技術(shù)的原理及應(yīng)用

PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 引物酶 引物酶 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 DNA聚合酶 DNA聚合酶 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 KaryB Mullis 1989年美國 Science 雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首 比喻1989年為PCR爆炸年 Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 生物樣品 DNA片段 基因診斷 基因治療 基因工程產(chǎn)品 法醫(yī)學(xué)檢測(cè) 人類學(xué)研究 基因組DNA 獲取特定DNA片段 擴(kuò)增特定DNA片段 DNA聚合酶 引物 引物 引物 引物 Mullis的構(gòu)思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 94 變性 50 65 退火 XX 延伸 94 55 37 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 酶活性 溫度 405060708090100 10080604020 72 94 55 PCR循環(huán) PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn) PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn) 重復(fù)1 3步25 30輪 目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈與引物復(fù)性 DNA變性形成2條單鏈 子鏈延伸DNA加倍 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn) 模板DNA PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn) 引物1 引物2 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn) 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn) 第1輪結(jié)束 第2輪開始 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn) Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn) 第2輪結(jié)束 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn) 模板DNA 第1輪擴(kuò)增 第2輪擴(kuò)增 第3輪擴(kuò)增 第4輪擴(kuò)增 第5輪擴(kuò)增 第6輪擴(kuò)增 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR在醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用 提綱 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán) 利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程 最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義 常規(guī)PCR技術(shù) 對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析 無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量 無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù) 利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化 通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析 如何對(duì)起始模板定量 通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析 三個(gè)概念 擴(kuò)增曲線 熒光閾值 Ct值 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 擴(kuò)增曲線 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 熒光閾值 熒光信號(hào)閾值 threshold 前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào) baseline 即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3 15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)差的10倍手動(dòng)設(shè)置 原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值 同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段 并且保證回歸系數(shù)大于0 99真正的信號(hào) 熒光信號(hào)超過域值 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 Ct值 Ct值的定義 PCR擴(kuò)增過程中 擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 Ct值的重現(xiàn)性 Ct值的特點(diǎn) 相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增 終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定 Ct值則極具重現(xiàn)性 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 定量原理 理想的PCR反應(yīng) X X0 2n非理想的PCR反應(yīng) X X0 1 Ex nn 擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X 第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0 初始模板量Ex 擴(kuò)增效率 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 定量原理 在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí) XCt X0 1 Ex Ct M 1 XCt 熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量 在閾值線設(shè)定以后 它是一個(gè)常數(shù) 我們?cè)O(shè)為M方程式 1 兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得 lgM lgX0 1 Ex Ct 2 整理方程式 2 得 lgX0 Ct lg 1 Ex lgM 3 Lg濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系 根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 標(biāo)準(zhǔn)曲線 模板DNA量越多 熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少 即Ct值越小 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系 通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)樣品Ct值 就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量 確定未知樣品的C t 值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C t 值推算出其初始量 Sample 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理絕對(duì)定量 提綱 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用 非特異性熒光標(biāo)記 1 SYBRGreen 特異性熒光標(biāo)記 2 TaqMan3 MolecularBeacon4 Amplisensor 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法1 SYBRGreen 法 SYBRGreen 法 SYBRGreen 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位 SYBRGreen 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時(shí) DNA雙鏈分開 無熒光復(fù)性和延伸時(shí) 形成雙鏈DNA SYBRGreen 發(fā)熒光 在此階段采集熒光信號(hào) 一般設(shè)置在復(fù)性階段 SYBRGreen 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析 將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo) dI dT Tm SYBRGreen 法融解曲線分析 Cyclenumber SYBRGreen 法定量原理 模板DNA量越多 熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少 Lg濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系 根據(jù)樣品Ct值 就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量 SYBRGreen 法 PCR反應(yīng)的建立 反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 SYBRGreen 使用濃度 太高抑制Taq酶活性 太低 熒光信號(hào)太弱 不易檢測(cè)Primer 引物的特異性高 否則擴(kuò)增有雜帶 定量不準(zhǔn)MgCl2的濃度 可以降低到1 5mM 以減少非特異性產(chǎn)物反應(yīng)Buffer體系的優(yōu)化反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù) 由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同 SYBRGreen 法應(yīng)用范圍 起始模板的測(cè)定基因型的分析融解曲線分析 可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件 對(duì)常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義 如對(duì)primer的評(píng)價(jià) 可以區(qū)分單一引物 引物二聚體 變異產(chǎn)物 多種產(chǎn)物 SYBRGreen 法優(yōu)缺點(diǎn) 本單位目前開展的工作 多種病原體定量和定性細(xì)胞因子檢測(cè) 人 小鼠 大鼠等 基因表達(dá)水平檢測(cè)PCR芯片 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法2 TaqMan法 TaqMan 水解型雜交探針 5 端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán) Reporter R 如FAM VIC等3 端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) Quencher Q 探針完整 R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 無熒光 R與Q分開 發(fā)熒光 熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理 FRET Taq酶有5 3 外切核酸酶活性 可水解探針 TaqMan法工作原理 每擴(kuò)增一條DNA分子 釋放一個(gè)熒光信號(hào) 可以在循環(huán)過程中任一點(diǎn)檢測(cè)熒光 TaqMan法PCR反應(yīng)的建立 1 引物 探針的設(shè)計(jì) 探針Tm為68 70 30bp 5 不能有G G可能會(huì)淬滅熒光素 引物盡量靠近探針 擴(kuò)增片段 400bp 引物Tm為59 60 2 反應(yīng)參數(shù)的確定 一般為 94 10 20S60 30 60S Taq酶5 3 外切核酸酶活性在60 最高 也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度72 45S 3 優(yōu)化引物和探針濃度 獲得最小Ct值 最大信號(hào) 背景比值引物濃度 50 900nM探針濃度 50 250nM4 其他與常規(guī)PCR相同 已肝病人血液中HBV的絕對(duì)定量目的 利用核酸檢測(cè) 縮短檢驗(yàn)時(shí)間 提高靈敏度 為診斷用藥提供依據(jù)方法 從血液中提取病毒DNA 擴(kuò)增病毒基因 以TaqMan探針進(jìn)行檢測(cè)設(shè)置對(duì)照 濃度為106 105 104 103的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè) 設(shè)陰性和空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)步驟 提取HBVDNA設(shè)計(jì)特異引物設(shè)計(jì)TaqMan探針并標(biāo)記探針擴(kuò)增程序結(jié)果 獲取血液樣品中HBVDNA的精確copy數(shù) 利用TaqMan法檢測(cè)血液中的HBV 數(shù)據(jù)分析 分析結(jié)果 HBVDNA的精確copy數(shù)為3 7X105 利用TaqMan法檢測(cè)血液中的HBV sample sample TaqMan法應(yīng)用范圍 起始模板的定量基因型分析產(chǎn)物鑒定單核苷酸多態(tài)性分析 singlenucleotidepolymorphism SNP TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法3 Molecularbeacon法 分子信標(biāo) 標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對(duì)序列組成 發(fā)夾型雜交探針 Molecularbeacon 分子信標(biāo) 工作原理 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 FRET 探針與DNA雜交時(shí)產(chǎn)生熒光 延伸過程 不產(chǎn)生熒光 退火過程 產(chǎn)生特異性熒光 檢測(cè)熒光信號(hào) Molecularbeacon 分子信標(biāo) 應(yīng)用范圍 起始模板的定量基因型分析產(chǎn)物鑒定SNP分析 Molecularbeacon 分子信標(biāo) 優(yōu)缺點(diǎn) 幾種方法總結(jié) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理 絕對(duì)定量與相對(duì)定量 絕對(duì)定量與相對(duì)定量 絕對(duì)定量 精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板濃度 DNA RNA 病毒DNA或RNA的拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量 計(jì)算初始反應(yīng)模板的相對(duì)含量差異表達(dá)分析芯片評(píng)估轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)基因型檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR絕對(duì)定量方法 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)曲線已知濃度的相應(yīng)DNA模板 按不同濃度稀釋根據(jù)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)得到相應(yīng)的C t 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)得到未知濃度樣品的C t 值 使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行絕對(duì)定量的優(yōu)勢(shì) 敏感性高檢測(cè)低拷貝數(shù)樣品 單拷貝區(qū)分小差異樣品 24 48 96 大范圍拷貝數(shù)樣品同時(shí)檢測(cè)100 1010省時(shí)有效 實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量 相對(duì)定量的目的比較基因在不同情況下的表達(dá)差異 倍數(shù)關(guān)系 相對(duì)定量的問題解決樣品材料不均一造成的差別解決加樣過程中的差別內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)通常是b actin GAPDH基因等看家基因它們?cè)诩?xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定 受環(huán)境因素影響較小對(duì)目的基因進(jìn)行均一化 目的基因拷貝 每一個(gè)內(nèi)標(biāo)基因拷貝 提綱 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法標(biāo)準(zhǔn)樣品 相對(duì)定量中的內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)通常是 actin GAPDH基因等看家基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定 受環(huán)境因素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量 絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品 已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)錄的RNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA拷貝數(shù) 用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品如何設(shè)定 含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的cDNA紫外分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)測(cè)定濃度根據(jù)質(zhì)?；騝DNA分子量換算成拷貝數(shù) 做系列稀釋 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法定量方法 絕對(duì)定量檢測(cè)起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù) 通常用到標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量確定經(jīng)過不同處理的樣本目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間基因的表達(dá)差異 不同時(shí)相 2 C t 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法 TaqMan法舉例標(biāo)記探針 使用TaqMan探針進(jìn)行雙通道熒光定量 Fam標(biāo)記目標(biāo)基因探針VIC標(biāo)記看家基因探針 TaqMan法舉例材料準(zhǔn)備 從正常乳腺組織中提取的總RNA從乳腺癌組織中提取的總RNA含ERBB2andGAPDH的質(zhì)粒用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線ControlsnoRNA 陰性對(duì)照RNA noreversetranscriptase 基因組對(duì)照 TaqMan法舉例反應(yīng)程序 RT qPCR反應(yīng)程序 TaqMan法舉例癥標(biāo)記物表達(dá) Color2 VICdetectionforGAPDH Color1 FAMdetectionforERBB2 TaqMan法舉例實(shí)驗(yàn)結(jié)果定量 Copiesng lTotalRNA TaqMan法舉例實(shí)驗(yàn)結(jié)果定量分析 ERBB2copies GAPDHcopies