常用標(biāo)本制備技術(shù).doc

常用標(biāo)本制備技術(shù)一、常用光鏡標(biāo)本制備技術(shù)1.切片標(biāo)本的制備：常用的切片方法為石蠟切片，其制備程序如下：取材 從動(dòng)物身體割取所需的新鮮組織一小塊（厚度約0.5厘米）。手術(shù)愈快愈好，以防組織的死后變化。固定 把切取的小塊組織，迅速投入預(yù)先配好的固定液如10%福爾馬林、0.5%鋨酸、包氏液、岑克氏液、卡氏等固定液中固定，使組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)變性，組織塊硬化，以保存組織細(xì)胞原有的形態(tài)。沖洗（洗滌） 組織塊自固定液取出后，須經(jīng)流水沖洗或乙醇洗滌，使組織中含有的固定液全部除去，直至洗凈為止。脫水 脫水的目的在于除去組織中的水分。因?yàn)榻M織中的水分和石蠟是不相溶的，為不使組織塊在脫水時(shí)產(chǎn)生收縮，所以一定要經(jīng)過各級(jí)濃度的脫水劑（如乙醇等）將水分脫凈。透明 組織塊脫水后，須經(jīng)既可和乙醇相混，亦可作石蠟溶劑的透明劑（如二甲苯）透明，使組織中的乙醇被透明劑所替代，才能浸蠟包埋。浸蠟 浸蠟是將包埋劑（石蠟）透入整個(gè)組織的過程。石蠟透入組織需要一定的溫度（石蠟熔點(diǎn)）。所以浸蠟都在恒溫箱中進(jìn)行。包埋 制備一定形狀的容器（如紙盒等），倒入熔化的石蠟，迅速夾取浸透石蠟的組織塊放入盒內(nèi)，待表面石蠟?zāi)毯罅⒓磳⑷萜魍度胨?，使它凝固成蠟塊。切片 組織塊經(jīng)上述處理后，不僅變硬，且有石蠟支撐，可用切片機(jī)將包埋組織的蠟塊切成薄片，一般厚度是58微米。貼片 把由切片機(jī)切下的蠟條，分割成小段，分別排放于滴有蒸餾水的載玻片上，在展片臺(tái)上微熱，使皺褶的蠟片伸展平正。烘片 把貼有蠟片的載玻片置于45恒溫箱中，烘烤34小時(shí)，使切片干燥。脫蠟與復(fù)水 組織切片的脫蠟等過程是在染色缸中進(jìn)行的，因此須預(yù)先準(zhǔn)備潔凈的染色缸，并分別放入二甲苯、各級(jí)濃度的乙醇及染料溶液，按順序貼好標(biāo)簽。染色前須先進(jìn)行脫蠟和復(fù)水，即用二甲苯溶去切片上的石蠟后再經(jīng)各級(jí)濃度乙醇（自高濃度到低濃度）下行到水的過程。因?yàn)闆]有經(jīng)過復(fù)水處理的切片不能用水溶性染料染色，所以在染色前必須再度復(fù)水。脫蠟與復(fù)水的步驟如下：切片浸入二甲苯310分鐘二甲苯+純乙醇（1：1）純乙醇95%乙醇80%乙醇70%乙醇50%乙醇（以上每級(jí)乙醇停留的時(shí)間約25分鐘）蒸餾水2分鐘。染色 切片染色以后可增加組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的對(duì)比度。常用的生物染料是蘇木素和伊紅，簡稱H.E.染色。蘇木素是一種堿性染料，經(jīng)蘇木素染色的結(jié)構(gòu)呈藍(lán)紫色（如細(xì)胞核）。組織中可被堿性染料著色的結(jié)構(gòu)稱嗜堿性。伊紅是一種酸性染料，被伊紅染色的結(jié)構(gòu)呈紅色或粉紅色（如細(xì)胞質(zhì)）?？杀凰嵝匀玖现慕Y(jié)構(gòu)稱嗜酸性。H.E.染色的程序如下：將已浸入水中的切片取出放入蘇木素染液510分鐘自來水洗2分鐘0.5%鹽酸水分色數(shù)秒種（在顯微鏡下檢查核褪至淺紅色，細(xì)胞質(zhì)及結(jié)締組織近無色）蒸餾水1分鐘0.1%氨水（藍(lán)化）1分鐘自來水沖洗510分鐘蒸餾水1分鐘50%乙醇70%乙醇80%乙醇90%乙醇（以上每級(jí)乙醇停留的時(shí)間約25分鐘）0.5%伊紅（95%乙醇溶液）25分鐘95%乙醇分色（在顯微鏡下檢查核呈藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)及結(jié)締組織呈粉紅色）95%乙醇輕洗（洗凈玻片上剩余的伊紅染液）。脫水 已染色的組織切片，為了長久保存，又須再經(jīng)各級(jí)濃度的乙醇脫水。即將上述已被染色的組織切片依次放入95%乙醇1分鐘純乙醇（I）1分鐘純乙醇（）25分鐘。透明 透明的目的是除去組織切片中的乙醇，因組織中的乙醇不與樹膠相溶，所以必須用透明劑除去乙醇后才能封藏。即將上述已脫水的組織切片依次放入二甲苯+純乙醇（1：1）25分鐘二甲苯（I）25分鐘二甲苯（）25分鐘。封固 在切片上滴加中性樹膠，用蓋玻片進(jìn)行封固，保存?zhèn)溆?。機(jī)體內(nèi)有些結(jié)構(gòu)成分，需經(jīng)硝酸銀處理（鍍銀或銀染）時(shí)可使硝酸銀還原，形成銀的微粒附著在組織結(jié)構(gòu)上，呈棕黑色，稱這種性質(zhì)為親銀性。有些組織結(jié)構(gòu)本身不能使硝酸銀還原，需加還原劑使硝酸銀還原，稱此為嗜銀性。此外，為了顯示某些特殊結(jié)構(gòu)成分，還可應(yīng)用各種特殊染色方法，如雷鎖辛品紅染色液顯示彈性纖維等。在制作較硬組織（如骨組織等）或較大組織器官（如眼球）等切片，為了減輕因石蠟包埋所產(chǎn)生的收縮，可用火棉膠（celloidin）代替石蠟進(jìn)行浸透包埋，再進(jìn)行切片染色。為了較好地保存細(xì)胞內(nèi)的酶活性，可選用冷凍切片。它是將組織在低溫條件下快速凍結(jié)，直接切片，進(jìn)行染色。2、涂片、鋪片、磨片標(biāo)本的制備：血液等液體材料，可直接在玻片上涂片，干燥后再進(jìn)行固定和染色。疏松結(jié)締組織和腸系膜等薄層組織，可在玻片上撕開展平，制成鋪片，待干燥后進(jìn)行固定和染色。骨和牙等堅(jiān)硬組織除用酸（如稀硝酸等）脫鈣后再按常規(guī)制成切片處，還可直接研磨成薄的磨片進(jìn)行染色觀察。二、大體解剖技術(shù)操作規(guī)程及其注意事項(xiàng)（一）大體解剖標(biāo)本的收集與防腐固定處理 1、收集標(biāo)本時(shí)，須登記死者的死亡原因、性別、年齡等，辦妥自愿捐獻(xiàn)手續(xù)、家屬簽字等手續(xù)，免留后患。若系無主尸體亦須在公安、保衛(wèi)部門辦妥有關(guān)手續(xù)。2、進(jìn)行消毒處理，避免傳染病蔓延。3、進(jìn)行固定防腐注射，配制5%10%的甲醛溶液作頸總動(dòng)脈與股動(dòng)脈灌注，按照標(biāo)本大小選擇注射劑量。如注射溶液過濃，解剖時(shí)容易造成肌纖維及血管斷裂，過淡時(shí)標(biāo)本容易腐敗。溫度高時(shí)注射5%左右溶液，溫度低時(shí)注射10%左右溶液。根據(jù)季節(jié)氣溫的不同在5%10%之間浮動(dòng)。4、注射完后標(biāo)本在注射臺(tái)上保留一到兩天，使其毛細(xì)血管中溶液滲均勻，再行放入3%5%的甲醛溶液中保存。5、每具標(biāo)本注射后必須在尸池中浸泡六個(gè)月后，方可進(jìn)行大體解剖，如解剖過早則不易保存。6、若收集標(biāo)本須作鑄型標(biāo)本用，宜將標(biāo)本即時(shí)放血，取材越新鮮越好。剩余部分作局部注射保存。若作關(guān)節(jié)韌帶等標(biāo)本，取材后馬上將肌肉等及時(shí)剝離，以防腐敗發(fā)臭。收集腐敗標(biāo)本后可作沙埋腐蝕后取骨架為標(biāo)本。（二）大體標(biāo)本解剖1、將收集保存六個(gè)月以上的標(biāo)本撈出、沖洗后，放入尸體臺(tái)即可進(jìn)行解剖。2、解剖前必須將鑷、鉗、剪、刀等工具準(zhǔn)備完好，方可動(dòng)手操作。視其操作部位，必須熟悉所作部位解剖層次結(jié)構(gòu)，用圓刀切開皮膚并剝離之，用尖刀或剪等修潔神經(jīng)、血管、肌肉等結(jié)構(gòu)。大體標(biāo)本制作之關(guān)鍵在于熟悉層次結(jié)構(gòu)和熟練的操作技巧。否則易切斷或破壞相關(guān)結(jié)構(gòu)，且制作的標(biāo)本不美觀。若作系解教學(xué)標(biāo)本宜采取兩側(cè)分別以深、淺層制作。完成后放入本院配制之保存液中待用。（三）特殊標(biāo)本制作1、鑄型標(biāo)本（1）根據(jù)所取材料，按需要處理。（2）配制好鑄型劑并加不同染料（一般示紅色動(dòng)脈，示靜脈藍(lán)色，示膽道綠色，示神經(jīng)黃色等）。（3）分別采取不同腐蝕法，腐蝕后沖洗，裝瓶保存。2、包埋標(biāo)本（1）取出所需材料修潔涼干（有條件可抽空包埋）。（2）按需要選擇好包埋材料。（3）包埋造型。3、陳列標(biāo)本制作（1）按要求進(jìn)行標(biāo)本取材。（2）修潔、涂色。（3）裝瓶、保存（若標(biāo)本上涂色彩，不宜保存在本院配方的保存液中，以防脫色，仍須保留在5%10%的甲醛溶液中）。三、人體骨骼標(biāo)本雙氧水法制作（一）目的利用局解后的廢舊材料制作人體骨骼標(biāo)本（二）材料經(jīng)防腐固定的局解后尸體標(biāo)本、工業(yè)用雙氧水、汽油和帶蓋標(biāo)本箱。（三）方法1、取材：取骨質(zhì)無損的標(biāo)本，整體的或局部的均可。 2、軟組織處理：將大塊軟組織包括筋膜、肌肉、內(nèi)臟、腦等除掉后，常溫下浸入5%-10%的雙 氧水中，利用雙氧水放氧產(chǎn)生氣泡的機(jī)械作用使軟組織松動(dòng)，15-30天后取出，用清水沖洗后將骨膜撕掉，但韌帶、關(guān)節(jié)囊、軟骨、肌腱、骨間膜等可按需修潔保留（如做散的骨標(biāo)本，則可將這些軟組織很容易地清除掉）。 3、脫脂：將上述材料涼干后入汽油中脫脂4個(gè)月。注意材料要干燥，容器要密封，中途更換1次汽油即可。 4、清潔和保存：將脫脂后的材料置通風(fēng)處讓汽油揮發(fā)，然后浸入1%的洗衣粉內(nèi)將表面的油漬洗凈，再用清水沖洗干凈。之后，置陰涼干燥處風(fēng)干（為防止肋骨縮水變形，可用木條或有機(jī)玻璃支撐固定，待干后拆掉），涂刷清漆兩遍即可保存。（四）結(jié)果及評(píng)價(jià)制作出的骨骼標(biāo)本潔凈美觀，結(jié)構(gòu)完整，骨的連結(jié)自然真實(shí)，骨間膜、椎間盤、肋軟骨、恥骨間盤、韌帶、關(guān)節(jié)囊、關(guān)節(jié)軟骨等牢固地與骨連結(jié)在一起，胸廓，骨盆，脊椎等完全保持了其本來形態(tài)。采用雙氧水浸泡處理軟組織，有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）雙氧水放氧產(chǎn)生氧泡的物理作用使與骨結(jié)合緊密的軟組織松動(dòng)，與骨較易分離，而干燥后這些軟組織與骨的結(jié)合又變得緊密牢固了。（2）經(jīng)雙氧水浸泡后骨標(biāo)本脫脂效果很好。（3）低濃度的雙氧水對(duì)骨質(zhì)的腐蝕性小，在常溫下進(jìn)行，處理的時(shí)間容易控制。四、辣根過氧化物酶（HRP）法操作規(guī)程（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康奶接懩骋会樉难ㄎ粎^(qū)傳入神經(jīng)元的節(jié)段性分布。（二）藥品和試劑HRP：Sigma Type IV RZ：3.2硝普鈉（廣州化學(xué)試劑廠）聯(lián)大茴香胺（北京化學(xué)試劑廠）過氧化氫（上海桃浦化工廠）（三）儀器設(shè)備與材料100ml量筒、分析天平、500ml量筒、1000ml燒杯、2000ml燒杯、家免飼養(yǎng)籠、50l微量注 射器、精密試紙、普通光學(xué)顯微鏡，等。四）實(shí)驗(yàn)對(duì)象本院動(dòng)物室提供的家兔，體重200020g。（五）實(shí)驗(yàn)環(huán)境室溫1825，相對(duì)濕度60%75%。（六）操作步驟1主要溶液的制備（1）20%HRP液20l、HRP粉末5mg加20l生理鹽水即此液。（2）2%多聚甲醛加1.25%戊二醛0.1M磷酸緩沖液（PH7.4）。0.1M磷酸緩沖液的制備：液：NaH2PO4H2O 27.6g加蒸餾水稀釋至1000ml。液：Na2HPO412H2O 71.6g加蒸餾水稀釋至1000ml.取液190ml、液810ml混合后加蒸餾水稀釋至2000ml即得0.1M磷酸緩沖液（PH7.4）。2%多聚甲醛0.1M磷酸緩沖液的制備:20g多聚甲醛加0.1M磷酸緩沖至1000ml即得此液。2%多聚甲醛1.25%戊二醛0.1M磷酸緩沖液的制備:25%戊二醛50ml溶液加2%多聚甲醛0.1M磷酸緩沖液至1000ml即得。（3）Tris液的配制取3.6ml冰醋酸加蒸餾水至300ml。取4.08g無水醋酸鈉加蒸餾水至150ml。取上液279ml和上液126ml混合，即為Tris液。混合后用精密試紙測(cè)其PH為4.4則可用。（4）O-D法中有關(guān)溶液配制A液的配制 取0.1MTris液10ml、0.2%明明膠液50ml、硝普鈉200mg加蒸餾水至100ml、聯(lián)大茴香胺80mg加蒸餾水至40ml、1.5%H2O20.8ml混合即得A液。B液的配制 取0.1Mtris液10ml、0.2%明膠液50ml、硝普鈉8g、蒸餾水140ml混合即得B液。C液的配制 取0.1Mtris液20ml、0.2%明膠液100ml、蒸餾水280ml混合即可得C液。2定穴及針入深度：根據(jù)針灸學(xué)1、獸醫(yī)針灸手冊(cè)2確定。3動(dòng)物分組、麻醉及HRP引入方式：將實(shí)驗(yàn)用家兔隨機(jī)分成5組，即穴區(qū)組神經(jīng)干組、切斷神經(jīng)組、切斷血管組和空白對(duì)照組。用2%戊巴比妥納、接40mg/kg體重，進(jìn)行腹腔麻醉。穴區(qū)組、切斷神經(jīng)組、切斷血管組，均在家兔某一目標(biāo)穴區(qū)直接注射20%HRP液20l，神經(jīng)干組在家兔目標(biāo)穴區(qū)下神經(jīng)干內(nèi)注射20%HRP液20l，空白對(duì)照組則在家兔目標(biāo)穴區(qū)直接注射20l生理鹽水。4動(dòng)物灌注：注射后45天進(jìn)行，開胸經(jīng)左心室升主動(dòng)脈插管，同時(shí)剪開右心耳灌注如下藥液：（1）04檸檬酸鈉速灌300ml。（2）04生理鹽水速灌1000ml。（3）04 2%多聚甲醛1.25%戊二醛0.1M磷酸緩沖液1000ml。前300ml速灌。后700ml緩慢滴入。全過程約40分鐘。（4）04 10%蔗糖0.1M磷酸緩沖液800ml。前300ml速灌。后500ml緩慢滴入。約30分鐘。5取材：取出兩側(cè)相應(yīng)節(jié)段（據(jù)大體解剖學(xué)而定）全部脊神經(jīng)節(jié)，并放入10%蔗糖0.1M磷酸緩沖液內(nèi)。置冰箱內(nèi)過夜。6冰凍切片 厚4050微米，并收集于0.1M磷酸緩沖液中。7成色反應(yīng)（O-D法，有關(guān)A液、B液、C液配制見上）（1）04蒸餾水沖洗切片三次。（2）放入A液30分鐘（置冰箱）。（3）04蒸餾沖洗切片三次。（4）放入B液30分鐘（置冰箱）。（5）04蒸餾水沖洗切片三次。（6）放入C液中（置冰箱）。8蛋白甘油貼片91%中性紅復(fù)染，脫水透明，最后中性樹膠封片，光鏡下觀察。（七）實(shí)驗(yàn)結(jié)果及評(píng)價(jià)（以“上巨虛”穴區(qū)為例）1未注射側(cè)的情況：所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在未注射側(cè)的切片上，各脊神經(jīng)節(jié)都未出現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞。2五組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在脊神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞的情況（1）穴區(qū)組 在切片上，可見注射側(cè)脊神經(jīng)節(jié)L4S2節(jié)段中都出現(xiàn)了標(biāo)記細(xì)胞，以L7S2節(jié)段的標(biāo)記細(xì)胞為最多。占總數(shù)的83%，其次為L2、L5、L4節(jié)段。腰段以L7為最多，占總數(shù)的40%；骶段以S1為最多，占總數(shù)的26%。其它各節(jié)段都未出現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞。（2）神經(jīng)干組 在切片上，可見注射側(cè)在脊神經(jīng)節(jié)L1S3節(jié)段中出現(xiàn)了標(biāo)記細(xì)胞。以L7S2節(jié)段的標(biāo)記細(xì)胞為最多。占總數(shù)的68.2%，其次為L5、L4、L3、S3、L2、L1、腰段以L7為最多，占總數(shù)31.3%。段以S1為最多，占總數(shù)的21%。其它各節(jié)段都未出現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞。（3）切斷神經(jīng)組、空白對(duì)照組 在切片上各脊神經(jīng)節(jié)都未出現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞。（4）切斷血管組 在切片上可見注射側(cè)脊神經(jīng)節(jié)L4S2節(jié)段中都出現(xiàn)了標(biāo)記細(xì)胞，以L7S2為最多。占總數(shù)的76.9%，其次是L6、L5、和L4。腰段以L7節(jié)段為最多。占總數(shù)的31.7%，骶段以S1節(jié)段為最多，占總數(shù)的2.4%。其它各節(jié)段都未出現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞。3大、中、小三型標(biāo)記細(xì)胞在脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)出現(xiàn)的情況本實(shí)驗(yàn)用Leitz測(cè)微尺測(cè)定實(shí)驗(yàn)中所有出現(xiàn)細(xì)胞的大小，其穴區(qū)組、神經(jīng)干組、切斷血管組都能見到大、中、小三型標(biāo)記細(xì)胞，且都以中、小型細(xì)胞為主，各占