.1.2 納米管碳納米管是一種新型納米材料。它是由石墨片層卷曲而成的無縫納米管。將生物大分子，如氨基酸、蛋白質、酶、DNA 等結合在碳納米管的表面或端口上，可提高它在水溶液中的溶解度，為實現碳納米管的各種生物應用奠定了基礎。納米管的內表面與酶之間存在強烈的相互作用，從而使得管內酶蛋白結構穩(wěn)定且保留相當的催化活力，并且用其制成電極能夠有效實現底物氧化及電子的傳遞。硅納米管用于固定化酶時，能夠保持酶的活性，并且提高酶的熱穩(wěn)定性及對PH的耐受性。2.1.3 磁性高分子微球磁性高分子微球是由無機磁性納米粒子與有機高分子通過包埋法、單體聚合法合成的具有磁響應性和微球特性的粒子。通過共聚合和表面改性，磁性高分子微球表面可被賦予多種活性功能基團（如-OH、-COOH、-CHO等）。無機磁性納米粒子應用較多的是Fe3O4，單體聚合法主要包括乳液聚合、無皂乳液聚合、微乳液聚合、種子乳液聚合。磁性微球有良好的表面效應和體積效應，如比表面積較大，微球官能團密度較高，選擇性吸附能力較強，吸附平衡時間較短等。它的物理化學性質穩(wěn)定，具備一定的機械強度和化學穩(wěn)定性，能耐受一定濃度的酸堿溶液和微生物的降解，通過表面改性賦予多種活性的功能基團，這些功能基團可以連接生物活性物質。2.2新型固定化技術2.2.1 微波/超聲輔助固定化法微波是一種電磁波。微波加熱的主要原理是介質材料的極性分子在微波高頻電場的作用下反復快速取向轉動而摩擦生熱，從物質內部開始，瞬時達到需要的溫度。微波加熱具有許多傳統(tǒng)加熱不具備的優(yōu)點等。超聲波是指振動頻率大于20 kHz以上的一種縱波，在介質中傳播時，使介質發(fā)生物理和化學變化，從而產生一系列超聲效應，包括熱效應、機械效應、空化效應和化學效應。研究認為，超聲波對液體化學反應速度和產率的影響主要是由超聲波在液體介質中的空化作用引起的。超聲可使液體介質中形成微泡，其破裂伴隨能量的釋放，可以提高許多化學反應的速度。到目前為止，超聲波技術對物質提取，高分子降解，酶解反應等都有很好的促進作用。2.2.2無載體固定化法無載體固定化酶技術是通過將結晶酶、物理共沉淀的酶進行交聯形成固定化酶，包括交聯酶結晶（CLEC）、交聯酶聚集體（CLEA）。交聯酶聚集體技術是一種將蛋白質先沉淀后交聯形成不溶性的、穩(wěn)定的固定化酶，這種技術是通過基本純化的高濃度的蛋白質樣品的共價交聯來實現的。2.2.3微膠囊固定化法微膠囊是一種采用高分子聚合物或其他成膜材料將物質的微?；蛭⒌伟菜纬傻奈⑿∪萜?，其粒徑一般在微米至毫米級范圍，通常為5400m。將酶用微膠囊包覆后形成的微膠囊固定化酶，由于被催化物質和產物可自由通過囊壁,因而能起到酶催化劑的作用。 3.固定化酶的應用 3.1醫(yī)療行業(yè)的應用3.1.1 抗生素上應用 自20世紀70年代初，歐美國家已開始用特殊的合成樹脂固定化青霉素酞化酶來生產6 -APA5，但價格昂貴，酶活還較低。中國關于固定化青霉素酞化酶的研究工作起步較晚，還要靠進口價格昂貴的固定化載體或固定化青霉素酞化酶來滿足半合成青霉素生產的需要。用于生產內酞胺類抗生素中問體青霉素酞化酶在偏堿性環(huán)境下，可以催化青霉素G和頭抱菌素G水解，制備生產半合成p內酞胺類抗生素所需的中問體:6-氨基青霉烷酸(6 -A PA)和7氨基脫乙酞頭抱烷酸7(7 -ADCA )。傳統(tǒng)上多采用氧化反應酒旨化及擴環(huán)重排等化學反應來合成7- ADCA，但其過程存在著步驟多、反應條件要求高、成本高、三廢污染等問題，現在已逐漸被固定化方法所替代。3.1. 2 氨基酸上應用 氨基酸是蛋白質結構的基本單位，對維持機體蛋白質的動態(tài)平衡有極其重要的意義。自然界的天然蛋白質中存在20余種基本氨基酸，皆為L型，非基本氨基酸多為外消旋體，然而D型和L型對映體的生理作用迥異。氨基酸主要通過發(fā)酵法和合成法生產，D-氨基酸一般通過光學拆分得到。D-氨基?；咐闷淞Ⅲw專一性反應，從化學合成的底物生產具有光學活性的D -氨基酸 現在技術研究了利用基因重組工程技術構建高活性的氨基酞化酶工程菌連續(xù)拆分D, L蛋氨酸。氨基酞化酶工程菌經發(fā)酵收集高活性的菌體，通過海藻酸鈉包埋技術制備固定化酶，連續(xù)拆分D,L蛋氨酸，結果比酶活性大于6 000 u/g濕菌體，酶柱比酶活性大于4 000 u/g酶，半衰期20d,可連續(xù)拆分24d,拆分率達90%，收率達74.5%左右。隨著基因工程藥物和固定化技術的發(fā)展，人們對D氨基酸的需求日益增加，因此篩選具有高活力D氨基?；傅木?，并且建立起簡單快捷生產D氨基酸的方法有著廣闊的工業(yè)前景。3.1.3 酶制劑上應用 脂肪酶不僅能夠催化酷的水解反應，而且能在有機溶劑中催化醇和酸的酷合成反應酒旨交換反應、氨解反應馱合成反應等等?，F在技術以cM-纖維素為載體固定化脂肪酶的最適制備條件，固定化酶的酶學特性以及操作的穩(wěn)定性，結果表明本法制備得到的固定化酶酶活力較高，回收率也較高，最適溫度，pH都有了提高，穩(wěn)定性也提高了，酶和載體問的結合力較牢固。目前脂肪酶制造油化學品的重要障礙就是脂肪酶價格較高，而固定化酶具有可以回收、重復使用、穩(wěn)定性高產品質量高等優(yōu)點，所以脂肪酶的固定化技術可以在藥物制備、食品及輕工等方面廣泛應用。3.1.4藥物篩選上應用 藥物篩選就是對可能作為藥物的物質進行初步的藥理活性的檢測和試驗，以求發(fā)現其藥用價值和臨床用途，為發(fā)展新藥提供最初始的依據和資料。直到20世紀70年代中期，動物實驗一直是藥物篩選的主要方法，但動物實驗存在需時長、勞動強度大、操作技術要求高、受試樣品需要量大等缺點?，F代科技的發(fā)展為高效率的篩選藥物提供了技術條件，高通量藥物篩選技術 (HTS)就是將多種技術方法有機結合而形成的一種新的技術體系。 用于藥物篩選的膜蛋白微陣列，由于類脂環(huán)境影響膜蛋白的功能難以很好發(fā)揮，使微陣列制作有困難。最近微陣列技術取得了突破性進展，解決了膜和蛋白的固定化問題，發(fā)明了一種機械上穩(wěn)定又允許單個分了在固定化膜內移動的系統(tǒng)，這種水平方向流動性是生物膜的特性之一。3.1.5 手性藥物上應用 手性藥物的臨床意義已引起了人們的注意，并成為國際開發(fā)熱點，世界正在開發(fā)的1 200種新藥種有三分之一是手性藥物，同時手性藥物又是藥品開發(fā)中的難點，往往是一種對映體具有很大的藥用價值，而另一對映體沒有藥效，甚至對人體有毒害作用。如何從對映異構體中分離出有效成分或合成有效成分是目前面臨的一大課題。 手性藥物相互作用的研究也應用了固定化的方法。如應用親合色譜技術時，可以在色譜柱上固定化HAS15或AGP16來研究手性藥物發(fā)生在分布環(huán)節(jié)的相互作用，就是在流動相中添加并用藥物來考察并用藥物與對映體在分布環(huán)節(jié)有無相互作用。3.2食品行業(yè)固定化酶可應用于食品檢測。固定化酶技術的發(fā)展使生物傳感器也得到相當大的發(fā)展，它不僅使食品成分的高選擇性、快速、低成本分析測定成為可能，而且生物傳感器技術的持續(xù)發(fā)展將很快實現食品生產的在線質量控制，降低食品生產成本，并且可以保證安全可靠及高質量的食品生產。3.3生物傳感器方面在醫(yī)學領域，生物傳感器因快速、靈敏、專一、響應快等優(yōu)點發(fā)揮著越來越重要的作用。目前，在檢測多種細菌、病毒及其毒素等多個方面生物傳感器已有較廣泛應用。比如高精度血糖分析儀是采用固定化酶的生物傳感分析儀，其分析精度可以達到0.5%-2%，比家用保健類生物傳感器幾乎高一個數量級，比目前醫(yī)用生化分析儀的精度也高2%-3%，這在血糖分析領域是非常重要的。酶電極現已用于測定各種糖類、抗生素、氨基酸、有機酸、脂肪、醇類、胺類以及尿素、尿酸等的含量。3.4固定化細胞技術在廢水處理中的應用研究 3.4.1處理氨、氮廢水微生物去除氨氮需經過好氧硝化、厭氧（缺氧）反硝化兩個階段。硝化菌、脫氮菌的增殖速度慢，要想提高去除率，必須要較長的停留時間和較高的細菌濃度，采用固定化細胞技術可做到這點。固定化細胞技術在處理氨氮廢水中的主要優(yōu)勢在于可通過高濃度的固定細胞，提高硝化和反硝化速度，同時還可以使在反硝化過程低溫時易失活的反硝化菌保持較高的活性。3.4.2難降解有機廢水含酚廢水的處理普遍采用活性污泥法，但此法存在污泥產率較高，易產生污泥流失，處理效率低等缺點。固定化細胞對廢水中酚類等有毒物質的降解能力遠大于游離態(tài)細胞。用海藻酸鈉包埋對酚具有高效降解作用的小球藻細胞和紫色非硫光合細菌混合菌株，在好氧條件下處理含酚廢水，可以明顯提高除酚效率，縮短廢水停留時間，其共生體系對溫度、pH值適應范圍廣，對焦化廠工業(yè)廢水處理24h，去除率為95以上。3.4.3含芳香烴廢水利用固定化混合菌群可降解芳香烴廢水。固定化細胞能利用這些物質進行生長并使之完全降解，例如酚、奈和菲均能被徹底降解。與游離細胞相比，固定化細胞表現出生長穩(wěn)定，降解能力強的優(yōu)點。據報道用海藻酸鈣凝膠包埋固定化PinelohactersP細胞進行降解吡啶的研究，結果表明：與游離細胞相比，固定化細胞的比降解速率和對吡啶毒性的承受能力并沒有提高，但由于固定化細胞具有較高的生物濃度，所以其體積降解速率較高，而且可以重復利用，因此利用固定化細胞降解吡啶是可行的。3.4.4處理重金屬廢水由于微生物經固定化后，其穩(wěn)定性增加，抗生物毒性物質的能力也大大增加，因此，可以被廣泛地用于各種有機廢水中重金屬離子的去除。GeoffeyW等將小球藻固定在藻阮酸鹽中，用來聚集Co，Zn，Mn等金屬，在5h內62的Co，40的Mn，54的Zn被吸附；與之相比，在相同的條件下，懸浮細胞的吸附量要小得多。吳乾蓄等利用聚丙烯酸胺固定化酵母菌細胞去除電鍍廢水中的Cd2+，在pH=9，Cd2+的質量濃度為1400mgL時，反應lh，Cd2+的去除率98.9；采用未固定化細胞則去除率為37.6。分別用0.lmolL的HCI和0.lmolL的EDTA解吸，Cd2+的回收率為88.5和87.6。在環(huán)境監(jiān)測方面，固定化酶也可以用于測定有毒物質含量以進行環(huán)境監(jiān)測。在廢水處理中，固定化酶也越來越受科學家的關注。在水環(huán)境污染日益嚴重的今天，固定化酶的污水處理技術有著廣闊的研究潛力和應用前景。4.展望近幾年來，酶的固定化技術取得了長足的進步，并成為生物化學研究領域的重點和熱點。研究者不斷對傳統(tǒng)固定化技術進行改進，并開發(fā)新的固定化方法，一定程度上改善了一些酶的性能，包括穩(wěn)定性、催化活力、立體選擇性和回收再利用性能，他們用實踐證明了酶的固定化仍然是最好的改善酶的催化性能的手段。酶固定化技術已在食品工業(yè)、精細化學品工業(yè)、醫(yī)藥，尤其是手性化合物等行業(yè)得到廣泛應用，在廢水處理方面也取得了一定進展。用酶技術生產化工產品，條件溫和，無“三廢”產生，隨著人類對環(huán)保的日益關注，酶的固定化及應用研究已得到長足進展。然而，固定化酶研究具有的高新技術特征與基礎理論意義，仍使其處于國際學科前沿，具有很大的研究發(fā)展空間。設計和開發(fā)新的合成載體材料，利用和改性質優(yōu)價廉的天然高分子載體材料，探索和研究新的固定化技術將是這一領域的研究熱點。而固定化酶在各行業(yè)的應用研究也必將推動酶固定化技術的進一步發(fā)展參考文獻：【1】 李黎,馬力,李鶴.中國組織工程研究與臨床康。 【2】 李彥鋒, 李